Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Для изучения ключевых генов апоптоза отобраны 12 генов, из которых 7 про-апоптозных: APAF1, DAPK1, TP53, RASSF1A, BAX, BCL2L11/BIM, BAK1, и 5 генов анти-апоптозных: BCL2, BIRC5 (survivin), BCL6, CCND1 и c-MYC. Среди них, APAF1 - индуктор апоптоза; DAPK1 - медиатор клеточной смерти; белки семейства BCL2, включая активаторы апоптоза BAX и BIM, индуктор апоптоза BAK1, супрессоры апоптоза BCL2, BIRC5, BCL6; RASSF1A, участвующий в инициации апоптоза; TP53, транскрипционный фактор активаторов апоптоза (в частности BIM); CCND1, регулирующий клеточный цикл в фазе G1/S; онкоген c-MYC активирующий транскрипцию ряда генов пролиферации. Для этих 12 генов проведён анализ изменения уровня мРНК методом ПЦР в реальном времени на представительной выборке парных образцов РМЖ (36-41). Значимо частое (р<0.001, по Фишеру) преобладание снижения уровня экспрессии показано для генов: APAF1 (58% против 17%, p<0.001), DAPK1 (76% против 7%, p<0.001), RASSF1A (80% против 1,5%, p<0.001); тенденцию к снижению экспрессии наблюдали для генов BIM, BAX, BAK1, TP53 (40-50% против 20-30%); значимо частое повышение экспрессии выявлено для генов: BCL2 (70% против 17%, p<0.001), CCND1 (66% против 1.5%, p<0.001), BCL6 (66% против 20%, p<0.001); выраженную тенденцию к повышению экспрессии наблюдали также для c-MYC и BIRC5 (40-50% против 25-35%). Результаты анализа изменения уровня мРНК согласуются с про-апоптозными свойствами генов APAF1, DAPK1, RASSF1A, BIM, BAX, BAK1 и TP53 и анти-апоптозными свойствами генов BCL2, CCND1, BCL6, c-MYC и BIRC5. Построены профили метилирования для 10 генов, имеющих локализованные промоторные CpG-островки. Для 5 про-апоптозных генов в образцах опухолей наблюдали повышение метилирования (гиперметилирование) с частотами: RASSF1A - 51%, DAPK1 - 46%, BIM - 49%, BAX - 49% и BAK1 - 43%, соответственно, в сравнении с 12-24% в гистологически неизмененной ткани, в то время как метилирование APAF1 составило только 12% против 2%. Напротив, снижение метилирования в образцах опухолей по сравнению с гистологически неизмененной тканью отмечено у анти-апоптозных генов BCL2 (17% против 49%) и BIRC5 (43% против 15%). Для генов c-MYC и TP53 метилирование не было выявлено ни в образцах опухолей, ни в гистологически неизмененных парных образцах ткани молочной железы. С применением оригинального алгоритма «CrossHub» (Krasnov et al., 2016) предсказаны по 40 потенциально регуляторных микроРНК для каждого из 12 исследуемых генов апоптоза (с уровнем корреляции Rs, варьирующим от 0.05 до 0.58). Из них нами выбраны 10 основных микроРНК (miR-17-5p, -21-3p, -34c-3p, -93-5p, -125b-5p, -130b-3p, -140-5p, -145-5p, -375, -660-5p), потенциально связанных с регуляцией более чем 2 генов из 12 исследуемых про- и анти-апоптозных генов (APAF1, DAPK1, TP53, RASSF1A, BAX, BIM, BAK1, BCL2, BIRC5, BCL6, CCND1 и c-MYC). Построены профили экспрессии суммарно 17 микроРНК, вовлеченных в РМЖ (miR-17-5p, -21-3p, -34b-3p, -34c-3p, -93-5p, -124-3p, -125b-5p, -127-5p, -129-5p, -130b-3p, -132-3p, -140-5p, -145-5p, -191-5p, -193a-5p, -375, и -660-5p), на общей выборке из 40 парных образцов РНК первичных опухолей РМЖ методом количественной ОТ-ПЦР с применением сертифицированных наборов фирмы Applied Biosystems. На исследованной выборке 40 образцов наиболее значимое (p < 0.05) снижение уровня микроРНК показано для miR-193a-5p (75%), miR-124-3p (65%), miR-125b-5p (72%), miR-132-3p (48%), miR-34b-3p (45%). Снижение в значительной