КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 14-15-00268
НазваниеИзучение механизмов действия диаденозиновых полифосфатов на сократительную, биоэлектрическую активность сердца, а также выяснение их роли в нервном контроле работы сердца
РуководительАбрамочкин Денис Валерьевич, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2017 г. - 2018 г. |
Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-104 - Физиология
Ключевые словадиаденозиновые полифосфаты, никотинамидадениндинуклеотид, сердце, биоэлектрическая активность, аритмия, ионные токи, потенциал действия, сократительная активность, пуриновые рецепторы, кардиомиоцит
Код ГРНТИ34.39.49
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Данный проект является продолжением нашего исследования, успешно проведенного в период с 2014 по 2016 годы и посвященного кардиотропным эффектам диаденозиновых полифосфатов (ДАП) и структурно близкого к ним НАД+, а также механизмам этих эффектов. Результаты проведенного исследования не оставляют сомнений, что ДАП и НАД+ способны регулировать сократительную и электрическую активность миокарда млекопитающих, при этом их эффекты опосредованы пуринорецепторами различных типов, в частности у крысы – типами P2X7 и P2Y1, и связаны по крайней мере с уменьшением кальциевого тока L-типа. Тем не менее, остается множество вопросов относительно механизмов эффектов ДАП и НАД+, которые предполагается разрешить в результате выполнения продолжения проекта в 2017-2018 годах. Во-первых, будет проверена возможность участия изменений внутриклеточной кальциевой динамики под действием ДАП и НАД+ в реализации их электрофизиологических эффектов в миокарде крысы. В связи с этим также будет выяснено вероятное влияние ДАП и НАД+ на кальций-зависимый хлорный ток. В 2017-2018 годах будут тщательно изучены вероятные непрямые воздействия ДАП и НАД+ на сердце, а именно связанные с подавлением адренергических влияний на миокард, а также обусловленные влиянием этих соединений не на сам миокарда, а на коронарные сосуды. Во второй части Проекта 2017 предполагается выйти за рамки рассмотрения эффектов ДАП и НАД+ в здоровом сердце взрослого млекопитающего. Будут выяснены особенности действия данных соединений на электрическую активность миокарда крысы, претерпевшего патофизиологический ремоделинг (в результате экспериментально вызванной длительной тахикардии), а также на миокард на ранних стадиях онтогенеза (новорожденные, однонедельные и трехнедельные крысята). Наконец, предполагается провести эксперименты на миокарде рыб, амфибий и птиц и в результате выяснить, являются ли ДАП и НАД+ регуляторными соединениями, специфичными для сердца млекопитающих, или же их роль шире и они могут рассматриваться как универсальные кардиорегуляторы в ряду позвоночных животных. По полученным результатам будет опубликовано как минимум 12 публикаций, индексируемых в системах Web of Science или Scopus, из которых половина – в журналах с импакт-фактором не ниже 2.
Ожидаемые результаты
В результате реализации Проекта 2017 будут с одной стороны получены принципиально новые сведения относительно механизмов реализации кардиотропных эффектов новой группы сигнальных соединений, диаденозиновых полифосфатов (ДАП) и НАД+, в здоровом сердце взрослого млекопитающего и таким образом будет сформирована цельная картина действия ДАП и НАД+ на сердце. С другой стороны, будут выявлены особенности действия данных кардиорегуляторов в миокарде, существенно отличающемся от ткани сердца здорового взрослого млекопитающего, а именно (1) в миокарде претерпевшем патологический ремоделинг, (2) в миокарде животных на ранних стадиях постнатального онтогенеза и (3) в миокарде представителей других групп позвоночных – рыб, амфибий и птиц. В итоге будут получены следующие принципиально новые результаты:
(ЧАСТЬ I – непосредственное продолжение Проекта 2014)
1. Будет описано действие ДАП (Ар5А и Ар4А) и НАД+ на динамику цитоплазматического кальция в предсердных и желудочковых кардиомиоцитах крысы, а именно получены данные о действии этих соединений на амплитудно-временные характеристики кальциевых транзиентов, регистрируемых с применением флюоресцентного кальций-чувствительного красителя fluo-4-AM.
