КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 14-15-00147

НазваниеРазработка базовых принципов антиишемической стратегии

РуководительЗоров Дмитрий Борисович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2017 г. - 2018 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-104 - Физиология

Ключевые словамитохондрии, активные форма кислорода и азота, ишемическое, фармакологическое и дистанционное прекондиционирование, ишемия, гипоксия, окислительный стресс, инсульт, инфаркт,

Код ГРНТИ34.19.19

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на развитие и усовершенствование стратегии антиишемической защиты с целью дальнейшего глубокого исследования механизма повреждения при патологиях, сочетающихся с окислительным стрессом и прежде всего ишемического толка и представления возможных путей терапии таких патологий. Актуальность таких исследований остается и будет оставаться на долгие годы, учитывая очень скромный прогресс в этом направлении, хотя ишемические болезни как причины смертности продолжают оставаться на первом месте. Однако, несмотря на внедрение новых видов фармакологических антиишемических препаратов, полностью предотвратить и тем более вылечить пациента от последствий ишемического повреждения органа (сердца, мозга и почки) не удается, видимо вследствие того, что часть изменений в ткани происходит достаточно быстро и необратимо, что накладывает дополнительные требования к терапии, все больше фокусируясь на профилактике и скорости оказания помощи при наступлении патологии. Продолжает оставаться актуальным два эффективных, не хирургических подхода в решении вопроса, а именно мобилизация собственных физиологических адаптивных механизмов защиты от ишемического повреждения, через т.н. пре- или пост-кондиционирование ткани-мишени и фармакологическое прекондиционирование через использование препаратов, уменьшающий повреждение ткани. Однако самым важным остается механизм повреждения, в котором ключевую роль играют активные формы кислорода, играющие как положительную роль, обеспечивая защитную сигнализацию, так и патологическую роль, приводя к окислению жизненно важных компонентов клетки (белков, липидов и нуклеиновых кислот). Учитывая, что основными продуцентами активных форм кислорода являются митохондрии, именно к этим органеллам будет приковано основное внимание в процессе выполнения проекта. В прошлых работах, коллектив, заявленный на выполнение данного проекта, успешно выполнил целый ряд задач по выявлению ключевых элементов защитных антиишемических механизмов, в частности киназы гликогенсинтазы, равно важной в реализации механизмов ишемического и фармакологического прекондиционирования, определил риск-факторы в патогенезе ишемических болезней, исследовал механизмы действия некоторых антиишемических средств и начал исследования процесса деградации поврежденных митохондрий, который видимо является ключевым в нормальном функционировании клетки. Учитывая огромный интерес в мире к проблеме аутофагии/митофагии и будучи уникальными экспертами мирового уровня в физиологии и клеточной биологии митохондрий, решено принять участие в таких исследованиях, тем более, что в процессе ишемического повреждения больше всего страдают митохондрии и наша концепция о повышении гетерогенности митохондриальной популяции как основе патогенеза, включая старение, все больше звучит в мире. Из практически неисследованных моментов остается процесс инициации митофагии, который больше декларативно чем доказательно указывал на то, что определяющим фактором для «смертельного приговора» для митохондрий является наличие низкого значение мембранного потенциала, что вызывает целый ряд технических вопросов, потому что корректное измерение этого параметра не может себе позволить никто в мире. Поэтому для предоставления полной доказательной базы такого предположения – есть очень важная задача, которую надо будет сделать. Показанный в группе эффект повышения аутофагии после ишемии/реперфузии потребует развития подходов по прямому воздействию на аутофагию с целью проследить возможность уменьшения ишемического повреждения за счет внесения в систему фармакологических агентов, специфически тормозящих аутофагию и/или влияющих на функционирование митохондрий. В проекте будет сделан упор на изучении морфологических изменений митохондрий, в частности на ультраструктурной уровне, особенно при доказательстве их деградации. Учитывая то, что одним из самых доказанных факторов, замедляющих протекание ряда патологий, а особенно старение, является ограничение по калорийности пищи, мы поставили новую, никем ранее не исследованную задачу представить возможность терапии ишемического повреждения процедурой ограничения по калориям с возможной увязкой с активностью лизосом. Одновременно надо будет проверить возможность влияния ограничения по питательным субстратам при культивации клеток в условиях моделирования ишемического инсульта. Будет совершенствоваться процедура ишемического прекондиционирования, включая удаленное прекондиционирование, возможно в сочетании с фармакологическими препаратами для повышении доказанной невысокой эффективностью удаленного прекондиционирования. Такого рода задачи, по нашим сведениям, пока никем не ставились и являются оригинальными и очень выигрышными, если это сработает. Но в целом, все задачи являются новаторскими и любой ответ, полученный в работе будет ценен, ибо он даст правдивый ответ на механизм протекания процесса деградации митохондрий в условиях нормы и патологии, в частности при ишемическом воздействии.

