Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Начат отбор кандидатов из групп профессиональных спортсменов и группы контроля для включения в проводимое исследование. К концу отчетного периода сформирована выборка из 125 человек, удовлетворяющим критериям включения в исследования и давших согласие на участие в запланированных экспериментах. Для кандидатов, включенных в исследования в отчетном году, выполнены антропометрические и физиологические тесты, а также необходимые медицинские исследования. Для группы участников группе численностью в 100 человек выполнено исследование со взятием биопсии латеральной головки четырехглавой мышцы бедра. Были отработаны методики иммуногистохимического анализа для окраски мышечных волокон типа I и II с помощью специфических антител и количественной оценки, мышечной композиции и площади поперечного сечения мышечных волокон разных типов. При помощи разработанной методики был осуществлен анализ соотношения мышечных волокон I и II типов и площади сечения мышечных волокон на всех полученных биоптатах. Полученные данные будут использованы при проведении ассоциативного генетического исследования на всей запланированной выборке на следующем этапе. Предварительный анализ данных по соотношению мышечных волокон I и II типов в пределах проанализированной выборки показал ожидаемые и существенные различия в композиции мышечных волокон при сравнении исследованных участников в пределах трех основных групп: нетренированных людей, спортсменов, тренирующих аэробные возможности (выносливость) и спортсменов, тренирующих скоростные и силовые возможности. Для 96 человек, прошедших исследование со взятием биопсии латеральной головки четырехглавой мышцы бедра, было проведен генетический анализ с использованием ДНК-чипа Illumina Omni Express Exome 8 v1.4 Kit (Illumina, США). Суммарно, для каждого индивидуума были получены данные по 960919 генетическим вариациям. Отработаны методики биоинформатического анализа и процессинга данных, получаемых в рамках выполнения проекта, в том числе, данных высокоплотного генотипирования. Работа в этом отношении была сосредоточена по следующим направлениям: 1) алгоритмы препроцессинга данных генотипирования, полученных с использованием высокоплотных ДНК-чипов; 2) алгоритмы комплексной оценки генетического риска для построения индивидуальных прогнозов; 3) отработка алгоритмов ассоциативного анализа на примере первых полученных данных. По указанным направлениям были получены следующие результаты: 1) Разработан и применен протокол препроцессинга данных генотипирования, полученных при использовании ДНК-чипов, исправляющий аннотационные ошибки данных (координатные ошибки позиционирования полиморфизмов, ошибки указания цепи). Протокол применен для анализа и коррекции данных генотипирования, полученных с использованием ДНК-чипа Illumina Omni Express Exome 8 v1.4 Kit. 2) Разработан набор вспомогательных биоинформатических инструментов для выбора и процессинга данных, опубликованных в каталоге полногеномных ассоциативных исследований (GWAS Catalog) и их последующей интеграции с разными алгоритмами расчета генетического риска: на расчете Байесовской вероятности, аддитивных или мультипликативных моделей. На основании новых данных и ранее полученных нами данных по ассоциативным исследованиям по структуре мышц была построена релевантная модель, прогнозирующая состав мышечных волокон спортсмена на основании комплексного анализа группы полиморфизмов. Разработанная модель построена на основании совокупной оценки информации по полиморфизмам, ассоциированным с различным соотношением мышечных волокон в формате закрытой аддитивной модели. Проверка полученной модели проводилась на испытуемых, для которых на момент выполнения работы уже имелись результаты биопсии мышцы бедра и данные генотипирования. На основании теста точность работы модели (AUC) составила 81% для профессиональных спортсменов и 73% для лиц, не являющихся спортсменами. 3. На основе данных высокоплотного генотипирования 96 образцов была отработана методика и проведено несколько пробных вариантов ассоциативных исследований. В первом варианте, изначально проводили ассоциативный анализ данных генотипирования и показателей состава мышечных волокон. Он выявил большое количество достоверных ассоциаций. После отбора наиболее значимых генетических маркеров (P<10-4) состава мышечных волокон провели дополнительную стратификацию результатов с учетом доступных генетических данных по другим выборкам российских спортсменов разных видов спорта и ограничением списка кандидатных вариантов генами, влияющих на метаболизм, развитие мышечной и нервной ткани, а также участвующих в регуляции генной экспрессии. По итогам такого анализа было выявлено 6 наиболее перспективных генетических вариантов. Во втором варианте, с помощью полногеномного анализа провели сравнение частот аллелей между российскими стайерами