доле образцов (более 30%) выявлено также для miR-34c-3p, -127-5p, -129-5p, -140-5p, -145-5p. Наиболее значимое (p < 0.05) повышение уровня микроРНК показано для miR-375 (48%). Повышение экспрессии доминировало также для miR-21-3p, -93-5p, -191-5p, -660-5p. Дифференциальное изменение экспрессии (с повышением и понижением) отмечено для двух микроРНК (miR-17-5p, -130b-3p). Построены профили метилирования промоторных CpG-островков генов данных микроРНК (MIR-17, -21, -34b, -34c, -93, -124-1/2/3, -125b-1, -127, -129-2, -130b, -132, -140, -145, -191, -193a, -375) с применением представительной выборки из 58 парных образцов ДНК РМЖ методом бисульфитной конверсии с последующей МС-ПЦР. Значимое преобладание частоты метилирования в опухоли по сравнению с гистологически неизмененной тканью показано для 10 генов: MIR-124-1, -124-3, -125b-1, -127, -129-2, -132, -140, -145, -193a, -34b/c, - в 35-73% образцов РМЖ. Гиперметилирование генов MIR-132, -140, -145, 125b-1, -127, -129-2 на представительных выборках РМЖ показано впервые, как и гипометилирование генов MIR-191, MIR-93. Для 14 микроРНК (miR-34b-3p, -34c-3p, -93-5p, -124-3p, -125b-5p, -127-5p, -129-5p, -130b-3p, -132-3p, -140-5p, -145-5p, -191-5p, -193a-5p, -375) методом корреляционного анализа установлены значимые корреляции между изменениями уровня экспрессии и статуса метилирования; значения коэффициента корреляции Спирмена (Rs) составили 0.56-0.78, p ≤ 0.002. Значимые корреляции между изменениями уровня экспрессии и статуса метилирования позволили нам показать функциональную роль метилирования в регуляции данных генов микроРНК и в патогенезе РМЖ. Методом корреляционного анализа сопоставлены уровни экспрессии 17 микроРНК (miR-17-5p, -21-3p, -34b-3p, -34c-3p, -93-5p, -124-3p, -125b-5p, -127-5p, -129-5p, -130b-3p, -132-3p, -140-5p, -145-5p, -191-5p, -193a-5p, -375, -660-5p,) и 12 опухоль-ассоциированных белоккодирующих генов (APAF1, DAPK1, TP53, RASSF1A, BAX, BIM, BAK1, BCL2, BIRC5, BCL6, CCND1 и c-MYC), предсказанных биоинформатически как потенциальные гены-мишени для ряда микроРНК. Значимая отрицательная корреляция установлена между уровнями экспрессии мРНК про- и анти-апоптозных генов и ряда микроРНК: miR-124-3р и RASSF1A (Rs = -0.43, p ≤ 0.01); miR-127-5p и DAPK1 (Rs = -0.50, p ≤ 0.001); miR-145-5p и BAK1 (Rs= -0.43, p≤ 0.01); miR-125b-5р и BAX (Rs= -0.31, p≤ 0.05); miR-34c-3p и CCND1 (Rs= -0.33, p≤ 0.05); miR-34a-5p и CCND1 (Rs= -0.34, p≤ 0.05); miR-193а-5р и BCL2 (Rs = -0.33, p ≤ 0.05); miR-124-3p и BCL2 (Rs = -0.34, p ≤ 0.05); miR-125b-5р и BIRC5 (Rs= -0.34, p≤ 0.05); коэффициент отрицательной корреляции Rs изменялся в интервале от -0.31 до -0.50, достоверность изменялась в интервале 0.05 – 0.001. Таким образом, определены 9 потенциально взаимодействующих пар микроРНК - мРНК, связанных с регуляцией апоптоза, а именно: RASSF1A - miR-124-3р, DAPK1 - miR-127-5p, BAK1 - miR-145-5p, BAX - miR-125b-5р, CCND1 - miR-34c-3p, CCND1 - miR-34a-5p, BCL2 - miR-193а-5р, BCL2 – miR-124-3p и BIRC5 - miR-125b-5p. Эти взаимодействия, прямые или опосредованные, вовлечены в апоптотические процессы при РМЖ и общие сигнальные пути (по данным KEGG, Gene Ontology). Так, потенциально регулирующие CCND1, miR-34a-5p и miR-34c-3p имеют мишенями протеинкиназы и вовлечены в апоптотический процесс. Регуляторные микроРНК miR-34a-5p и miR-34c-3p, как и их потенциальная мишень, CCND1, - вовлечены в общие сигнальные пути: Wnt, ErbB, TGF-beta, p53 (по данным KEGG и GO). Ранее (в 2016г) показано, что