2. Будут получены сведения о вероятном влиянии Ар5А, Ар4А и НАД+ на хлорный кальций-зависимый ток Ito2 (не следует путать с калиевым транзиторным током Ito1, изученным в Проекте 2014), регуляция которого может обуславливать обнаруженные в ходе выполнения Проекта 2014 электрофизиологические эффекты ДАП и НАД+ наряду с описанным ингибированием кальциевого тока L-типа.
3. Будет охарактеризована зависимость ингибиторных инотропных эффектов Ар5А, Ар4А и НАД+ в желудочках изолированного сердца крысы от состояния миокарда, а именно от величины преднагрузки, частоты сокращений, а также от наличия предварительной адренергической стимуляции. Кроме того, будут описаны инотропные эффекты ДАП и НАД+ в предсердном миокарде крысы в норме и на фоне адренергической стимуляции с использованием метода регистрации сокращений изолированных полосок миокарда.
4. Будет описано действие Ар5А, Ар4А и НАД+ на тонус изолированных коронарных артерий крысы, на основании полученных данных будет сделан вывод об относительной роли сосудистых эффектов ДАП и НАД+ в регуляции ими деятельности сердца.
(ЧАСТЬ II )
5. Будет охарактеризовано действие Ар5А, Ар4А и НАД+ на электрическую активность предсердного и желудочкового миокарда, а также миокардиальных рукавов торакальных вен крыс на ранних стадиях постнатального онтогенеза, а именно у новорожденных крысят (1-й день жизни), животных возрастом 1 неделя и 3 недели. Результаты будут сопоставлены с полученными на взрослых крысах в ходе Проекта 2014. Также будет определен рецепторный механизм электрофизиологических эффектов ДАП и НАД+ на ранних стадиях онтогенеза.
6. Будет охарактеризовано действие Ар5А, Ар4А и НАД+ на электрическую активность предсердного и желудочкового миокарда, а также миокардиальных рукавов торакальных вен крыс с экспериментально вызванным ремоделированием миокарда, индуцируемым с помощью хронической высокочастотной эндокардиальной стимуляции сердца. Будет сделан вывод о роли изучаемых пуриновых соединений в регуляции миокарда, претерпевшего патологическую перестройку.
7. Будут описаны и сопоставлены эффекты Ар5А, Ар4А и НАД+ на электрическую активность предсердного и желудочкового миокарда представителей различных классов позвоночных животных: рыб (навага), амфибий (травяная лягушка) и птиц (перепел), а также с использованием метода пэтч-кламп будет раскрыт ионный механизм данных эффектов в кардиомиоцитах рыб, как наиболее сильно филогенетически отстоящей от млекопитающих группы.
Получение данных результатов позволит завершить формирование представлений о действии ДАП и НАД+ на миокард и механизмах их кардиотропных эффектов. Результаты Проекта 2017 будут полностью соответствовать мировому научному уровню в области физиологии сердца. Мы можем с уверенностью это утверждать, поскольку по результатам проекта 2014 было выпущено 8 публикаций в международных журналах с импакт-фактором выше 2, а методический уровень Проекта 2017 будет еще выше, чем в случае Проекта 2014. Актуальность задач, поставленных в Проекте 2017 представляется нам также, по крайней мере не меньшей, чем в Проекте 2014. С прикладной точки зрения предложенное исследование, как и Проект 2014, позволит точнее определить мишени ДАП и НАД+ в миокарде, в частности в миокардиальных рукавах торакальных вен, играющих ключевую роль в развитии такой социально значимой широко распространенной патологии как мерцание и трепетание предсердий; охарактеризовать эффекты пуриновых соединений в коронарных сосудах, которые могут быть вносить определенный вклад в заболевания связанные с нарушением коронарного кровообращения. Полученные данные откроют путь к разработке фармакологических средств, позволяющих воздействовать на эти мишени, и таким образом предотвращать, к примеру, проаритмическое действие ДАП и НАД+ на миокардиальные рукава легочных вен, показанное в ходе выполнения Проекта 2014.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 году нами показано с использованием метода конфокального линейного сканирования, что диаденозиновые полифосфаты (ДАП) вызывают снижение амплитуды кальциевых волн (транзиентов) в желудочковых кардиомиоцитах крысы. Этот эффект ДАП блокируется ингибитором протеинкиназы С хелеретрином, но не ингибиторами фосфолипазы С или гуанилатциклазы. Следовательно, он не связан с активацией сигнального каскада оксида азота, но является зависимым от активации протеинкиназы С. Также показано, что в нормальных условиях НАД+ не оказывает влияния на кальциевую динамику в кардиомиоцитах.
