Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Ожирение (Ож) взрослого и детского населения является одной из ведущих по своей значимости алиментарно-зависимых патологий. Этиологическая основа Ож состоит в определяемом образом жизни современного человека дисбалансом между сниженными энерготратами и высокой энергетической ценностью рациона вследствие потребления избытка насыщенного (животного) жира и легкоусвояемых углеводов (сахароза, фруктоза). Вместе с тем, по современным представлениям, патогенез Ож не сводится к механическому накоплению жира, а имеет сложную структуру, включающую явления воспаления в жировой ткани и печени, различные иммунные реакции, изменения в метаболизме и рецепции нейромедиаторов (дофамин, серотонин), нейропептидов, нарушения функции отделов ЦНС, отвечающих за чувство голода и насыщения, аппетит и пищевое поведение, эпигенетические изменения метилирования ядерной ДНК и химической модификации гистонов, обуславливающие стойкие сдвиги в экспрессии «генов Ож», в поведенческих реакциях и пищевых стереотипах, способные передаваться от матери к ее потомству в пределах одного поколения. Указанные факторы обуславливают недостаточную эффективность традиционных методов диетотерапии Ож, основанных на применении гипокалорийных диет в сочетании с дозированной физической нагрузкой, и требуют внедрения дополнительных новых подходов. В их числе наиболее перспективным представляется применение в диетотерапии специализированных диетических лечебных и функциональных пищевых продуктов, обогащенных комплексом природных биологически активных веществ (БАВ) с парафармацевтической активностью, способных влиять на процессы системного воспаления, экспрессию «генов Ож», эпигенетическую регуляцию активности генома, микроэлементный «пейзаж» внутренней среды организма и другие факторы, определяющие стойкость результата при диетотерапии Ож. В настоящее время известно уже несколько десятков кандидатных БАВ-парафармацевтиков, однако обоснование их использования в диетическом лечебном питании требует установления механизмов их действия на молекулярном уровне, что возможно с использованием биологических in vivo моделей Ож у экспериментальных животных. Эти модели могут быть воспроизведены двумя принципиально разными способами: с использованием мутантных, трансгенных или нокаутных линий мышей и крыс, у которых Ож развивается спонтанно, и животных традиционных линий путём кормления рационом с повышенной квотой животного жира и простых сахаров (т.н. диета «западного типа»). В связи с вышеизложенным, целью исследования по проекту явилось выявление звеньев обмена веществ, регулируемых алиментарными факторами при Ож, на экспериментальных in vivo моделях у лабораторных животных, и поиск на этой основе наиболее информативных молекулярных маркеров, характеризующих эффективность биологически-активных веществ, применяемых в качестве ингредиентов инновационных специализированных пищевых продуктов, предназначенных для использования в программах снижения массы тела при ожирении. Экспериментальные исследования по проекту начаты в июне 2017 года. План исследования с использованием экспериментальных животных прошел экспертизу и был одобрен Комитетом по этике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» В задачи первого эксперимента входила разработка модели Ож с использованием лабораторных животных конвенциональных линий (инбредные линии мышей DBA 2/J, C57Bl/6, аутбредная линия ICR-1, гибриды 2-го поколения мышей четырех инбредных линий, крысы аутбредной лиии Wistar). Дизайн исследования включал кормление животных в течение 92 суток контрольным рационом или опытным рационом с 30%-ной квотой жира и 20% раствором фруктозы вместо питьевой воды с регистрацией потребляемой калорийности, прибавки массы тела, поведенческих реакций (показатели нейромоторики, тревожности, краткосрочной и долгосрочной памяти в физиологических тестах «сила хватки», «приподнятый крестообразный лабиринт» «условный рефлекс пассивного избегания»). При выведении животных из эксперимента проведен анализ фенотипических признаков Ож (масса жировой ткани и внутренних органов), биохимических параметров плазмы крови, продукции про- и противовоспалительных цитокинов клетками селезенки и жировой ткани с использованием мультиплексного иммуноанализа. По материалам исследования на декабрь 2017 г. опубликована 1 статья, 1 статья направлена в печать в журнал, индексируемый в базе Scopus. Был сформирован банк биологических образцов от мышей и крыс опытных и контрольных групп (плазма крови, ткани