Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках проекта были организованы экспедиционно-полевые работы на территории Тернейского района Приморского края и Сихотэ-Алиньского заповедника, во время которых отбирались биологические пробы от диких животных. Камеральная обработка собранного материала проведена в лаборатории института. По результатам копроскопических анализов образцов от диких плотоядных выявлено 22 вида паразитов. Наивысшие показатели зараженности отмечены для токсокароза кошачьих. Нематодами Toxocara cati было заражено 90% животных популяции амурского тигра и 72,7% амурского кота. В числе наиболее распространенных были гельминты рода Capillaria, которые обнаружены у 52,9% лисиц; 53,3% соболей, 51% тигров, 45,4% амурского кота и 25,8% медведей. Нематоды Baylisascaris transfuga были обнаружены в 28,5% проб от бурых и гималайских медведей. Специальные исследования на трихинеллез выявили это заболевание у 11,22% соболей. Также личинки трихинелл были обнаружены в мышцах бурого и гималайского медведей, енотовидной собаки, лисицы и рыси. Общая зараженность трихинеллами диких плотоядных животных на обследованной территории Приморского края составила 12,85%. Многие из обнаруженных видов гельминтов могут представлять опасность для человека как возбудители зоонозных заболеваний. К таковым относятся трематоды Paragonimus westermani от тигра и лисицы, Alaria alata от лисицы, Dicrocoelium sp. от медведей; нематоды Toxocara cati от тигров и амурских котов, Toxocara canis от лисиц, Baylisascaris transfuga от медведей, один из видов капиллярий (E.aerophilus) от многих видов хищников; также некоторые виды цестод рода Taenia, яйца которых обнаружены в пробах от тигров, амурских котов и медведей. Особую опасность представляют представители рода Trichinellа, которые циркулируют среди многих видов диких млекопитающих животных Дальнего Востока. В основном у хищников на Дальнем Востоке встречается вид T.nativa, отличающийся повышенной устойчивостью к замораживанию. Проведённые исследования показали, что дикие хищники, обитающие на территории Приморского края и Сихотэ-Алиньского заповедника интенсивно заражены опасными для животных и человека гельминтозоонозами. Помимо хищных млекопитающих во время экспедиции в Приморье были собраны и изучены материалы от дальневосточной кабарги (M. moschiferus turovi), которая как подвид занесена в Приложение III Красной книги РФ. Наиболее распространенными эндопаразитами кабарги в исследованной популяции оказались легочные нематоды сем. Protostrongylidae. Их личинки были найдены в 92,6% от общего количества образцов. Зарегистрировано три вида протостронгилид. Доминирующим видом выявлен Pneumocaulus kadenizii, обнаруженный у 91,2% животных. Экстенсивность инвазии видом Protostrongylus moschi составила 20,5%. Личинки третьего вида, пока таксономически не идентифицированного нами, были обнаружены в 7,3% проб. Протостронгилиды характеризуются высокой патогенностью и занимают ведущее место по эпизоотической значимости среди паразитозов в обследованных популяциях кабарги. Нематоды желудочно-кишечного тракта кабарги в материале представлены тремя видами: Trichuris sp. (15,5 %), Nematodirus sp. (6,8%) и Pygarginema skrjabini (2,7%). В 22% проб присутствовали яйца трематод Dicrocoelium sp. В трех пробах (2,8%) обнаружены яйца, морфологически идентичные яйцам трематоды Hasstilesia ovis. До сих пор у кабарог хасстилезии описаны не были. Помимо гельминтов были обнаружены также ооцисты кокцидий трех видов рода Eimeria. E. moschus был обнаружен у 10,1%, E. jinfengshanenisis - у 22,3% и Eimeria sp. в 14,9% от общего количества образцов. Кокцидии у кабарги в России регистрируются впервые. В рамках проекта проводятся исследования по генетическому разнообразию наиболее важных в эпидемиологическом и хозяйственном отношении гельминтов, встречающихся на территории Российской Федерации. Интерес к генетическому разнообразию