Ожидаемые результаты
На сегодняшний день очень «горячей» темой исследований в мире является механизм проверки качества митохондрий, а особенно процесс уничтожения «неправильных» митохондрий через аутофагию (митофагию), за открытие которой в 2016 году получил Нобелевскую премию Ёсинори Осуми. Еще одна Нобелевская премия была получена в 2004 году за схожую тематику по процессам убиквитинирования, как генерального механизма удаления поврежденных структур. Это свидетельствует о максимальной важности данной проблемы, ибо по всеобщему признанию именно нарушение процесса удаления поврежденных микроструктур (белки, липиды и нукелиновые кислоты) и макроструктур, среди которых самыми важными являются митохондрии, является причиной возникновения великого множества болезней. Эта проблема настолько объемна, что может в себя вместить громадное число исследователей, то есть специалистов самого разного профиля, включая молекулярных биологов, клеточных биологов, физиологов и биохимиков. Учитывая большой и уникальный опыт и всемирное признание группы из лаборатории структуры и функции митохондрий Института физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ, можно рассчитывать на успех данной группы при определении и выполнении задач по данной тематике. Таким образом, можно с уверенностью говорить об актуальности проблемы, готовности и способности коллектива выполнять эти задачи, полностью понимающего и всесторонне оценивающего проблему. Но при этом надо понимать, что стоит не только частная задача понимания процесса детекции и устранения повреждения митохондриальных структур, но и привязка этой задачи к выяснению механизма возникновения патологий ишемического толка. Участники данной группы этой тематикой занимаются на протяжении уже 20 лет. За это время в результате их работы достигнут значительный успех, выраженный в мирового уровня публикациях по механизмам антиишемической защиты разных органов, включая сердце, мозг и почки [1-15]. Высокая квалификация участников в митохондриальной физиологии позволяет поставить ряд задач, новизна которых не вызывает сомнения. Среди таких новых задач ставится задача проанализировать значение митохондриального мембранного потенциала, причем не только как фактора, определяющего приговор митохондрии к уничтожению, а вообще понять, на каких основаниях мембранный потенциала считается жизненно важным для клетки и почему именно он определяет (если определяет) «пригодность» митохондрий в клетке. Митохондриальный мембранный потенциал (ΔΨ) образуется как результат окислительно-восстановительных превращений компонентов цикла Кребса и служащий интермедиатом, который использует АТР синтаза. Эти превращения генерируют не только мембранный потенциал, но и протонный градиент, сумма которых составляет трансмембранный потенциал ионов водорода [16]. Как показывает практика, сигнализация от АТР и ΔΨ различная и хотя для обоих компонентов обязательным является внутриклеточный гомеостаз [4, 17, 18], нарушения которого чреваты нарушением жизнеспособности клетки [19], значения изменений каждого из этих двух продуктов митохондриальной энергетики различны. В результате возникает необходимость в отдельности рассматривать функцию как образованного митохондриями АТР, так и ΔΨ. Пул АТР в клетке может существенно меняться без особых последствий для жизнеспособности клетки [20], однако до определенных пределов, опускаясь до значений, ниже которых индуцируются дегенеративные процессы. Возможно это связано с чисто химическими изменениями, ибо АТРазная реакция по определению приводит к выделению ионов водорода, которое не может быть не замечено внутриклеточными компонентами. При существенном падении уровня АТР из-за несоответствия малого уровня генерации и большого использования АТР в клетке, будет наблюдаться внутриклеточный ацидоз, ибо в этих условиях внутриклеточные рН буферы могут существенно истощиться. Учитывая, что даже при значительных изменениях уровня АТР в клетке (до 1 мМ концентраций) почти все АТР-потребляющие компоненты остаются насыщенными по АТР (ибо константы Михаэлиса по АТР для АТР потребляющих систем находятся в микромолярном диапазоне), видимо не сам АТР, а продукты его гидролиза являются теми регуляторами, которые определяют жизнеспособность клетки. Остается открытым, почему клетка содержит такое высокий уровень АТР. Отметим, что деградация АТР приводит не только к ацидозу, но и к возможному повышению уровня как АДР, так и АМР, а последний нуклеотид является важным компонентом внутриклеточной регуляции за счет активации АМР киназы [21]. В любом случае, гомеостаз АТР, хотя и в достаточно широких пределах, является жизненно необходимым атрибутом клетки. По предположениям [19] в клетке существует АТР-метер, который отвечает даже на кратковременные сильные падения уровня