трансфекция дуплексов miR-124-3p в линию клеток MCF-7 приводила к значимому снижению экспрессии мРНК BCL2 на 30%. Проведено полнотранскриптомное исследование при гиперэкспрессии 40 нМ miR-124-3p на линии клеток MCF-7 с помощью платформы Affymetrix с последующим биоинформатическим анализом с использованием Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Было установлено: 1466 / 4408 наборов генов увеличили активность, при этом 464 наборов генов значимы при FDR < 25%; 2942 / 4408 наборов генов уменьшили активность, при этом 986 наборов генов значимы при FDR < 25%. Дифференциальные процессы оценивали с применением Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). В результате были определены более 120 процессов, активируемых в трансфецированных клетках (при FDR < 5%) и 32 процесса, которые снижают свою активность в трансфецированных клетках (при FDR < 5%). В итоге показано, что гиперэкспрессия miR-124-3p в клетках MCF-7 приводит к существенному «перепрограммированию» транскриптома и изменениям функционального состояния клеток на уровне РНК, выражающимся в подавлении ряда клеточных процессов, среди которых иммунные, гормон-опосредуемые, и активации ряда клеточных процессов, таких, как метаболические и энергетические процессы, процессы, ассоциированные с микротрубочками, и хромосомами. Проведенный анализ позволил сформировать предварительный перечень новых потенциальных мишеней miR-124-3p, среди которых ATP6V0E1, PLOD3, VAMP3, TMEM109, PAPSS2, MAGT1, LRRC58, HMOX1, ELOVL1; LAD1, ATL3, SKP2, TXNRD1, CYP1A1, BTG2, MPZL3, SERINC2, SCNN1A. В модельном эксперименте по трансфекции клеточной линии РМЖ MCF-7 изучено влияние 4 микроРНК (miR-34c-5p, miR-34c-3p, miR-34a-5p, miR-34a-3p), среди которых определена единственная микроРНК, miR-34c-3p, эффективно понижающая экспрессию CCND1 в 1.67 раза (0.600±0.065) (p-val=0.000071). Этот результат подтверждает потенциальную регуляторную роль miR-34c-3p в отношении экспрессии CCND1 в отличие от 3 других исследованных микроРНК. Кроме того, с использованием ДНК-цитометрии показано влияние miR-34a-5p и miR-34с-3p на распределение клеток MCF-7 по фазам цикла, выражающееся в блокировании G1|S перехода, снижение процента клеток, находящихся в фазе S и снижении пролиферации клеток, причем наиболее значимое воздействие оказывает miR-34a-5p (p-val=0.0067). В целом, изучена роль комплекса эпигенетических механизмов в регуляции группы 12 генов, вовлеченных в апоптозный каскад: APAF1, DAPK1, BAX, BIM, BAK1, BCL2, BIRC5, BCL6, RASSF1A, TP53, CCND1 и c-MYC. Показано значимое супрессорное влияние на экспрессию этих генов метилирования их промоторных областей (Rs 0.39-0.59, р<0.01, p < 0.001) и ингибирующий эффект специфичных регуляторных микроРНК: RASSF1A (miR-124-3р), DAPK1 (miR-127-5p), BAK1 (miR-145-5p), BAX (miR-125b-5р), CCND1 (miR-34c-3p, -34a-5p), BCL2 (miR-193а-5р, -124-3p), и BIRC5 (miR-125b-5p) (значения Rs < -0.3, p < 0.05). Кроме того, в качестве 3 фактора нами впервые выявлено значимое влияние метилирования генов специфичных регуляторных микроРНК. Например, показано, что метилирование гена MIR-124а-1 значимо положительно коррелирует с экспрессией про-апоптозного гена RASSF1A (Rs = 0.51, p ≤ 0.01), а метилирование гена MIR-127 значимо положительно коррелирует с экспрессией про-апоптозного гена DAPK1 (Rs = 0.48, p ≤ 0.001). То есть мы наблюдаем опосредованное влияние метилирования генов специфичных регуляторных микроРНК на экспрессию их генов-мишеней и взаимосвязь трех эпигенетических