отделов продолговатого мозга, печени, жировая ткань; субклеточные фракции) для анализа методами полнотранскриптомного профилирования на микрочипе (что позволяет провести одновременную оценку экспрессии до 30000 генов), двумерного электрофореза с масс-спектрометрией для оценки изменений протеома, мультиплексного анализа цитокинов, ростовых и гормональных факторов, микроэлементного состава биосубстратов, морфологии внутренних органов. Эти исследования продолжаются в настоящее время. В октябре 2017 года начат второй биологический эксперимент с воспроизведением модели ожирения у крыс нокаутной линии DAT-KO (с нарушенным метаболизмом дофамина в головном мозге), мутантных крыс Zucker и мышей db-/db-, наследственно предрасположенных к Ож, а также мышей и крыс обычных линий, получающих контрольные и опытные (гиперкалорийные) рационы с добавкой одного из кандидатных БАВ-парафармацевиков - флавоноида кверцетина. В настоящее время завершена оценка у этих животных поведенческих реакций; при выведении животных из эксперимента планируется определение вышеперечисленных транскриптомных, протеомных, биохимических, иммунологических, микроэлементных маркеров и морфологических показателей; исследования предполагается завершить в I квартале 2018 года в счет полученного в 2017 г финансирования. Результатом проведенных исследований по I этапу проекта будет установление молекулярных механизмов действия БАВ-парафармацевтика полифенольной природы при экспериментальном Ож с обоснованием использования этого вещества в качестве ингредиента специализированных диетических лечебных и функциональных пищевых продуктов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Для образа жизни современного человека характерно снижение общих энерготрат, связанных с физической активностью, из-за массового внедрения средств механизации и автоматизации труда, развития общественного и личного транспорта, сферы услуг. При этом общая калорийность пищевого рациона, обусловленная потреблением такого объёма пищевых продуктов, который содержит в адекватных количествах необходимые для жизни аминокислоты, витамины, эссенциальные минеральные вещества (макро- и микроэлементы), осталась неизменной или снизилась незначительно. Это привело к значительному превышению дневной энергетической ценности рациона, что спровоцировало массовое развитие избыточной массы тела, ожирения и связанных с ним алиментарно-зависимых заболеваний (метаболический синдром, сахарный диабет 2-о типа, подагра, атеросклероз, сердечно-сосудистые и аллергические заболевания). Дополнительным фактором, неблагоприятно повлиявшим на распространенность ожирения, стало широкое распространение продукции фастфуда (содержащей избыточные количества соли, сахара, транс-изомеры ненасыщенных жирных кислот), сладких газированных напитков. Несмотря на то, что пусковым механизмом ожирения, как правило, является избыточная энергетическая ценность рациона, переедание, в последующей цепи событий, сопровождающих развитие и утяжеление этого состояния, важную роль играют различные нейрогуморальные, эндокринные и иммунологические процессы. Избыточное отложение жира вызывает активацию клеток иммунной системы, развитие воспаления, сперва в самой жировой ткани, а далее - во внутренних органах (печень, почки) и в головном мозгу, особенно в гипоталамусе. Следствием этого является изменение пищевого поведения, нарушение нормальных механизмов регуляции чувства голода и насыщения, аппетита, реализуемых как в ЦНС (за счет формирования чувства удовольствия, обусловленного потреблением пищи), так и в периферических органах под действием гуморальных регуляторных факторов: адипокинов (грелин, лептин, адипонектин), белково-пептидных гормонов (инсулин, глюкагон, и др.), цитокинов и хемокинов. В результате формируется порочный круг, состоящий в том, что больной начинает потреблять ещё больше вкусной, высококалорийной, богатой жирами и простыми углеводами пищи, что далее утяжеляет его состояние. Разорвать данный порочный круг с помощью традиционной диетотерапии (заключающейся в назначении резко ограниченных по калорийности, до 600-800 ккал в сутки, диет) не всегда возможно, поскольку данные диеты, во-первых, часто плохо переносятся больными, вызывая у них страдания, во-вторых, создают дополнительные риски дефицита микронутриентов (витаминов и минеральных веществ) и, в третьих, обычно не дают стойкого, закрепляемого на длительное время результата. Разработано и используется значительное число лекарственных препаратов, снижающих аппетит, но они имеют множество побочных