Методом пэтч-кламп в конфигурации whole-cell мы показали, что диаденозин тетрафосфат (Ар4А) вызывает усиление хлорного кальций-зависимого тока Ito2. Диаденозин пентафосфат (Ар5А) и НАД+ не влияют на величину данного тока. Результаты экспериментов с регистрацией потенциалов действия (ПД) показывают, что увеличение Ito2 является одним из механизмов ускорения реполяризации, вызываемого Ар4А.
В изолированных сердцах крысы, перфузируемых по Лангендорфу мы обнаружили, что ДАП (но не НАД+) способны подавлять стимуляторные адренергические эффекты в желудочковом миокарде. Впервые установлено, что ингибиторные эффекты ДАП подавляются ингибиторами фосфодиэстераз (ФДЭ). Мы предполагаем, что действие ДАП в желудочковом миокарде крысы связаны с активацией ФДЭ 3-го или 4-го типа.
На этапе 2017 года нами впервые исследовано влияние ДАП и НАД+ на биоэлектрическую активность сердца в раннем постнатальном онтогенезе. Основным результатом этих экспериментов, является понимание того, что ДАП и НАД+ способны вызывать изменения электрической активности как желудочкового миокарда, так и суправентрикулярных отделов сердца на ранних этапах постнатального развития, т.е. в тот период, когда симпатический контроль работы сердца еще не сформирован. ДАП и НАД+ вызывали статистически значимое снижение длительности ПД на уровне 50% и 90% реполяризации в миокарде левого предсердия, правого предсердия, в препаратах правого желудочка и препаратах миокардиальных рукавов легочных вен. Следует отметить, однако, что ни ДАП, ни НАД+ не оказывали существенного влияния на автоматию правого предсердия в раннем постнатальном онтогенезе, и только у взрослых животных вызывали снижение ритма.
В 2017 году было исследовано влияние ДАП и НАД+ на электрическую активность спонтанно активного миокарда легочных вен (ЛВ). Нами показано, что ДАП и НАД+ не подавляют автоматию ЛВ, характерную для новорожденных крысят (на первые сутки жизни), но вызывают гиперполяризацию мембраны в кардиомиоцитах ЛВ в раннем постнатальном онтогенезе. Также установлено, что ДАП и НАД+ не оказывают влияния на спонтанную активность, индуцированную норадреналином у неонатальных животных (первые сутки), но полностью подавляют таковую у животных трехнедельного возраста. Таким образом, "антиадренергический" эффект ДАП и НАД в легочных венах зависит от возраста животных.
Наконец, нами показана универсальность ДАП и НАД+ как кардиорегуляторов в ряду позвоночных животных. Как и в миокарде млекопитающих, в предсердном и желудочковом миокарде рыб (навага), амфибий (лягушка) и птиц (перепел) ДАП и НАД+ вызывают ускорение реполяризации. У наваги данный эффект объясняется снижением ДАП и НАД+ кальциевого тока L-типа, в то время как на калиевые токи исследуемые соединения не действуют.