механизмов в регуляции группы ключевых генов апоптоза. Результаты, полученные по теме данного Проекта, представлены в 2017г. в виде 4 статей в журналах: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (БЭБМ. 2017;164 (9): 335-340); Молекулярная биология (принята в печать), Генетика (принята в печать), Российский биотерапевтический журнал (2017, том 16 № 4 стр. 37-44), опубликованы как материалы конференции в журнале FEBS J (2017, Vol. 284, S. 1, p. 264, p. 265). Кроме того, рукопись: Loginov et al., “Novel miRNA genes deregulated by aberrant methylation in ovarian carcinoma are involved in metastasis” submitted in GENE (Ms. Ref. No.: GENE-D-17-02347) находится на стадии рецензирования. Результаты, полученные по теме Проекта, доложены в 2017г. на 8 отечественных и международных форумах, включая 5th International Conference on Integrative Biology, June 19-21, 2017 London, UK. Biol Syst Open Access 2017, 6:1(Suppl) DOI: 10.4172/2329-6577-C1-008; III Петербургский онкологический форум «Белые ночи – 2017», Санкт-Петергбург, Россия, 22-23 июня, 2017; 4th World Congress on Breast Pathology and Cancer Diagnosis (Breast Pathology-2017)”, August 23-24, 2017 at Toronto, Canada; The 42nd FEBS Congress “From molecules to cell and back”, 10-14 September, Jerusalem, Israel; III Всероссийская Конференция по молекулярной онкологии, Москва, Россия, 6-8 декабря, 2017 – в рамках этой конференции В.И. Логинов награжден Дипломом за лучший постерный доклад по секции «Геномика и эпигеномика злокачественных новообразований».

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведены комплексные исследования эпигенетических механизмов регуляции генов с участием микроРНК (миРНК) и метилирования при раке яичников (РЯ) и раке молочной железы (РМЖ), как с применением корреляционных анализов изменений экспрессии и метилирования на клинических образцах, так и с применением функциональных подходов. Так, при РЯ для ряда генов, вовлеченных в метастазирование и переходы ЭМП-МЭП, например, CDH1/Е-кадгерин, ZEB1, SLUG/SNAIL2, BCL6, RHOA, BCL2, DAPK1, CCND1, NF1B, TGFB2, ACSL1, AURKA, c-MYC, AXL, BAX, MCL1, TP53 с применением оригинального алгоритма “Cross Hub” (Krasnov et al., 2016) отобраны 20 миРНК (miR-107, -124-3p, -125b-5p, -1258, -127-5p, -129-5p, 130b, -132-3p, -137, -148a-3p, -17-5p, -191-5p, -193a-5p, -203a, -212, -339-3p, -34a-3p, -34c-3p, -375, -9), предсказательно участвующих в регуляции этих генов. Методом МС-ПЦР определён профиль метилирования группы из 21 гена миРНК, потенциально вовлеченных в метастазирование РЯ и в регуляцию генов ЭМП-МЭП, - на общих выборках образцов ДНК, включающих 45 неметастазирующих опухолей, 31 метастазирующих опухолей, и 19 макро-метастазов в брюшину. Выявлено гипометилирование гена MIR-191 и гиперметилирование 16 генов миРНК, причем, ВПЕРВЫЕ для 12 генов миРНК: MIR-107, -124-1, -124-2, -124-3, -1258, -127, -130b, -132, -137, -191, -193A, -339 (p<0.001, FDR=0.01). Гиперметилирование 13 генов миРНК (MIR-124-2, -124-3, -125B-1, -1258, -127, -129-2, -130b, -137, -193A, -203A, -339, -34b/c, -375) ассоциировано с метастазированием (p≤0.01). Определены группы генов, специфично гиперметилированных в первичных опухолях до метастазирования (MIR-107, -124-1, -124-3, -132), после метастазирования (MIR-124-2, -125B-1, -137, -203A, -375) и в макро-метастазах (MIR-107, -124-1, -148a, -212). Методом количественной ОТ-ПЦР определён профиль экспрессии 12 миРНК (miR-124-3p, -125b-5p, -127-5p, -129-5p, -132-3p, -137, -148a-3p, -191-5p, -193a-5p, -203a, -339-3p, -375) на