и спринтерами. Данные были сопоставлены с аналогичными результатами зарубежных исследований. Результирующий список из 201 генетических вариантов, имеющих одинаковую направленность ассоциаций был добавочно проверен на предмет ассоциации с составом мышечных волокон, на новых оригинальных данных. Было обнаружено 5 генетических вариантов, ассоциированных с составом мышечных волокон, а также предрасположенностью к занятиям спринтом или видами спорта на выносливость. Среди них наиболее интересным маркером является rs6789275 полиморфизм, расположенный с геном MOBP (влияет на миелинизацию нейронов и ассоциируется с моторными белками MYRIP, MYO5A, MYO7A). В дополнение к проведенным пробным ассоциативным исследованиям, данные, полученные при генотипировании новой выборки были использованы для валидации и репликации ранее полученных результатов по ассоциации полиморфизмов гена AGTR2 с проявлениями силовых и скоростных характеристик у европейских и японских спортсменов. В частности, ранее было показано, что полиморфизм rs11091046 гена AGTR2 был ассоциирован со спортивным статусом, показателями выносливости и преобладанием медленных типов мышечных волокон. Новые результаты, полученные на больших по численности выборках, подтвердили ассоциацию этого варианта со спортивным статусом, но только в группе мужчин. Также, в отличие от ранее опубликованных данных, полученных на ограниченных группах, новые результаты свидетельствуют о том, что С вариант полиморфизма rs11091046 в большей степени ассоциирован со скоростными и силовыми способностями. По результатам работ по отчетному этапу подготовлены 2 научных публикации, индексируемых в базе данных «Скопус» (Scopus).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе работ выполненных на отчетном этапе завершен набор участников в экспериментальную группу. Итоговое число отобранных добровольцев, удовлетворяющих критериям включения составило 152 человека, в число которых вошли: профессиональные спортсмены, тренирующие скоростно-силовые качества (спринт, тяжелоатлеты) – 51 человек; профессиональные спортсмены, тренирующие выносливость (стайеры, средние дистанции) - 50 человек; группа контроля (добровольцы, не имеющие спортивного стажа) – 51 человек. Для новых участников исследования были проведены антропометрические исследования, физиологическое тестирование, анкетирование. В пределах доукомплектованной экспериментальной группы, для новых 52 участников проведено исследование со взятием биопсии латеральной головки четырехглавой мышцы бедра и иммуногистохимическим анализом новых образцов биоптатов мышечной ткани. К концу отчетного года получены и обработаны результаты иммуногистохимического анализа мышечных биопсий для всех участников исследования (152 человека): проанализированы показатели соотношения мышечных волокон I и II типа, площади поперечного сечения мышечных волокон. Такого рода данные, полученные в пределах хорошо структурированной выборки спортсменов из РФ имеют большую ценность, как для задач решаемых в рамках текущего проекта, так и для последующих ассоциативных исследований. В ходе отчетного этапа были завершены работы по генотипированию для всех участников экспериментальной группы с использованием высокоплотного ДНК-чипа Illumina Omni Express Exome 8 (Illumina, США), Суммарно, для каждого индивидуума были получены данные по 960919 генетическим вариациям. С использованием сформированной экспериментальной выборки численностью в 152 человека и ранее полученных собственных данных по генотипам профессиональных спортсменов (>1200 человек) выполнены ассоциативные генетические исследования для поиска и характеристики генетических маркеров, ассоциированных с композицией мышечных волокон и другими признаками, информативными для оценки физических качеств: показателями выносливости, быстроты, силы, жировой и безжировой массы тела, максимального потребления кислорода. Результаты первой фазы ассоциативного генетического исследования выявили 27 полиморфных вариантов, достоверно ассоциированных с типом мышечных волокон и 13 полиморфизмов, достоверно ассоциированных показателями площади поперечного сечения мышечных волокон. Для двух из охарактеризованных вариантов rs2977195 и rs979289 были достигнуты показали статистической значимости, удовлетворяющие критериям полногеномных ассоциативных исследований (P< 6*10-9). Полученные на новой экспериментальной выборке результаты ассоциативных исследований были использованы для дальнейшего метаанализа и кросвалидации с использовании других данных, в число которых входили: собственные данные по генотипам 1200 профессиональных спортсменов из РФ, полученные ранее с применением ДНК-чипа HumanOmni1-Quad BeadChips (более 1 млн. SNP, Illumina, США), данные по отдельным генотипам профессиональных спортсменов, предоставленных зарубежными коллабораторами из Японии, Бразилии, Польши, Катара, Швеции. С использованием новых