Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В целях метаболомного фенотипирования сформирована репрезентативная выборка биообразцов 300 пациентов-участников одномоментного эпидемиологического исследования (образцы сыворотки крови, мочи). Выборку составили взрослые индивиды в возрасте 18-65 лет, жители эндемичного региона по инвазии Opisthorchis felineus и индивиды, не имеющие гельминтной инвазии. Проведена рандомизация и пробоподготовка образцов (моча, кровь) полученных от 300 индивидов, включенных в исследование для проведения метаболомного анализа, и проведена ЯМР спектроскопия 300 образцов мочи и 300 образцов крови. Проведена оценка влияния описторхозной инвазии на композицию желчных кислот в желчи у человека. Выполнен метаболомный анализ образцов пузырной желчи. Разработан метод проподготовки желчи для масс-спектрометрического анализа, включая анализ полноты экстрагирования, и проведен количественный анализ желчных кислот (холевая кислота, хенодезоксихолевая кислота, дезоксихолевая кислота, урсодезоксихолевая кислота, таурохолевая кислота, таурохенодезоксихолевая кислота, гликохолевая кислота, гликохенодезоксихолевая кислота) в образцах желчи человека. В результате было показано, что инвазия O. felineus, также как и другие включенные в модель факторы (возраст, рост, индекс массы тела и пол) индивидов не оказывают статистически достоверного вклада в вариабельность метаболического состава желчи. Выполнено исследования метаболических изменений при экспериментальном описторхозе на сроке инвазии 5 недель на двух группах золотистых хомяков (Mesocricetus auratus): животных с инвазией O. felineus и контрольной группе интактных животных (группы сформированы с соотношением самцы:самки равным 1:1). У экспериментальных животных выполнена оценка экспрессии ключевых генов обмена глюкозы и липидов, проведен биохимический анализ сыворотки крови и ткани печени. Исследованы скорость глюконеогенеза (пируват-толератный тест) и секреция триацилглицеролов (в эксперименте с Тритоном WR1339) и холестерола печенью. Оценка влияния инвазии на экспрессию генов, играющих ключевую роль в метаболизме глюкозы, показала, что при острой описторхозной инвазии в печени наблюдается снижение экспрессии генов Aco1 (аконитазы), Gys2 (гликогенсинтазы), Pc (пируваткарбоксилазы), Pklr (пируваткиназы), Pck1 (фосфоенолпируваткарбоксикиназы), Fbp1 (фруктозо-1,6-фосфатазы). В результате анализа экспрессии генов обмена липидов показано, что при описторхозе происходит снижение экспрессии генов Abcg5 и ApoE и повышение экспрессии гена Hmgcr. Исследования активности ферментов в ткани печени показали достоверное снижение ферментативной активности пируваткарбоксилазы и цис-аконитазы у инвазированных животных по сравнению с активностью данных ферментов у интактных хомяков, тогда как активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы возрастала у инвазированных O. felineus животных. Активность глюкокиназы возрастала в печени инвазированных самок, тогда как в подгруппе самцов, несмотря на тенденцию к повышению, достоверность различий в активности фермента между контрольной и инвазированной группами не достигалась. Уровень кортизола и кортикостерона, измеренный методом ИФА, в сыворотке интактных и инвазированных, животных не отличался. Результаты исследования содержания высокоэнергетических фосфатов в ткани печени, показали, что на данной стадии инвазии энергетический статус печени инвазированных животных поддерживается на нормальном уровне. Однако описторхозная инвазия приводит к подавлению экспрессии АМФ-зависимой протеинкиназы, а также снижению содержания ее фосфорилированной формы в печени. На основании полученных данных установлено, что через 5 недель описторхозной инвазии у экспериментальных животных наблюдается изменение метаболизма глюкозы и липидов, а также снижение экспрессии АМФ-зависимой протеинкиназы, играющей важную роль в регуляции метаболизма. Данные об изменении экспрессии и активности ферментов обмена глюкозы в печени инвазированных в течение 5 недель животных позволяют сделать вывод о ингибировании цикла трикарбоновых кислот и глюконеогенеза, усилению анаэробного гликолиза, и, соответственно, повышению скорости распада глюкозы и продукции глюкозо-6-фосфата. Образующийся глюкозо-6-фосфат метаболизирует как по гликолитическому пути, так и поступает в пентозофосфатный цикл, что способствует регенерации NADPH, необходимого для синтеза холестерола. Усиление гликолиза в свою очередь будет приводить к закислению межклеточного вещества и способствовать развитию окислительного стресса. Снижение активности ЦТК может способствовать перераспределению ацетил-Ко А на синтез холестерола. Предположение об усилении синтеза холестерола, хорошо согласуется с данными о повышении активности ГМГ-КоА-редуктазы в ткани печени инвазированных животных. Нарушение липидного обмена при остром описторхозе, приводит к повышению ЛПНП, холестерола и триацилглицеридов в крови, и обусловлено снижением обратного захвата ЛППП печенью, тогда как изменения секреции триацилглицеридов и холестерола печенью не происходит