АТР гибелью клетки. Но опять же, допустимые вариации уровня АТР существенно большие чем допустимые вариации значения мембранного потенциала и причина этого должна быть выяснена. Более того, важен фактор времени, то есть допустимого времени пребывания системы в условиях пониженных значений того, или другого фактора (АТР или ΔΨ) без видимых для исследователя фатальных клеточных последствий. Основная задача, которая ставится в этой части проекта, в основном методического плана – как правильно измерять ΔΨ. Вторая задача в этой части аналитическая для получения ответа на вопрос: для чего вообще нужен ΔΨ. Этот вопрос при кажущейся однозначности ответа, на самом деле очень не тривиален, ибо сам факт, что в условиях аноксии, когда митохондрии с биоэнергетической точки зрения мертвы, они все же сохраняют значения ΔΨ за счет гидролиза клеточного АТР [22] достаточно поразителен. При этом клеточный АТР в самом начале процесса сохраняется на догипоксическом уровне, да и после меняется не столь значительно. Это свидетельствует о том, что мембранный потенциал нужнее чем уровень АТР в клетке, и это значит, что мембранный потенциал нужен не только для синтеза АТР. А вот для чего нужен мембранный потенциал, необходимо понять. Такой анализ необходим прежде всего для понимания, каким образом можно сохранить функциональность митохондрии, а, следовательно, и клетки. Связанной с этой задачей оказывается и роль широко рекламируемого механизма ограничения питания, как средства продолжения жизни, и, как было показано впоследствии, как терапевтическое средство при разного рода болезнях [23]. Этот принцип был доказан для подавляющего большинства живых организмов, и осталось лишь его доказать для человека, хотя по этому поводу идут активные споры. Не пытаясь конкурировать с мировыми лидерами на предмет выяснения тонких механизмов активации прожизненных функций через ограничение диеты и используя знания лишь о ключевых моментах метаболизма, активируемых при ограничении по калориям, таких как активация деацетилаз (Sirt1-6) и АМРК и уменьшение активности mTOR сигнального пути и первые намеки на связь патологий и старения с процессом митофагии, и учитывая наши данные о том, что повышенное ацетилирование белков может быть характеристикой старения (Jankauskas et al. Sci.Rep. in press), мы в будущем проекте запланировали провести некоторые параллели между состоянием патологии (например при ишемической атаке), уровнем ацетилирования и лизосомальной активностью при ограничении диеты. На модельных системах (клеточных культурах) такая же параллель будет проведена между ограничением доступа к питательным субстратам и результатом воздействия моделей повреждения (например при кислородно- глюкозной депривации), что примерно соответствует ишемической атаке. Полнота исследования активности аутофагии будет определяться ресурсной доступностью к возможной идентификации того или иного компонента аутофагии, равно так же это будет касаться идентификации сиртуинов (как цитоплазматических, так и цитозольных), но как минимум уровень валовый уровень ацетилирования в клетке и может быть в ее компартментах будет определен в норме и патологии, идущей с участием окислительного стресса +/- ограничение животных и клеток по питанию. Мы вправе ожидать, что ограничение по диете приведет к уменьшению очага поражения в модели ишемического инсульта мозга и уменьшении степени почечной недостаточности при ишемии почки. При этом мы ожидаем получить в ткани ограниченных по питанию крыс уменьшение ацетилирования белков и серьезные изменения процесса митофагии, отмеченной по индикаторам ее активности и на основании ультраструктурных данных, полученных на уровне электронной микроскопии. Как и на предыдущей стадии проекта, мы продолжим исследования по возможной модификации систем ишемического прекондиционирования с целью улучшения ее эффективности, хотя по нашим, пока умозрительным данным, у этих подходов существует некоторый «потолок» защиты, повысить который пока не удается (это касается прежде всего ишемического поражения мозга, полное восстановление которого на сегодняшний день невозможно). Мы предполагаем лишь начать исследования по комбинации разных защитных факторов (ишемическая короткая и длительная пре- и пост-кондиция, фармакологическое прекондиционирование , использование клеточных технологий и пр.) полностью отдавая себе отчет, что на выполнение всех комбинаций имеющегося у нас арсенала защитных факторов потребуется времена, очень существенно превышающие время, данное на выполнение данного проекта. Результатом должно быть достижение указанного умозрительного «потолка» с минимальными хирургическим вмешательствами, а может быть и его превышение, если прогресс по внедрению клеточных технологий позволит это сделать. ЛИТЕРАТУРА 1: Zorov DB, Popkov VA, Zorova LD, Vorobjev IA, Pevzner IB, Silachev DN, Zorov SD, Jankauskas SS, Babenko VA, Plotnikov EY. Mitochondrial Aging: Is There a Mitochondrial Clock? J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2016 Dec 7. pii: glw184. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 27927758. 2: Babenko VA, Silachev DN, Zorova LD, Pevzner IB, Khutornenko AA, Plotnikov EY, Sukhikh GT, Zorov DB. Improving the Post-Stroke Therapeutic Potency of Mesenchymal Multipotent Stromal Cells by Cocultivation With Cortical Neurons: The Role of Crosstalk Between Cells. Stem Cells Transl Med. 2015 Sep;4(9):1011-20. 3: Silachev DN, Plotnikov EY, Pevzner IB, Zorova LD, Babenko VA, Zorov SD, Popkov VA, Jankauskas SS, Zinchenko VP, Sukhikh GT, Zorov DB. The mitochondrion as a key regulator of ischaemic tolerance and injury. Heart Lung Circ. 2014 Oct;23(10):897-904 4: Zorov DB, Juhaszova M, Sollott SJ. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiol Rev. 2014 Jul;94(3):909-50. 5: Plotnikov EY, Morosanova MA, Pevzner IB, Zorova LD, Manskikh VN, Pulkova NV, Galkina SI, Skulachev VP, Zorov DB. Protective effect of mitochondria-targeted antioxidants in an acute bacterial infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 13;110(33):E3100-8. 6: Plotnikov EY, Pulkova NV, Pevzner IB, Zorova LD, Silachev DN, Morosanova MA, Sukhikh GT, Zorov DB. Inflammatory pre-conditioning of mesenchymal multipotent stromal cells improves their immunomodulatory potency in acute pyelonephritis in rats. Cytotherapy. 2013 Jun;15(6):679-89. 7: Plotnikov EY, Chupyrkina AA, Jankauskas SS, Pevzner IB, Silachev DN, Skulachev VP, Zorov DB. Mechanisms of nephroprotective effect of mitochondria-targeted antioxidants under rhabdomyolysis and ischemia/reperfusion. Biochim Biophys Acta. 2011 Jan;1812(1):77-86. 8: Zorov DB. Amelioration of aminoglycoside nephrotoxicity requires protection of renal mitochondria. Kidney Int. 2010 May;77(10):841-3. 9: Juhaszova M, Zorov DB, Yaniv Y, Nuss HB, Wang S, Sollott SJ. Role of glycogen synthase kinase-3beta in cardioprotection. Circ Res. 2009 Jun 5;104(11):1240-52. 10: Zorov DB, Juhaszova M, Yaniv Y, Nuss HB, Wang S, Sollott SJ. Regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc Res. 2009 Jul 15;83(2):213-25. 11: Plotnikov EY, Kazachenko AV, Vyssokikh MY, Vasileva AK, Tcvirkun DV, Isaev NK, Kirpatovsky VI, Zorov DB. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney. Kidney Int. 2007 Dec;72(12):1493-502. 12: Juhaszova M, Zorov DB, Kim SH, Pepe S, Fu Q, Fishbein KW, Ziman BD, Wang S, Ytrehus K, Antos CL, Olson EN, Sollott SJ. Glycogen synthase kinase-3beta mediates convergence of protection signaling to inhibit the mitochondrial permeability transition pore. J Clin Invest. 2004 Jun;113(11):1535-49. 13: Zorov DB, Filburn CR, Klotz LO, Zweier JL, Sollott SJ. Reactive oxygen species (ROS)-induced ROS release: a new phenomenon accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocytes. J Exp Med. 2000 Oct 2;192(7):1001-14. 14: Kuzminova AE, Zhuravlyova AV, Vyssokikh MYu, Zorova LD, Krasnikov BF, Zorov DB. The permeability transition pore induced under anaerobic conditions in mitochondria energized with ATP. FEBS Lett. 1998 Sep 4;434(3):313-6. 15: Zorov DB. Mitochondrial damage as a source of diseases and aging: a strategy of how to fight these. Biochim Biophys Acta. 1996 Jul 18;1275(1-2):10-5. 16: Mitchell, P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Biol Rev Camb Philos Soc 1966; 41(3): 445-502. 17: Zamzami, N., P. Marchetti, M. Castedo, D. Decaudin, A. Macho, T. Hirsch, S. A. Susin, P. X. Petit, B. Mignotte and G. Kroemer. Sequential reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxygen species in early programmed cell death. J Exp Med. 1995; 182(2): 367-377. 18: Yaniv, Y., M. Juhaszova, H. B. Nuss, S. Wang, D. B. Zorov, E. G. Lakatta and S. J. Sollott. Matching ATP supply and demand in mammalian heart: in vivo, in vitro, and in silico perspectives. Ann N Y Acad Sci 2010; 1188: 133-142. 19: Izyumov, D. S., A. V. Avetisyan, O. Y. Pletjushkina, D. V. Sakharov, K. W. Wirtz, B. V. Chernyak and V. P. Skulachev (2004). ""Wages of fear": transient threefold decrease in intracellular ATP level imposes apoptosis." Biochim Biophys Acta 1658(1-2): 141-147. 20: Ataullakhanov, F. I. and V. M. Vitvitsky (2002). What determines the intracellular ATP concentration. Biosci Rep 22(5-6): 501-511. 21: Kemp, B. E., K. I. Mitchelhill, D. Stapleton, B. J. Michell, Z. P. Chen and L. A. Witters. Dealing with energy demand: the AMP-activated protein kinase. Trends Biochem Sci 1999; 24(1): 22-25. 22: Di Lisa, F., P. S. Blank, R. Colonna, G. Gambassi, H. S. Silverman, M. D. Stern and R. G. Hansford. Mitochondrial membrane potential in single living adult rat cardiac myocytes exposed to anoxia or metabolic inhibition. J Physiol 1995; 486 (Pt 1): 1-13. 