Публикации
1. Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С., Розенштраух Л.В. A new class III antiarrhythmic drug niferidil prolongs action potentials in guinea pig atrial myocardium via inhibition of rapid delayed rectifier Cardiovascular Drugs and Therapy, doi: 10.1007/s10557-017-6762-x (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1007/s10557-017-6762-x
2. Богус С.К., Кузьмин В.С., Абрамочкин Д.В., Суздалев К.Ф., Галенко-Ярошевский П.А. Effects of new antiarrhythmic agent SS-68 on excitation conduction, electrical activity in Purkinje fibers and pulmonary veins: Assessment of safety and side effects risk Journal of Pharmacological Sciences, V.133(3), P.122-129 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.jphs.2017.01.008
3. Пахомов Н.В., Пустовит К.Б., Потехина В.М., Филатова Т.С., Кузьмин В.С., Абрамочкин Д.В. Negative inotropic effects of diadenosine tetraphosphate are mediated by protein kinase C and phosphodiesterases stimulation in the rat heart European Journal of Pharmacology, - (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2017.12.024
4. Пустовит К.Б., Иванова А.Д., Кузьмин В.С. Внеклеточный НАД+ подавляет адренергические эффекты в предсердном миокарде крыс на раннем этапе онтогенеза Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2017)
5. Пустовит К.Б., Потехина В.М., Пахомов Н.В., Кузьмин В.С. Влияние внеклеточного диаденозинтетрафосфата на биоэлектрическую активность предсердного и желудочкового миокарда крысы на ранних этапах постнатального онтогенеза Вестник Московского университета. Серия 16. Биология, - (год публикации - 2018)
6. Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С., Розенштраух Л.В. A new antiarrhythmic drug niferidil prolongs action potentials in guinea pig atrial myocardium via inhibition of potassium currents Europace, V.19, suppl.3, P.117 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1093/ehjci/eux140.008
7. Каримова В.М., Кузьмин В.С. Mechanisms of beta-adrenergic regulation of murine pulmonary veins myocardium Acta physiologica, V.221, Suppl.S713, P.117-118 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1111/apha.12940
8. Пустовит К.Б., Пахомов Н.В., Кузьмин В.С. Extracellular diadenosine tetraphosphate affects contractility and cytoplasm calcium level via proteinkinase C pathway Acta Physiologica, V.221, Suppl.S713, P.212 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1111/apha.12942
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году с помощью метода кальциевого имэджинга изолированных кардиомиоцитов на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе было исследовано действие диаденозиновых полифосфатов (ДАП) и НАД+ на параметры кальциевых волн в предсердных кардиомиоцитах крысы. Было выяснено, что Ар5А, Ар4А и НАД+ вызывают существенное снижение амплитуды колебаний [Ca2+]i в изолированных предсердных кардиомиоцитах крысы, причем Ар5А может вызывать практически полное подавление кальциевых волн в предсердных клетках. Также показано, что Ар5А и Ар4А вызывают значительное снижение частоты спонтанных колебаний цитоплазматического кальция в предсердных кардиомиоцитах, в то время как НАД+ не оказывает такого эффекта. Данные эффекты ДАП значительно слабее выражены в клетках, обработанных ингибитором протеинкиназы С хелеретрином, а следовательно по крайней мере отчасти опосредованы протеинкиназой С. Результаты кальциевого имэджинга были хорошо дополнены данными экспериментов с регистрацией сократительной активности изолированных препаратов предсердного миокарда в изометрическом режиме. Ар5А, Ар4А и НАД+ в концентрациях 10, 30 и 100 мкМ существенно снижают силу сокращений предсердного миокарда. При этом выраженность негативного инотропного эффекта Ар5А (в отличие от Ар4А и НАД+) значительно увеличивается на фоне стимуляции препаратов норадреналином (300 нМ).