данных и ранее генотипированных выборок российских и бразильских профессиональных спортсменов была подтверждена ассоциация А аллеля полиморфизма rs9939609 гена FTO со сниженным количеством мышечных волокон медленного (оксидативного) типа, в целом, и преобладанием генотипа, содержащего данный аллель у профессиональных спортсменов силовых дисциплин. С использованием оригинальных данных и ранее генотипированных российских и японских спортсменов проведен ассоциативный анализ по составу мышечных волокон на группе спринтеров и стайеров. По результатам исследования было идентифицировано 5 полиморфизмов, ассоциированных как с преобладанием медленных мышечных волокон, так и показателями выносливости у спортсменов. Проведен многоэтапный полногеномный анализ генетических маркеров выносливости в различных этнических группах, представленных спортсменами европейской, африканской и азиатской популяции. По результатам поэтапного сравнения и проведенного метаанализа была получена достоверная ассоциация с показателями выносливости для аллеля rs4409473 C гена NACC2 со статистической значимостью, удовлетворяющей критериям полногеномных исследований (P=7,8×10-10). На основании новых данных, по значимым генетическим маркерам, ассоциированных с составом мышечных волокон были выполнены работы по созданию генетических моделей для прогнозирования состава мышечных волокон. В поиске наилучшей модели, которая бы отражала взаимосвязь между генетическими данными и составом волокон был выбран метод анализа, основанный на построении полигенных индексов (polygenic scores). Корреляционный анализ показал значимую зависимость между наблюдаемым соотношением мышечных волокон и предсказанными значениями полигенных индексов (коэффициент корреляции Пирсона = 0.36, 95% доверительный интервал 0.21-0.48, уровень значимости p-value 1.97*10-6). Таким образом, построенная модель отражает значимую ассоциацию между составом волокон и полигенными индексами, которые агрегируют генетический сигнал в одну величину. С учетом запланированных на следующий год работ по анализу уровня метилирования ДНК в мышечных биоптатах, были отработаны оптимальные методические подходы для препроцессинга и аннотации данных по метилированию ДНК, получаемых с применением ДНК чипов версии Infinium MethylationEPIC BeadChip, с плотностью количественных данных более чем 850000 CpG сайтов. Суммарно, по итогам отчетного года подготовлено 4 научных публикации, индексируемых в базе данных «Скопус» (Scopus). Полученные в ходе работы результаты по проекту были представлены на 4-х международных конференциях. Информация по проводимым исследованиям была также представлена в рамках отдельного доклада на Всероссийском Фестивале науки NAUKA0+ (МГУ, Москва).

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе выполнения работ по отчётному этапу полученные ранее генетические данные были дополнены результатами количественного анализа метилирования ДНК, выделенной из биоптатов мышечной ткани. В эту часть работы было включено 48 участников, прошедших на предыдущих этапах исследование со взятием биопсии из латеральной головки четырёхглавой мышцы бедра. Определение состава мышечных волокон в биоптатах и генотипирование участников было проведено ранее. В исследование на метилирование были отобраны участники с максимально отличающимися значениями показателя соотношений волокон определенного типа и максимальной разницей в значениях площади поперечного сечения (ППС) мышечных волокон. С использованием ДНК чипа Infinium MethylationEPIC BeadChip были получены данные по количественным показателям метилирования более, чем в 850000 CpG сайтов для каждого образца. Результаты анализа дифференциально метилированных регионов позволили установить 1159 CpG сайтов, уровень метилирования в которых достоверно ассоциирован с показателями доли мышечных волокон I и II типа. Также установлены дифференциально метилированные сайты, ассоциированные с другими антропометрическими показателями. Дальнейший анализ показал, что идентифицированные дифференциально метилированные сайты преимущественно локализованы в районах супер-энхансеров, регулирующих множество тканеспецифичных генов. Дальнейший анализ с привлечением других доступных данных исследований по метаболизму мышечных волокон, в том числе и экспрессионному профилированию, позволил установить приоритизированный список генов, представляющий наибольший интерес для дальнейшего исследования возможных механизмов, объясняющих их ассоциацию с показателями состава мышечных волокон. В течение отчетного года в экспериментальную группу было добавлено 34 новых участника, для которых было также выполнено генотипирование с использованием ДНК-чипа Illumina Omni Express Exome 8 (Illumina, США). С учетом нового набора итоговая численность экспериментальной группы составила 188 человек. На расширенной группе была проведена оценка взаимосвязи между генетическими