общей выборке 59 парных образцов РЯ. Для этих 12 миРНК показана высоко значимая корреляция между изменениями экспрессии и метилирования кодирующих их генов (Rs= {0.67 - 0.94} p ≤ 10-4 FDR = 0.01), что подтверждает функциональную роль метилирования генов миРНК в патогенезе РЯ. Определены группы миРНК со сниженной экспрессией в первичных опухолях до метастазирования (miR-124-3p, -125b-5p, -129-5p, -132-3p, -193a-5p), после метастазирования (miR-125b-5p, -127-5p, -129-5p, -132-3p, -137, 193a-5p, -203a, -339-3p, -375) и в макро-метастазах (miR-125b-5p, -127-5p, -129-5p, -132-3p, -137, 193a-5p, -203a, -339-3p, -375). Интересно отметить специфичную перемену свойств миРНК miR-203a и miR-375 в процессе метастазирования от онкогенных с повышенной экспрессией к анти-метастатическим с пониженной экспрессией и гиперметилированием. Стоит отметить своеобразие miR-148a-3p, которая не изменяет ни экспрессию, ни метилирование в первичных опухолях даже от пациенток с метастазами, но резко снижает экспрессию и повышает степень метилирования в макро-метастазах, что указывает на специфичную анти-метастатическую роль miR-148a-3p при РЯ, но на стадии макро-метастазов. Анти-метастатическая роль miR-203a, miR-375 и miR-148a-3p при РЯ обнаружена нами ВПЕРВЫЕ. Определены профили экспрессии 17 генов: CDH1/Е-кадгерин, ZEB1, SLUG/SNAIL2, BCL6, RHOA, BCL2, DAPK1, CCND1, NF1B, TGFB2, ACSL1, AURKA, c-MYC, AXL, BAX, MCL1 и TP53, потенциально вовлеченных в метастазирование и переходы ЭМП-МЭП. На общей выборке первичных опухолей значимое снижение экспрессии выявлено для 4 генов: BCL2, ACSL1, SLUG/SNAIL2, TP53 (p≤0.05), а также на уровне тенденции у генов: c-MYC, AXL, NF1B и TGFB2. Значимое повышение экспрессии выявлено для двух генов: CCND1 и AURKA (p≤0.05), а также на уровне тенденции для гена BAX. Отмечено повышение экспрессии генов ACSL1, SLUG/SNAIL2, AXL, NF1B и TGFB2 в процессе метастазирования, что согласуется с данными литературы о позитивном влиянии этих генов на ЭМП и метастазирование. Определены профили метилирования 12 генов, у которых локализованы CpG-островки: CDH1/Е-кадгерин, ZEB1, BMI1, CTNNB1/бета-катенин, SOX2, SNAIL1, RHOA, BCL2, DAPK1, c-MYC, BAX, TP53. Показано гиперметилирование BAX, DAPK1 и на уровне тенденции RHOA и BCL2, а также гипометилирование CTNNB1/бета-катенин и на уровне тенденции – CDH1/Е-кадгерин. На основе данных, полученных на общих выборках образцов ДНК и РНК, методом корреляционного анализа ВПЕРВЫЕ установлена высоко значимая корреляция между изменениями экспрессии и метилирования для 4 генов: DAPK1, BCL2, BAX и RHOA (Rs=0.66-0.88, p≤10-3), что показывает функциональную роль метилирования в регуляции их экспрессии в патогенезе РЯ. Сопоставлены данные по изменениям экспрессии 17 белоккодирующих генов (CDH1/Е-кадгерин, ZEB1, SLUG/SNAIL2, BCL6, RHOA, BCL2, DAPK1, CCND1, NF1B, TGFB2, ACSL1, AURKA, c-MYC, AXL, BAX, MCL1 и TP53), потенциально вовлеченных в метастазирование и ЭМП/МЭП, и 12 миРНК (miR-124-3p, -125b-5p, -127-5p, -129-5p, -132-3p, -137, -148a-3p, -191-5p, -193a-5p, -203a, -339-3p, -375), предсказательно вовлеченных в их регуляцию, полученные на общих выборках образцов РНК и ДНК. Методом корреляционного анализа определены 6 пар миРНК – мРНК с достаточно выраженной отрицательной корреляцией: BCL6 – miR-137, RHOA – miR-129-5p, NF1B – miR-148a-3p, TGFB2 – miR-132-3p, TP53 – miR-137, DAPK1 – miR-148a-3p (Rs= { -0.26 - -0.47}, p= {0.02-0.08}). Эти результаты означают, что