23: Lee C, Longo V. Dietary restriction with and without caloric restriction for healthy aging. F1000Res. 2016 Jan 29;5. pii: F1000 . doi:10.12688/f1000research.7136.1. eCollection 2016.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Работа состояла из двух элементов – экспериментального и аналитического, взаимно дополняющих друг друга. Целью работы была оценка роли митохондрий в патологических процессах с акцентом на роли митохондрий и способах репарации системы и возвращение ее в норму. Один из аспектов работы – оценка факторов, принимающих участие в процессе старения, меняющего ход протекания патологий, которые достаточно легко репарируются в молодой системе. В частности, было показано, что подход ишемического прекондиционирования почки, который защищает молодую почку от длительного ишемического воздействия, становится совершенно неэффективным и даже вредным применительно к старческой почке. Предполагаемые причины такой потери ишемической толерантности через адаптивные перестройки видимо лежат в утрате системы репарации, в частности лишь частичном устранении поврежденных структур, например нефункциональных митохондрий. При этом наблюдается сосуществование нормальной и патологической митохондриальных субпопуляциях. Важную роль в устранении нефункциональных митохондрий играет значение митохондриального мембранного потенциала. На этом построена система проверки качества митохондрий. У старческих организмов или организмов, имеющих признаки преждевременного старения, в клетках элементы, отвечающие за аутофагию/митофагию и активность лизосомальных систем работают с меньшей активностью, при этом в клетках почек старых животных появляется субпопуляция митохондрий со сниженным митохондриальным мембранным потенциалом, что очевидно является опасным для общего функционирования клетки. Сделан вывод, что процесс старения сопровождается падением эффективности оценки качества митохондрий. В работе выявлен биохимический маркер, уровень которого возрастает при старении, а именно уровень ацетилирования ядерных белков, который возрастает в клетках старых крыс или в клетках крыс, имеющих признаки преждевременного старения (линии OXYS). В работе отмечена важная функция митохондриального мембранного потенциала, который даже в условиях ишемии/гипоксии, когда митохондрия не функционирует как генератор ATP, она поддерживает мембранный потенциал за счет гидролиза клеточного АТР, столь необходимого для всей клетки в условиях гипоксического кризиса. Такое эгоистическое поведение митохондрий с нашей точки зрения является атавистическим признаком, присущим прародителям митохондрии – бактериям. Сделано предположение, что поддержание гомеостаза мембранного потенциала необходимо для сохранения активной системы транспорта ряда белков в митохондриях и для организации защиты митохондриального генома от внедрения чужеродных нуклеиновых кислот, в частности вирусного происхождения. Учитывая важность величины митохондриального мембранного потенциала, мы даем рекомендации по его измерению с рассмотрением всех возможных погрешностей и артефактов в его определении. Важная роль митохондрий в исполнении альтернативных, неэнергетических функций проявилась и в исследованиях по межклеточному переносу митохондрий, из чего следовал вывод о возможности рассматривать трансплантацию митохондрий как потенциальный метод лечения патологий, в частности патологий почек. Учитывая, что патологии почек новорожденных вносят весомый вклад в структуру смертности неонаталов, мы предложили использовать не классические маркеры почечной недостаточности (креатинин и мочевина), а ранние маркеры почечного повреждения. Среди них были нами были опробованы KIM-1 и NGAL, которые выявлялись в моче неонатальных крыс, подверженных воздействию, имитирующему сепсис. При этом даются рекомендации по использованию модели неонатальных крыс для адекватного использования в клинической неонатологии. Для этого было проведено сравнение нефрогенеза у новорожденных крыс и человека с учетом разных сроков протекания беременности. Одновременно был проведен анализ по возможности применения поликатионов (например, спермина или спермидина) на жизнедеятельность различных клеток, сделав акцент на их эффектах на репродуктивных органах, включая их эффекты на раннее и позднее развитие эмбриона. Особенное внимание мы уделили тому, что при повреждении ткани (в частности почки) в условиях ишемии одной из первичных мишеней становятся эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, что отражается в резком изменении ультраструктуры митохондрий этих клеток. Мы предполагаем, что такие изменения митохондрий могут сигнализировать вглубь ткани, что приведет к изменению функционирования всей ткани.