определяется, в первую очередь, доказанным существованием внутри некоторых видов гельминтов внутривидовых групп, выявляемых на основе анализа нуклеотидных последовательностей. Примером такого подхода в нашей работе может служить изучение внутривидовой генетической структуры трихинелл вида Trichinella nativa. Заметим, что если в странах Западной Европы и США доминантным видом трихинелл является Trichinella spiralis, то для территории нашей страны самым обычным и распространенным видов является T. nativa. При этом данный вид распространен в самых разных экосистемах (что, в некоторой степени противоречит общепринятой в настоящее время схеме экологических форм трихинелл: «лесные» формы, «формы из антропоценозов»). T. nativa обнаруживается как в экосистемах тайги, так и тундровых экосистемах побережий северных морей. Проникает этот вид и в антропогенные экосистемы, в том числе отмечен у домашних животных в мегаполисах. Выявленными нами ранее генетические формы этого вида имеют свои особенности географического распространение: одни формы тяготеют к субарктическим тундровым экосистемам, другие характерны для лесного пояса. Можно предположить, что генетические различия этих форм определяются длительной независимой циркуляцией этих трихинелл в природных экосистемах (например, ограничен обмен генетическим материалом между трихинеллами наземных хищных и морских млекопитающих в Субарктике и хищными млекопитающими южной тайги). Поскольку эти формы, по всей видимости, адаптированы к завершению жизненных циклов в обычных для них условиях, то определение и разграничение внутривидовых форм этих паразитов представляет практическую задачу, имеющую и прогностическое значение. Кроме того, генетическое определение форм трихинелл, обнаруживаемых при медицинских или ветеринарных исследований может быть полезным и для определения источников заражения трихинеллезом людей и животных. Так, выявленные нами различия между «европейскими» и «восточно-азиатскими» изолятами Trichinella spiralis могут быть полезными для анализа их распространения по территории Российской Федерации и мониторинга проникновения инвазивных форм на новые территории. Социально важным представляется и изучение паразитических нематод животных и первостепенное значение отводится домашним питомцам. Они поражаются видами гельминтов, локализующимися в кишечнике (аскаридиды Toxocara, Toxascaris), внутренних органах или подкожном слое (Dirofilaria, личиночные стадии). Опасность последних определяется передачей их личинок кровососущими комарами. Движение дирофилярий в подкожном слое приводит к формированию поражений и патогенных образований. При локализации дирофилярий в сердце самих собак часто регистрируется их гибель. Животные, имеющие паразитов в кишечнике, выделяют с фекалиями в окружающую среду их яйца и личинки, что контаминирует почву и другие объекты окружающей среды и создает угрозу заражения человека, особенно детей. В рамках изучения факторов риска заражения человека опасными паразитозами была проведена серия исследований по паразитологическому исследованию почвы на обсемененность яйцами гельминтов. Также изучались факторы передачи инвазии. С этой целью проводили смывы с лап животных после прогулок и с обуви людей. Смывы с обуви исследовали дифференцировано у владельцев животных и у тех кто животных не содержит. Собаки, у которых брались смывы с лап, по результатам предварительно проведенных копроскопических анализов были свободны от кишечных паразитов. Происследовано 74 пробы почвы из разных округов г. Москвы. В 3 пробах (4%) обнаружены яйца Toxocara cati, яйца T. canis выявлены в одной пробе (1,3 %). Также в 4 пробах обнаружены яйца Toxascaris leonina (5,4 %). Все яйца T. cati были живые и находились на разных стадиях дробления, либо содержали сформированную личинку. Все яйца T. canis были незрелыми. В 36 смывах с лап домашних собак обнаружены: яйца T. cati – в 4 пробах (11,1 %), Trichocephalus sp. – в 2 (5,5 %), Demodex sp.