данными и составом мышечных волокон методикой полигенных баллов. Такой подход позволяет провести совокупную оценку влияния генетических вариантов на реализацию фенотипа. Полигенный балл, являясь суммой ассоциированных с фенотипом аллелей в геноме индивида, взвешенных в соответствии с их оценками эффектов из сводной статистики полногеномного ассоциативного исследования позволяет проверить ассоциации фенотипа не только с отдельными вариантами, но также с их объединенным сигналом. По результатам анализа наибольшая значимость ассоциации с полигенными баллами была выявлены для показателей площади волокон I типа на срезе (p = 0.00002, R2 = 0.11). Полигенные баллы были также значимо ассоциированы с долей волокон I типа, долей волокон II типа, а также площадью волокон II типа на срезе (p < 0.01). Таким образом, построенные модели отражают значимую ассоциацию между характеристиками волокон и полигенными индексами, которые агрегируют генетический сигнал в одну величину. На отчетном этапе для проведения дальнейших ассоциативных исследований по мышечным фенотипам был использован подход, основанный на импутации данных. Импутация увеличивает мощность ассоциативного анализа и позволяет более точно картировать ассоциированные с фенотипом варианты. Фазирование и импутация с данными по референсной панели проекта «1000 геномов» позволило на порядок увеличить число исследуемых генетических вариантов, большинство которых было импутировано с высокой точностью. Проведенный ассоциативный анализ в пределах оригинальной выборки с импутированными генотипами позволил установить более 926 генетических вариантов, ассоциированных с типом мышечного волокна со статистической значимостью в диапазоне от P<5x10-5 до P<5x10-7 и 689 вариантов в таком же диапазоне, ассоциированных с площадью поперечного сечения (ППС). Часть идентифицированных нами вариантов, ассоциированных с составом волокон в ходе полногеномного исследования нашли подтверждение при сравнении с другими доступными выборками. В частности при сравнении с данными японских профессиональных спортсменов (209 человек), с охарактеризованным мышечным фенотипом. Результаты проведенного полногеномного исследования были использованы дальше в серии работ, посвященных функциональной характеристике и валидации генетических вариантов, ассоциированных с различными физиологическими характеристиками, значимых в спортивной деятельности. В частности, на независимых выборках была показана связь генетических маркеров, ассоциированных с волокнами II типа со спринтерскими характеристиками в группе профессиональных футболистов. Охарактеризованы генетические варианты, ассоциированные с преобладанием быстрых мышечных волокон в выборке профессиональных спортсменов, прошедших дополнительных функциональные тесты (анаэробный тест Вингейта). В частности, была подтверждена значимость генетических вариантов rs7669580, rs1247330, rs2048968 и rs2369665 с силовыми характеристиками и относительной пиковой мощностью (тест Вингейта) для полиморфизма rs7669580 SNP гена LDB2 в группе профессиональных борцов. С использованием полученных данных по полногеномным ассоциациям проведена валидация ранее охарактеризованных кандидатных вариантов, ассоциированных с показателями кистевой динамометрии и гипертрофии мышечных волокон II типа у профессиональных спортсменов силовых дисциплин. В совместном функциональном исследовании новой E3 убиквитин лигазы, кодируемой геном UBR5 было подтверждено предположение, что ген UBR5 может быть ассоциирован с показателями мышечной гипертрофии и/или силовыми характеристиками у профессиональных спортсменов. Было показано, что А аллели вариантов rs10505025 и rs4734621 ассоциированы с большей площадью поперечного сечения (ППС) волокон II типа и скоростно-силовым фенотипом у профессиональных спортсменов. В совокупности эти данные впервые подтверждают предположения об ассоциации гена UBR5 с процессами мышечной гипертрофии и адаптации к скоростно-силовым тренировкам, а вариации этого гена, влияющие на его экспрессию – ассоциированы с показателями гипертрофии быстрых мышечных волокон. В заключение, с помощью полученных в ходе выполнения проекта данных, была проведена характеристика гена SPEG, кодирующего специфичную для поперечнополосатой мускулатуры серин/треонин-протеинкиназу. Предположение о связи данного гена с аэробными возможностями (по результатам экспериментов на модельных животных) были подтверждены ассоциацией полиморфизма rs7564856 этого гена с преобладанием медленных мышечных волокон у спортсменов тренирующих выносливость (n = 35, β = 8.345, P = 0.0048) и различиями в частоте встречаемости в группах стайеров, по сравнению с другими спортсменами. Суммарно, по итогам отчетного года подготовлено 6 научных публикаций, индексируемых в базе данных «Скопус» (Scopus). Результаты исследований за отчетный период были представлены на 2-х международных конференциях.