 

Публикации

1. Зоров Д.Б., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Попков В.А., Силачев Д.Н., Зоров С.Д., Бабенко В.А., Янкаускас С.С., Плотников Е.Ю. Значение митохондриального мембранного потенциала Сборник статей Международной конференции Рецепторы и внутриклеточная сигнализация Пущино. 22-25 мая 2017 г., с. 611-615 (год публикации - 2017)

2. Зоров Д.Б., Попков В.А., Зорова Л.Д., Воробьев И.А., Певзнер И.Б., Силачев Д.Н., Зоров С.Д., Янкаускас С.С., Бабенко В.А., Плотников Е.Ю. Mitochondrial Aging: Is There a Mitochondrial Clock? Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences, 72(9): 1171-1179 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1093/gerona/glw184

3. Зорова Л.Д., Попков В.А., Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Певзнер И.Б., Янкаускас С.С., Бабенко В.А., Зоров С.Д., Балакирева А.В., Юхасова М., Солотт С.Д., Зоров Д.Б. Mitochondrial membrane potential Analytical Biochemistry, S0003-2697(17)30293-2 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.ab.2017.07.009

4. Попков В.А., Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Янкаускас С.С., Зоров С.Д., Андрианова Н.В., Бабенко В.А. , Зоров Д.Б. Bacterial Therapy and Mitochondrial Therapy Biochemistry (Moscow), 82 (12): 1549-1556 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1134/S0006297917120148

5. Янкаускас С.С., Андрианова Н.В., Алиева И.Б., Прусов А.Н., Мациевский Д.Д., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Савченко Е.С., Пирогов Ю.А., Силачев Д.Н., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Дисфункция эндотелия почки при ишемии/реперфузии и ее предотвращение с помощью митохондриально-направленных антиоксидантов Биохимия, Том 82 номер 1: с.51-63 (год публикации - 2017)

6. Янкаускас С.С., Зорова Л.Д., Андрианова Н.В., Певзнер И.Б., Попков В.А., Силачев Д.Н., Колосова Н.Г., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Инактивация аутофагии, накопление дисфункциональных митохондрий и увеличение ацетилирования белков в ткани почки при нормальном и преждевременном старении связано со снижением нефропротекторного потенциала Сборник статей Международной конференции Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Пущино 22−25 мая 2017 г, с.658-663 (год публикации - 2017)

7. Янкаускас С.С., Певзнер И.Б., Андрианова Н.В., Зорова Л.Д., Попков В.А., Силачев Д.Н., Колосова Н.Г., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. The age-associated loss of ischemic preconditioning in the kidney is accompanied by mitochondrial dysfunction, increased protein acetylation and decreased autophagy. Scientific Reports, 7:44430 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1038/srep44430

8. Зорова Л.Д., Попков В.А., Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Певзнер И.Б., Янкаускас С.С., Зоров С.Д., Бабенко В.А., Зоров Д.Б. Функциональная значимость митохондриального мембранного потенциала Биологические мембраны, Том 34, № 6, с. 93–100 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.7868/S0233475517060020

9. Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Павленко Т.А., Павлова В.С., Крючко Д.С., Зубков В.В., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Острое повреждение почек у новорожденных. От эксперимента к клинике Неонатология: новости, мнения, обучение, 2017 № 4. с. 58-63 (год публикации - 2017)

10. Силачёв Д.Н., Плотников Е.Ю., Горюнов К.В., Романов А.Ю., Плосконос М.В., Долгушина Н.В., Николаев А.А., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Роль полиаминов в жизнедеятельности клеток репродуктивной системы Цитология, - (год публикации - 2017)

11. Плотников Е.Ю., Бабенко В.А., Силачев Д.Н., Певзнер И.Б., Зорова Л.Д., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Восстановление энергетического метаболизма нейронов и астроцитов при передаче митохондрий из мультипотентных стромальных клеток Гены и клетки. Материалы III Национального конгресса по регенеративной Медицине Москва, 15–18 ноября 2017 года, Том XII, № 3,с.194-195 (год публикации - 2017)

12. Плотников Е.Ю., Янкаускас С.С., Зорова Л.Д., Андрианова Н.В., Певзнер И.Б., Попков В.А., Силачёв Д.Н., Колосова Н.Г., Зоров Д.Б. Механизмы возраст-зависимого снижения ишемической толерантности почки ХХIII Съезд Российского физиологического общества им. И.П. Павлова, УДК: 577.24; 616.61 с.1659-1661 (год публикации - 2017)

13. Силачев Д.Н., Савченко Е.С., Бабенко В.А., Певзнер И.Б., Зорова Л.Д., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Исследования обмена цитоплазматическим содержимым между клетками нейроваскулярной единицы XIII Международный междисциплинарный конгресс Нейронаука для медицины и психологии. Сборник материалов конгресса., с. 373-374 (год публикации - 2017)

14. - Объяснена беззащитность почек пожилых пациентов Сетевое издание Indicator (Индикатор), - (год публикации - )

