Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2016-2017 отчётном году в рамках выполняемого проекта разработан подход к идентификации группы опухолей CIMP (CpG island promoter phenotype)-подобного (HM+) фенотипа, основанный на анализе глобальных профилей метилирования CpG-сайтов, который могут быть получены как с помощью метил-чувствительных микрочипов, так и посредством бисульфитного секвенирования генома (WGBS) с возможным обогащением CpG-содержащих участков (RRBS, promoter enrichment). Подход предполагает анализ уровня метилирования (β-value) набора маркерных CpG-сайтов в опухолевом образце. Данный подход применим для различных видов рака, однако конкретный выбор маркерных сайтов зависит от типа опухоли. По результатам анализа метиломных данных The Cancer Genome Atlas (TCGA) для рака толстой кишки (РТК), наилучшим критерием отбора маркерных сайтов для РТК может служить то, что: 1) CpG сайт аннотирован, как минимум, в 2 из 6 клеточных линий как промотор, по данным ENCODE; 2) принадлежит к топ 10% дифференциально метилируемых сайтов в опухоли, по данным TCGA. Далее именно эти сайты (порядка нескольких тысяч) используются для метиломного анализа конкретного образца (в частности, на метил-чувствительных микрочипах Illumina). В случае, если медиана уровня метилирования маркерных сайтов превышает пороговое значение, образец, наиболее вероятно, относится к группе CIMP-подобных опухолей. По данным TCGA, критерии отбора маркерных CpG-сайтов для других видов рака (размер топ-листа, требования к аннотации сайта как промотора или энхансера) могут значительно отличаться. Нами проведён детальный анализ взаимосвязи между наличием различных драйверных мутаций в опухолевом образце и установлением CIMP-подобного фенотипа. При помощи Oncotator, включающего алгоритм поиска драйверных мутаций и генов MutSig, отобраны гены, которые являются потенциальными драйверами развития рака толстой кишки (KRAS, BRAF, APC, TP53 и другие), по данным TCGA. Для этих генов проведён корреляционный анализ между присутствием несинонимичных мутаций в опухоли и медианой уровня метилирования по маркерному набору CpG-сайтов как признака наличия CIMP-фенотипа (проанализированы разные критерии отбора маркерных сайтов). Показано, что развитие CIMP-подобного фенотипа может часто сопровождаться мутациями в BRAF, RNF43, ARID1A, MUC6 и обратно коррелирует с наличием мутаций в TP53, APC (p < 0.001). Это хорошо согласуется с современными представлениями о путях развития CIMP-фенотипа рака толстой кишки. Далее на основе данных TCGA был проведён анализ изменений экспрессии генов, участвующих в различных биологических процессах и сигнальных путях, в CIMP-подобных опухолях по сравнению с остальным пулом опухолевых образцов. Показано, что рост общего уровня метилирования маркерных сайтов в РТК сопровождается значительными изменениями уровня экспрессии генов, участвующих в различных биологических процессах: сигнальном пути TNF, сфинголипоидного метаболизма и сфинголипоидных сигнальных путей, гликолиза, иммунном ответе и воспалении (повышение экспрессии); цистеинового, тауринового и метионинового метаболизма, в путях PPAR, пероксисоме (снижение экспрессии); дерегуляция клеточного цикла, МАРК-каскада, р53, Hippo, HIF1A, цАМФ-зависимых путей. Такой анализ был проведён и для других видов опухолей, данные по которым доступны в TCGA. Наиболее близким к РТК по категориям биологических процессов, (ин)активируемых в CIMP-подобных опухолях, показала себя аденокарцинома желудка, лёгкого, а также рак пищевода, рак области головы и шеи. Анализ перепредставленности сайтов связывания транскрипционных факторов выполненный для генов, оверэкспрессируемых в CIMP-подобных опухолях по сравнению с остальным пулом опухолевых образцов, позволяет сделать предположение о том, что за наблюдаемые транскриптомные изменения могут отвечать такие игроки как бета-катенин CTNNB1, а также транскрипционные факторы IRF1, SOX2, KLF4, STAT1/2, SP1, THRB, CREB2; не исключена роль микроРНК hsa-miR-130ab, 148ab, 152, 99ab, 100, 221. Методом количественной ПЦР проведена оценка уровня экспрессии генов HK1, HK2 и HK3 в 78 парных образцах РТК. Выявлено значительное снижение экспрессии гена HK2 в 56% образцов РТК от 2 до 110 раз и повышение экспрессии в 24% образцов от 2 до 17 раз. Показано повышение экспрессии гена HK3 в 41% образцов РТК от 2 до 12 раз, и снижение экспрессии в 14% случаев от 2 до 73 раз. Для оценки гипотезы о том, что некоторые драйверные мутации могут приводить к установлению HM+ фенотипа, создана клеточная линия РТК SW480, постоянно экспрессирующая мутантный белок BRAF (V600E). Проведена оценка статуса метилирования промоторной области генов MGMT и MLH1 – стандартных маркеров HM+ фенотипа в этой клеточной линии. Выявлено, что метилирование генов MGMT и MLH1 в клеточной линии SW480, экспрессирующей мутантный белок BRAF (V600E), не изменяется по сравнению с контрольной клеточной линией.