В 2018 году было продолжено исследование вазорегуляторных эффектов ДАП и НАД+ в коронарных артериях крысы. Эксперименты проводились на сегментах септальной коронарной артерии, предсокращенных серотонином. В таких условиях лишь Ар5А вызывал существенную констрикцию препаратов, в то время как Ар4А и НАД+ оказались неэффективны.
В дополнение к электрофизиологическим экспериментам 2017 года, показавшим различие в рецепторном механизме эффектов ДАП и НАД+ между крысятами первой недели жизни и 21-дневными/взрослыми крысами, была проведена оценка экспрессии генов 2 типов пуринорецепторов (Р2Х7 и Р2Y1), которые по нашим данным опосредуют электрофизиологические эффекты ДАП и НАД+ у взрослых крыс. Данные ПЦР в реальном времени показали, что транскрипты генов пуриновых рецепторов Р2Х7 и Р2Y1 обнаруживаются в предсердном и желудочковом миокарде крыс всех исследованных возрастов, но у однодневных и 7-дневных крысят их количество минимально, значительно выше оно у 21-дневных животных¸ еще выше - у взрослых. При этом у 21-дневных и взрослых крыс относительное количество транскриптов обоих генов в желудочковом миокарде выше, чем в предсердном. В то же время данные вестерн-блоттинга указывают на полное отсутствие рецепторов Р2Х7 у 1-дневных и 7-дневных крысят и выраженную экспрессию у 21-дневных и взрослых. Учитывая электрофизиологические данные, мы можем заключить, что в отличие от взрослых животных, у крысят первой недели жизни Р2-рецепторы не участвуют в опосредовании кардиотропных эффектов ДАП и НАД+.
Наконец, в 2018 году нами проведено тестирование эффектов ДАП и НАД+ в миокарде крысы, модифицированном в результате экспериментальной 6-часовой высокочастотной эндокардиальной стимуляции. Оказалось, что в сердце, модифицированном тахикардией, эффекты ДАП и НАД+ выражены значительно слабее, чем в нормальном сердце. В частности, экспериментальная тахикардия сильно снижает выраженность негативного хронотропного эффекта и замедления атриовентрикулярного проведения, вызываемого ДАП и НАД+.
Публикации
1. Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С. Electrophysiological differences in cholinergic signaling between the hearts of summer and winter frogs (Rana temporaria) Journal of Comparative Physiology B, Volume 188, Issue 4, pp 649–656 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1007/s00360-018-1147-4
2. Абрамочкин Д.В., Хассинен М., Ворнанен М. Transcripts of Kv7.1 and MinK channels and slow delayed rectifier K+ current (IKs) are expressed in zebrafish (Danio rerio) heart Pflügers Archiv - European Journal of Physiology, Volume 470, Issue 12, pp 1753–1764 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1007/s00424-018-2193-1
3. Кузьмин В.С., Егоров Ю.В., Розенштраух Л.В. Электрофизиологические эффекты эндогенного полиамина, являющегося регулятором тока аномального выпрямления, и его действие при моделировании ишемии в сердце Кардиология, - (год публикации - 2019)
4. Потехина В.М., Кузьмин В.С., Абрамочкин Д.В. Внеклеточный диаденозинтетрафосфат подавляет эктопическую активность в миокардиальной ткани легочных вен у взрослых, но не у новорожденных крыс Вестник Московского университета. Серия 16. Биология, - (год публикации - 2019)
5. Пустовит К.Б., Потехина В.М., Иванова А.Д., Петров А.М., Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С. Extracellular ATP and β-NAD alter electrical properties and cholinergic effects in the rat heart in age-specific manner Purinergic Signalling, - (год публикации - 2019)
6. Филатова Т.С., Абрамочкин Д.В. Пуринергическая регуляция транзиторного кальцийзависимого хлорного тока Ito2 в желудочковом миокарде крысы Биологические мембраны, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1134/S023347551806004X
7. - Ему не хочется покоя. Обнаружен новый механизм регуляции работы сердца Поиск, №3, 2018 (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
не указано