15. - Ученые МГУ выяснили, почему почки у пожилых людей уязвимы Научная Россия, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Используя крыс линии OXYS, имеющих признаки преждевременного старения, был изучен нефропротекторный эффект ограничения калорийности рациона и ишемического прекондиционирования на острую почечную недостаточность, вызванную ишемическим воздействием со сравнением этих эффектов у нормальных беспородных животных. Ишемия почки приводила к повышению в крови продуктов азотистого обмена (кретианина и мочевины). Уменьшение потребляемой пищи для обоих групп животных в течение 4 недель приводило к более чем двукратному снижению креатинина у ишемизированных животных. Это доказывает, что ограничение по питанию обладает мощным нефропротекторным потенциалом и способно уменьшать тяжесть повреждения почки даже у крыс с возрастными изменениями в почечной ткани. Была оценена эффективность ишемического прекондиционирования для предотвращения ишемических последствий, и было отмечено, что в то время как у молодых беспородных животных ишемическая тренировка приводит к снижению почечной недостаточности, у крыс, несущих старческий фенотип, таких защитных функций не отмечалось. Для объяснения отсутствия защитного эффекта ишемической тренировки мы проанализировали компоненты лизосомально-аутофагосомальной системы. Анализ показал, что ишемизация ткани нормальных животных приводит к активации системы аутофагии, явно вызванной повреждением. При этом ишемическое прекондиционирование в почке беспородных крыс уменьшает активность лизосом, но не уменьшает ее в почках крыс OXYS, при этом содержание маркеров аутофагии, например, beclin-1, остается таким же, как и у молодых беспородных крыс, однако, содержание изоформ белка LC3 отличается. Было показано, что снижается как уровень LC3 I, так и LC3 II, что может свидетельствовать об уменьшении в клетках почечной ткани компонентов системы аутофагии, что характерно для тканей стареющего организма. Уровень белка PINK-1 во фракции митохондрий также оказался выше у крыс линии OXYS, что может свидетельствовать о нарушениях в работе системы ауто/митофагии. Таким образом, мы показали, что ишемическое прекондиционирование не обладает значимым нефропротекторным потенциалом для защиты старого организма, в отличие от ограничения питания, которое значительно уменьшает тяжесть почечного повреждения у преждевременно стареющих крыс линии OXYS. Исследование влияния клеточных технологий на почечное повреждение показало, что репаративный и пролиферативный потенциал мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток (ММСК) из костного мозга животных, равно как и уровень продукции этими клетками активных форм кислорода (АФК) в их митохондриях, заметно снижается с возрастом. Это указывает на возможность повреждения митохондрий стволовых клеток по мере их старения, или может свидетельствовать о накоплении поврежденных митохондрий в результате неэффективной работы системы удаления поврежденных органелл в результате дисфункции системы контроля качества митохондрий. Обнаруженная аккумуляция в ММСК маркера клеточного старения липофусцина напрямую указывает на старение этой клеточной популяции по мере увеличения возраста донора и на неэффективность систем аутофагии и/или протеасомальной деградации поврежденных компонентов клеток. Более выраженное накопление липофусцина наблюдалось при длительном культивировании ММСК, что указывает на развитие феномена клеточного сенесценса in vitro, что совершенно очевидно ограничивает возможности наращивания значительных количеств ММСК для терапевтического использования. Отметив ранее репарирующее влияние транспорта митохондрий между клетками, мы оценили возможность межклеточного обмена митохондрий между ММСК от молодых животных и астроцитами, а также вклад межклеточного транспорта митохондрий в терапевтическую эффективность ММСК при ишемии головного мозга. Основываясь на морфологии клеток и частоте перемещения митохондрий, измеренного при помощи разного типа митохондриальных зондов, включая трансфекцию митохондриально-направленным зеленым флуоресцентным белком, мы доказали, что происходит межклеточный транспорт митохондрий из ММСК в нейроны при полном отсутствии переноса в обратном направлении. То же самое наблюдалось при сокультивации ММСК с астроцитами. Мы предположили, что наблюдаемый нами феномен является неотъемлемой частью физиологии ММСК, выработанной эволюционно и, возможно, этот процесс имеет в первую очередь функциональное значение при патологических условиях, например, при ишемическом повреждении органа. Для проверки данной гипотезы мы моделировали условия ишемии in vitro путем подвержения воздействию кислородно-глюкозной депривации (КГД) с последующим сокультивированием с ММСК. В результате КГД происходила фрагментация митохондриальной сети, что указывало на их повреждение. Было обнаружено, что в культуре астроцитов, подвергнутых КГД, при сокультивировании с ММСК значительно увеличивалась популяция астроцитов, получивших митохондрии от ММСК. Таким образом, повреждение митохондрий в результате гипоксии/ишемии в клетках-реципиентах стимулирует транспорт функциональных митохондрий из ММСК. Исходя из этого, мы предположили, что митохондриальная дисфункция запускает определенные механизмы, отвечающие за межклеточную коммуникацию и транспорт митохондрий из окружающих клеток. Проверку данной гипотезы мы проводили на клетках, в митохондриях которых отсутствует или повреждена мтДНК. Сокультивирование ρ0 РС12 клеток с ММСК приводило к значительному росту популяции клеток, получивших митохондрии от ММСК, по сравнению с сокультивированием ММСК с нативными клетками РС12. Важный функциональный результат транспорта митохондрий из ММСК заключался в восстановлении митохондриальных функций клеток-реципиентов, что было видно по уменьшению генерации ими лактата в клетках и повышении их пролиферирующей активности. Сокультивирование ММСК, имеющих повышенную экспрессию моторного белка, ответственного за внутриклеточный транспорт митохондрий (Miro1), с первичной культурой астроцитов приводило к увеличению межклеточного транспорта митохондрий от ММСК к астроцитам, и при трансплантации таких Miro1-ММСК животным с экспериментальным инсультом, их нейропротекторный эффект был выше по сравнению с нативными ММСК, о чем говорил целый ряд неврологических тестов, проведенных с этими животными. Мы заключаем, что межклеточный транспорт митохондрий от ММСК к нейральным клеткам играет ключевую роль в проявлении нейропротекторных эффектов ММСК при экспериментальном ишемическом инсульте. При изучении патогенных свойств активных форм кислорода (АФК) при экспериментальном инсульте новорожденных мы обнаружили повышенный вдвое уровень генерации АФК и существенную деполяризацию/деэнергизацию митохондрий, сопровождающую ишемическое повреждение. Инъекция митохондриально-направленного антиоксиданта SkQR1 сразу после окончания гипоксии приводила к снижению неврологического дефицита крысят. Мы заключаем что неонатальная гипоксия-ишемия вызывает дисфункцию митохондрий, которая может быть уменьшена введение митохондриально-направленных антиоксидантов, снижающих объем повреждения мозга и восстанавливающих неврологические функции, что свидетельствует о патологической роли митохондриальных АФК в процессе повреждения головного мозга новорожденных после ишемического воздействия. В аналитической части проекта, посвященной анализу эффекта возрастных изменений в организме на прохождение сигналов в защитной клеточной сигнализации, были даны предложения по выходу из тупиковой ситуации, при которой исследования проводятся на молодых организмах, в то время как в клинике преобладают пожилые индивидуумы, к которым слишком часто не применимы рекомендации, сделанные в результате работы на молодых организмах. Мы предложили использовать комбинированный подход с акцентом на использование фармакологических препаратов, имеющих направленное митохондриальное воздействие (либо за счет осуществления антиоксидативной функции, либо за счет мягкого разобщения, когда немного снижается значение митохондриального мембранного потенциала, в то же время оставаясь на уровне, необходимых для осуществления синтеза АТР) и некоторые другие подходы, которые находятся в разработке. Одновременно мы даем рекомендации по увеличению внимания к исследованиям, где в качестве испытуемых находятся старые индивидуумы или работы на моделях преждевременного старения (например крыс линии OXYS).