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2017 – 2018 отчетном году было завершено формирование коллекции охарактеризованных парных образцов РТК. Методом количественной ПЦР проведена оценка уровня экспрессии генов HK1, HK2, HK3 и HK4 (GCK) в образцах РТК. Выявлено преимущественное снижение экспрессии HK2 и HK4 (в среднем более 2 раз) и дерегуляция HK1 и HK3. Также выявлено, что уровень мРНК HK1 и HK2 в опухоли в 40-50 раз превосходит экспрессию HK3 и порядка 1000 раз – экспрессию HK4 (GCK). Для оценки гипотезы о том, что некоторые драйверные мутации могут приводить к установлению HM+ (CIMP-H) фенотипа, созданы клеточные линии РТК SW480, постоянно экспрессирующие мутантный белок IDH1 (R132H) и IDH2 (R140Q). Оценка статуса метилирования промоторных областей восьми маркерных генов CIMP фенотипа (MLH1, CACNA1G, IGF2, NEUROG1, RUNX3, SOCS1, CDKN2A/p16, CRABP1) полученных клеточных линий показал слабый вклад введенных генов IDH1 и IDH2, содержащих мутации, в установку CIMP фенотипа при колоректальном раке. Показано, что гликолитическая емкость опухолевых клеток в линии SW480 с IDH1-R132H и IDH2-R140Q ниже, чем в контрольной линии SW480. Значение ECAR, характеризующее скорость закисления внеклеточной среды, снижается в опухолевых клетках IDH1-R132H и IDH2-R140Q по сравнению с контрольными. Таким образом, в опухолевых клетках линии SW480 введение мутации IDH1-R132H и IDH2-R140Q приводит к замедлению процессов анаэробного гликолиза. Полученные данные позволяют предположить, что гены IDH1 и IDH2 могут быть вовлечены в регуляцию интенсивности гликолиза в опухолевых клетках толстой кишки. Транскриптомный анализ был проведён для 3 биологических повторностей каждого условия: 1) клетки, трансфецированные пустой кассетой; 2) клетки, трансфецированные геном IDH1, содержащим мутацию c.395G>A (R132H); 3) геном IDH1 дикого типа; 4) клетки, трансфецированные геном IDH2 с заменой c.419G>A (R140Q); 5) геном IDH2 дикого типа. Было получено 18-31 млн. ридов на каждую биологическую повторность. При сравнении транскриптома клеток, трансфецированных мутантным IDH1 (IDH1-mut) с клетками, получившими кассету с IDH1 дикого типа (IDH1-wt), выявлено 135 дифференциально экспрессных генов (ДЭГ), прошедших установленные пороги. Анализ перепредставленности выявил обогащённость списка ДЭГ участниками метаболизма N-гликанов, фолдинга белков, кальциевого сигналинга, генов окислительного фосфорилирования (включая митохондриальные гены MT-ND1, MT-ND3). Тем не менее, результаты GSEA анализа говорят лишь о расфокусированном характере влияния IDH1-mut на транскриптом: для категорий GO и путей KEGG и Reactome значения p-value (тест Фишера) не превосходили по значимости уровень 0.001 (при ярких транскриптомных отличиях, например, при сравнении опухоли с нормой значения p-value могут достигать 10-15 и ниже). Помимо этого, отмечено повышение длинной некодирующей РНК MALAT1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1). Картина дифференциальной экспрессии, вызываемой трансфекцией IDH2-mut (по сравнению с IDH2-wt), по своим скромным масштабам сходна с эффектом от IDH1-mut. Для этого сравнения выявлено 207 дифференциально экспрессных генов. По результатам теста перепредставленности характер влияния IDH2-mut на транскриптом также нельзя назвать направленным на конкретные биологические процессы. Отмечается перепредставленность генов, участвующих в самых разнообразных клеточных процессах, включая транспорт белков, иммунный ответ, метаболизм аминокислот, модификацию липопротеинов, хемотаксис. Критическим событием в канцерогенезе, вызванное изменениями микробиома, является хроническое воспаление. К настоящему моменту накоплены обширные доказательства роли микробиоты в развитии колоректального рака. Дополнительно, нами была выполнена работа по изучению влияния десинхроноза на кишечную микробиоту.