гены (BCL6, RHOA, NF1B, TGFB2, TP53 и DAPK1) могут потенциально подавляться посредством прямого или опосредованного воздействия миРНК (miR-137, miR-129-5p, miR-148a-3p, miR-132-3p, miR-137, и miR-148a-3p, соответственно). Эти результаты требуют верификации с помощью исследований на культурах клеток. Транскриптомный анализ, проведенный в 2017 году при оверэкспрессии miR-124-3p в клетках MCF-7, был дополнен анализом неспецифического действия олигонуклеотидов на транскриптом клеток. Наблюдаемая нами специфическая картина miR-124-3p-индуцированного ремоделирования транскриптома на уровне процессов с вовлечением «включаемых» и «выключаемых» генов оказалась устойчива как на фоне неспецифического действия cel-miR-67p, так и при использовании разных биоинформатических баз-источников аннотации генов. Заметной направленностью изменения транскриптома при оверэкспрессии miR-124-3p была активация целого ряда генов (около 500), ассоциированных с различными элементами системы клеточного дыхания и окислительного фософорилирования. Нами была проведена оценка функциональных эффектов наблюдавшегося нами столь отчетливого ремоделирования транскриптома, которая включала в себя анализ потенциала митохондриальной мембраны и уровень продукции активных форм кислорода. Проведенный анализ показал, что оверэкспрессия miR-124-3p в опухолевых клетках MCF-7 достоверно увеличивает потенциал митохондриальной мембраны и снижает продукцию активных форм кислорода. Полученные данные впервые свидетельствуют об активизации дыхательной цепи митохондрий при увеличении в клетках уровня miR-124-3p . Направление наблюдавшихся изменений согласуется с парадигмой, существующей в данной области, согласно которой активно производящие АТФ митохондрии характеризуются меньшей продукцией супероксид анион-радикала (Murphy, 2009). Проведенные нами исследования указывают на высокую функциональную значимость изменений транскриптома, индуцированных увеличением уровня зрелой формы miR-124-3p в клетках. Для опухолевых клеток часто характерен гликолиз, в том числе аэробный, при этом могут изменять свою активность редокс-зависимые митохондриальные каналы. Наблюдаемое нами увеличение потенциала митохондриальной мембраны и снижение продукции АФК может менять чувствительность клеток к апоптоз-индуцирующим сигналам и модулировать апоптозные пути, в частности митохондриальный путь. Для уточнения характера взаимодействия hsa-miR-124-3p – BCL2, hsa-miR-34a-5p – CCND1 и hsa-miR-34a-5p– CCND1, нами был использован метод biotin-pulldown, в котором трансфекция клеток осуществляется с использованием биотинилированных микроРНК-мимиков, включаемых в комплекс RISC. При последующем лизисе клеток магнитные микрочастицы, покрытые стрептавидином, позволяют преципитировать биотинилированные олигонуклеотиды и комплексы с их участием. Нами наблюдалось обогащение на магнитных частицах мРНК-мишени для пар CCND1/miR-34a-5p, CCND1/miR-34c-3p, BCL2/miR-124-3p, что может указывать на прямой характер взаимодействия данных микроРНК и их мишеней. Проведенный нами транскриптомный анализ образцов рака яичников показал повышение активности группы генов, ассоциированных с биосинтезом гепаран сульфата KEGG GLYCOSAMINOGLYCAN BIOSYNTHESIS HEPARAN SULFATE, что может быть связано с ремоделированием внеклеточного матрикса. Интересно, что среди понизивших свою активность процессов в опухолевых тканях нами был идентифицирован процесс, связанный с врожденным иммунитетом BIOCARTA TOLL PATHWAY (Toll-Like Receptor).