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения работ в отчетном году проведено 7 серий экспериментов для исследования метаболических изменений при экспериментальном описторхозе на сроке инвазии 20 недель на двух группах золотистых хомяков (Mesocricetus auratus): животных с инвазией O. felineus и контрольной группе интактных животных, группы сформированы с соотношением самцы:самки равным 1:1. У экспериментальных животных выполнена оценка экспрессии ключевых генов обмена глюкозы и липидов, проведен биохимический анализ сыворотки крови и ткани печени, в том числе определено содержание высокоэнергетических фосфатов в ткани печени экспериментальных животных методом ВЭЖХ. Исследованы скорость глюконеогенеза (пируват-толератный тест), секреция триацилглицеролов (в эксперименте с тритоном WR1339) печенью, а также определено суточное выведение холестерола и желчных кислот с фекалиями. С использованием С13 меченых соединений методом ГХ-МС исследована скорость синтеза белка и холестерола у экспериментальных животных на двух сроках инвазии - 5 и 20 недель. Биохимический анализ крови инвазированных животных: повышение активности АЛТ, концентрации желчных кислот и билирубина в сыворотке, - свидетельствует о выраженном повреждении печени и желчевыводящих путей животных при хроническом описторхозе. Оценка влияния инвазии на экспрессию генов, показала, что при хроническом описторхозе в печени наблюдается повышение экспрессии генов g6pd, hk1, hmgcr. Исследования активности ферментов в ткани печени показали достоверное снижение ферментативной активности пируваткарбоксилазы и цис-аконитазы у инвазированных животных по сравнению с активностью данных ферментов у интактных хомяков, тогда как активность гексокиназы, пируваткиназы и лактатдегидрогеназы возрастала у инвазированных O. felineus животных. Уровень кортизола и кортикостерона, измеренный методом ИФА, в сыворотке интактных и инвазированных, животных не отличался. Результаты измерения содержания высокоэнергетических фосфатов в ткани печени, показали, что на данной стадии инвазии энергетический статус печени инвазированных животных снижен, что отражается в уменьшении содержания АТФ. Согласно данным вестерн-блот анализа, у инвазированных в течение 20 недель хомяков наблюдали статистически достоверное снижение содержания AMPK в печени. На фоне хронической инвазии изменения скорости синтеза холестерола не наблюдали, тогда как скорость биосинтеза белка была снижена. Нами не было установлено каких-либо изменений секреторной функции печени, тогда как наблюдаемое повышение содержания холестерина в ЛПВП и ЛПНП сыворотки крови инвазированных животных вероятно обусловлено снижением обратного захвата липопротеинов печенью. Таким образом, на хронической стадии развития описторхозной инвазии в эксперименте наблюдаются глубокие метаболические изменения в печени, характеризующиеся усилением гликолитического расщепления глюкозы, снижением энергетического потенциала и функциональной активности печени, сопровождающиеся дисбалансом обмена липидов с нарушением регуляции по принципу обратной связи. Выполнен описательный анализ метаболомных данных мочи и сыворотки 300 пациентов-участников одномоментного эпидемиологического исследования, в том числе проведены количественная оценка аннотированных метаболитов с помощью пакета Chenomx NMR suit, статистический и биоинформатический анализ метаболомных данных. Характерные метаболические паттерны выявлены за счет комбинирования задаваемых и автоматических методов многофакторного моделирования, моделирования на основе контекста и многоуровневого анализа. Анализ данных реализован в среде R (http://www.r-project.org/). В результате аннотации метаболитов, показана ассоциация наличия описторхозной инвазии с содержанием в моче бетаина и неаннотированного метаболита со спектральными характеристиками 10.2 ppm. Предположено, что данный метаболит является продуктом жизнедеятельности гельминта, в связи с чем отсутствует в существующих базах данных. Показано, что метаболический состав мочи может быть использован для неинвазивной скрининговой диагностики описторхоза у пациентов.