- в 1 пробе (2,7 %). Яйца T. cati были на стадии дробления. В 44 смывах с обуви владельцев собак после прогулок со своими питомцами выявлены: T.cati – в 2 пробах (4,5 %), T.canis – в 2 пробах (4,5 %), Trichocephalus sp. – в 1 пробе (2,3 %), Capillaria sp. - в 1 пробе (2,3 %). Все яйца токсокар находились на стадии дробления. В 24 смывах с обуви людей, не имеющих животных, яиц паразитов обнаружено не было. Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой степени обсемененности городской почвы Москвы яйцами гельминтов собак и кошек. Особую опасность среди них представляют яйца нематод рода Toxocara, являющихся возбудителями ларвального токсокароза у людей. Потенциально опасным следует считать также вид Toxascaris leonina, хотя его эпидемиологическое значение пока слабо изучено. Наши исследования показывают, что реальным механизмом передачи инвазии может служить перенос яиц гельминтов из обсемененной почвы в жилые помещения через загрязненные лапы животных и обувь. В настоящее время имеется острая необходимость создания отечественных препаратов для диагностики, профилактики, и терапии особо опасных гельминтозоонозов у домашних и сельскохозяйственных животных. Для выполнения поставленной задачи в рамках выполнения гранта нами начаты исследования по изучению белкового состава экскреторно-секреторных продуктов продуктов трихинелл 2-х видов -капсулообразующих T. spiralis и бескапсульных - T. pseudospiralis на молекулярном уровне. Для этого была наработана биомасса жизнеспособных личинок трихинелл, проведено их культивирование на искусственной питательной среде ДМЕМ с глутамином с целью последующего получения секреторно-экскреторных продуктов и их дальнейшего исследования современными методами тандемной масс-спектрометрии, сопряжённой с высокоэффективной жидкостной хроматографией (LC-MS/MS). Нами были проанализированы триптические гидролизаты белков среды культивирования мышечных личинок трихинелл 2-х видов: T. spiralis и T.pseudospiralis. Изучена динамика накопления и изменения спектра продуцируемых трихинеллами белков. По результатам нескольких серий анализов во всех исследованных к настоящему времени образцах было идентифицировано более 2 тысяч пептидов, подавляющее большинство из которых являются уникальными. Сравнительный анализ результатов проводили с использованием базы данных http://parasite.wormbase.org/Trichinella_pseudospiralis_iss588prjna257433/Info/Index и http://parasite.wormbase.org/Trichinella_spiralis_prjna257433/Info/Index, а также баз данных NCBI и UniProt. Выявлены белки, предположительное наличие которых было предсказано ранее по результатам прочтения нуклеотидных последовательностей. В настоящее время проводится биоинформатическая обработка данных и, по мере необходимости, выполняются дополнительные эксперименты и биологические повторы.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основой представленного Проекта является молекулярно-генетический подход к исследованиям таксономического разнообразия возбудителей опасных гельминтозоонозов, пониманию закономерностей их циркуляции в биоценозах, выявлению наиболее вирулентных внутривидовых группировок паразитов, возможности перекрёстного заражения млекопитающих разных видов, определения завозных случаев паразитарных инвазий на территорию РФ. В результате проведены молекулярно-генетические исследования нескольких изолятов трихинелл с помощью высокопроизводительного секвенирования на платформе Oxford Nanopore MinION. Проведено изучение молекулярно-биологических и адаптационных свойств 17 изолятов трихинелл, выделенных из природных биоценозов Приморского края, Камчатки, Белоруссии, Осетии и Московской области, а также 7 проб личинок трихинелл из Чехии. Проведен поиск и анализ митохондриальных генов. Для T. nativa обнаружены гены COI, COII, ND4, ND6, для T. pseudospiralis дополнительно к ним были найдены ND2, ND3, ND5, ctb и ATP6. Из «ключевых генов» трихинелл было обнаружено 40 для T. nativa и 92 для T. pseudospiralis. Были найдены некоторые гены, отвечающие за формирование капсул, это TGF-1 и Smad2/3 и гены, отвечающие за подавление иммунного ответа хозяина на проникновения личинок трихинелл - IL-4, Stat6, RAG-2, TNFR. В целях изучения факторов риска заражения человека ларвальным токсокарозом были проведены две серии экспериментов, целью которых было выяснение возможности переноса яиц гельминтов из почвы в жилые помещения на лапах собак и обуви людей. В первом опыте были проведены рандомные исследования смывов с лап собак и с обуви их владельцев в различных районах г. Москвы. В эксперименте участвовали только собаки, свободные от гельминтов. Таким образом, был исключен фактор самоконтаминации. В смывах с лап собак в 17,3% проб найдены возбудители нематодозов. В 11,5% смывах обнаружены токсокары: в 1,9% проб определены яйца T.canis, в 9,6% случаях T.cati. Яйца Ancylostoma sp. и Capillariidae gen. sp. в 3,8% исследованных смывов. Яйца Trichuris sp. в 1,9%. В двух смывах отмечено присутствие двух видов: T.cati + Ancylostoma sp., и T.cati + Capillariidae gen. sp. В смывах с обуви владельцев после прогулок со своими собаками яйца нематод были обнаружены в 10,7% случаев. Токсокары были в 6,1%: из них T.canis в 4,6%, а T.cati в 1,5%. Яйца Ancylostoma sp., Capillariidae gen. sp. и Trichuris sp. обнаружены в 1,5% проб. Проведённый с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии анализ экскреторно-секреторных (Э/С) белков мышечных личинок Trichinella spiralis штамма МН 259593 и Trichinella pseudospiralis штамма KU357408 показал наличие важных функциональных белков в обоих штаммах, принадлежавших к семействам дезоксирибонуклеаз, 5’- нуклеотидаз и сериновых протеаз. Выявленные белки показали различную степень идентичности с белками, ранее обнаруженными в экскреторно-секреторных продуктах трихинелл, обладающих иммунореактивностью (Bien et al., 2015), а также с прогнозируемыми по результатам анализа последовательностей ДНК и РНК протеинами. Результаты данной работы указывают на важность дальнейшего изучения разнообразия Э/С белков, полученных из отечественных штаммов трихинелл различного таксономического происхождения, для выявления ранних диагностических антигенов и потенциальных кандидатов на разработку поливалентной вакцины. Наработанные белковые продукты личинок трихинелл и токсокар анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в 12%-ном разделяющем геле. В результате проведения серии иммуноблотов с использованием гипериммунных сывороток крови кроликов, иммунизированных соматическими антигенами T.canis, было установлено наличие 10-ти белковых полос с молекулярной массой: 28, 32, 35, 43, 47, 67, 70, 110, 134, 160 кДа. При проведении иммуноблота с сыворотками с крови, полученными от спонтанно инвазированных токсокарами собак были выявлены 7 белковых полос: 20, 31, 44, 48, 70, 74, 115 кДа. Иммуноблот с использованием гипериммунных сывороток крови кроликов, иммунизированных соматическими антигенами T.cati выявил 11 полос с молекулярной массой: 20,28, 32, 35, 42, 48, 67, 73,100, 115, 160 кДа. При проведении иммуноблота с сыворотками с крови, полученными от спонтанно инвазированных кошек были выявлены 6 белковых полос: 23, 32, 40, 49, 70, 115 кД. Таким образом, при анализе антигенов токсокар с использованием иммуноблота, были выявлены наиболее иммуногенные соматические белки гельминтов, что важно для создания диагностических иммуноферментных тест-систем. При проведении имммуноблота с полным соматическим антигеном личинок T.spiralis было выявлено 7 иммуногенных полос, соответствующих белковым полосам с молекулярными массами 93, 71, 60, 57, 53, 49 и 38 кДа При проведении иммуноблота с экстреторно-секреторными антигенами T.spiralis было выявлено 5 белковых полос: 49, 52, 56, 60, 71 кДа. Сравнительный анализ показал, что у всех экскреторно-секреторных антигенов и