 

Публикации

1. Бабенко ВА, Силачев ДН, Попков ВА, Зорова ЛД, Певзнер ИБ, Плотников ЕЮ, Сухих ГТ, Зоров ДБ Miro1 Enhances Mitochondria Transfer from Multipotent Mesenchymal Stem Cells (MMSC) to Neural Cells and Improves the Efficacy of Cell Recovery Molecules, 23(3). pii: E687 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3390/molecules23030687

2. Силачев ДН, Плотников ЕЮ, Певзнер ИБ, Зорова ЛД, Балакирева АВ, Гуляев МВ, Пирогов ЮА, Скулачев ВП, Зоров ДБ Neuroprotective Effects of Mitochondria-Targeted Plastoquinone in a Rat Model of Neonatal Hypoxic⁻Ischemic Brain Injury. Molecules, 23(8). pii: E1871 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3390/molecules23081871

3. Янкаускас СС, Силачев ДН, Андриянова НВ, Певзнер ИБ, Зорова ЛД, Попков ВА, Плотников ЕЮ, Зоров ДБ Aged kidney: can we protect it? Autophagy, mitochondria and mechanisms of ischemic preconditioning Cell Cycle, 17(11):1291-1309 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1080/15384101.2018.1482149

4. Андрианова Н.В., Янкаускас С.С., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Попков В.А., Силчев Д.Н., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Influence of dietary restriction on the severity of acute kidney injury in young and old animals Abstracts book "Sechenov International Biomedical Summit 2018", p. 25 (год публикации - 2018)

5. Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю., Силачев Д.Н., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Бабенко В.А., Попков В.А., Зоров С.Д., Андрианова Н.В., Данилина Т.И., Марков А.В. Критические функции митохондрий в возникновении патологий Сборник тезисов II Всероссийская научная конференция с международным участием "Механизмы регуляции функций органелл эукариотической клетки", с. 41-43 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.31255/978-5-94797-318-1-41-43

Возможность практического использования результатов
не указано