соматического фракционированного присутствуют мажорные полосы с молекулярной массой в диапазоне 43–56 кДа. Полученные данные свидетельствуют об антигенной идентичности белковых продуктов T. spiralis и возможности использования их в серодиагностике трихинеллеза. Проведены исследования аскаридид плотоядных с целью изучения возможности видовой идентификации и дифференциальной диагностики молекулярно-генетическими методами. С помощью биоинформационных программ выделены диагностически значимые участки генома и предложено 4 оригинальных пар праймеров: TTTCCTCGTTTGAATAATTTGAGи CTGACCATAAAAAACACCCACC, TTTCCTCGTTTGAATAATTTGAGи AAAACCATTTTTATACCAAAAAGAGTAGCC, TTGGCTATTTTTAGTTTACATTGTG и CTGACCATAAAAAACACCCACC, CTATGTTGTTAACTGATCGTAATTTGAATACи AAAACCATTTTTATACCAAAAAGAGTAGCC. В рамках изучения природных очагов паразитозов, включая зоонозы, проведены копрологические исследования проб от медведей из Алтайского биосферного и Сихотэ-Алинского заповедника. В Алтайском заповеднике наиболее распространенным гельминтом оказался вид Baylisascaris transfuga, обнаруженный в 91,6% проб. В Сихотэ-Алинской популяции медведя наиболее часто обнаруживался вид Dicrocoelium sp., в 34,7% исследованных проб. Примечательно, что B.transfuga встречались здесь редко, лишь в 9,8% животных оказались зараженными этими нематодами. С другой стороны, доминирующие в Сихотэ-Алине печеночные трематоды Dicrocoelium sp. полностью отсутствовали в алтайской популяции медведей. Также при исследованиях были выявлены другие виды гельминтов, обнаруженные в меньших количествах. Яйца капилляриид встречались примерно в равном количестве проб – 25% и 16,3% в Алтайском и Сихотэ-Алинском заповедниках, соотвестственно. У медведей Алтайского биосферного заповедника в фекалиях обнаружены Strongylida gen. sp. в 8,3% и Spirurida gen. sp. 8,3% проб. У медведей Сихотэ-Алинского заповедника отмечены Eucoleus aerophilusв 12,2%, Aonchotheca putorii в 9,8%, Trichuris sp. 9,8%, Strongylida gen. sp. 9,8% и Teniidae gen. sp. в 2% проб. Важно отметить, что виды pодов Baylisascaris, Trichuris, Ancylostoma и Capillaria обладают зоонозным потенциалом и являются опасными для человека (Areekul et al.,2010; Lalosević et al., 2008; Prociv et al., 1990). Изучена антигельминтная эффективность супрамолекулярного комплекса празиквантела с динатриевой солью глицирризиновой кислоты, полученного по механохимической технологии с целью повышения растворимости и биодоступности. Высокая эффективность (> 98 %) СКП была получена в дозе 3, 2 и 1 мг/кг по ДВ при однократном введении овцам против M. expansa. Базовый препарат – субстанция празиквантела в дозе 1 мг/кг проявил 36,64 %-ную эффективность. При изучении физико-химических свойств СКП было установлено повышение в 2,4-3,4 раза его растворимости, уменьшение размера частиц до 5-10 мкм, потеря кристалличности и образование аморфной фазы и включение молекул празиквантела в мицеллы, что указывает на образование системы гость-хозяин. Предложен инновационный подход в создании супрамолекулярного комплекса никлозамида с натриевой солью глицирризиновой кислоты путем механохимической модификации субстанции в шаровой мельнице с ударно-истирающим типом действия. Базовый препарат – субстанция никлозамида показала в этой же дозе 8,0 %-й эффект и в дозе 100 мг/кг 98,9 %-ную эффективность. При изучении физико-химических свойств установлено повышение растворимости в 28,5 раз, уменьшение размера частиц до 5-10 мкм и агрегирование частиц субстанции с натриевой солью глицирризиновой кислоты. Таким образом, полученные комплексы обладают высокой антигельмитной активностью при снижении дозы в 5-10 раз. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, имеют как прикладное значение, в первую очередь для разработки мер борьбы с социально опасными паразитозами, так и фундаментальные знания в области механизмов паразито-хозяинных отношений и выяснения основ жизнедеятельности возбудителей паразитозов.