вредных эффектов. В последнее время внимание нутрициологов привлечено к использованию в лечебном питании больных ожирением и связанными с ним заболеваниями, биологически-активных веществ (БАВ), в норме присутствующих в пищевых продуктах и являющихся естественными компонентами нашего питания. Среди этих БАВ особые перспективы возлагаются на полифенольные соединения растительной природы (куркумин, катехины, флавоноиды - рутин, кверцетин, ресвератрол), а также l-карнитин и аминокислоты - предшественники нейромедиаторов и биогенных аминов (триптофан, тирозин). Совершённые в последние 10 лет многочисленные попытки клинически обосновать использование перечисленных БАВ в диетотерапии ожирения привели к неоднозначным результатам: в каких-то исследованиях было показано выраженное позитивное действие, в других эффект был нулевым. Проведенные мета-анализы большого числа (сотен) опубликованных работ не позволили выявить в этом какой-либо закономерности, связанной с составом использованных БАВ, их дозами, схемами введения, комбинациями с другими видами лечения (диета, физическая нагрузка). По-видимому, основной причиной различного воздействия БАВ на людей, страдающих ожирением, является генетическая гетерогенность популяции. Исходя из этого, следует предположить, что диетотерапия с использованием БАВ должна быть персонифицированной, то есть учитывать генотип индивида, а также такие дополнительные факторы, как семейно отягощенный анамнез (ожирение у матери и/или отца), длительность и степень заболевания, пищевые пристрастия, иммунный статус и др. Обоснование таких подходов требует развернутых исследований на геномном, транскриптомном, протеомном, биохимическом и иммунологическом уровне, что часто невозможно в условиях клиники, как из-за недоступности или малой доступности ряда видов биологического материала (биоптатов органов и тканей), так и по этическим соображениям (врач не может назначать больным, входящим в контрольную группу, такого лечения, которое по его мнению может оказаться менее эффективным, чем предлагаемое в основной группе). Выходом из положения является использование адекватных in vivo моделей на лабораторных животных, в числе которых наиболее разработанными и удобными являются модели на лабораторных грызунах (мышах, крысах), различающихся по своему генотипу (линейные, мутантные, нокаутные, гибридные линии) и, соответственно, по склонности к развитию ожирения (как спонтанного, так и вызванного избыточным по калорийности рационом). В связи с вышеизложенным, целью исследования по проекту явилось выявление звеньев обмена веществ, регулируемых алиментарными факторами при Ож, на экспериментальных in vivo моделях у лабораторных животных, и поиск на этой основе наиболее информативных молекулярных маркеров, характеризующих эффективность БАВ, применяемых в качестве ингредиентов инновационных специализированных пищевых продуктов, предназначенных для использования в программах снижения массы тела при ожирении. План исследования с использованием экспериментальных животных прошел экспертизу и был одобрен Комитетом по этике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» На первом этапе исследований, проведенных в 2018 году, биологический материал, полученный от животных, использованных в экспериментах III-IV кварталов 2017 года (крысы нокаутной линии DAT-KO, крысы мутантной линии Zucker-Leprfa, крысы линии Wistar, мыши линии db/db, генетически склонные к ожирению, мыши линии C57Bl/6, получавшие рационы с нормальным или увеличенным количеством жира и дополнительным количеством фруктозы в составе питьевой воды и добавку БАВ кверцетина) обработан с использованием методов транскриптомики (полнотранскриптомное профилирование на микрочипе с одновременным определением экспрессии более 30 000 генов), обратной транскрипции с полимеразной цепной реакцией, биохимического анализа, мультиплексного иммуноанализа, протеомики (двумерный электрофорез в полиакриламидном геле). Полученные результаты сопоставлены с данными определения интегральных показателей, морфологии печени, определения нейромоторики и поведенческих реакций животных в тестах условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), «открытое поле» (ОП) и «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ). Основные результаты, полученные на этом этапе исследований, показали, что отключение функции гена транспорта дофамина (DAT) у крыс нокаутной линии не только существенно модифицирует их поведенческие реакции (что определяется ролью дофамина как нейромедиатора в развитии реакций поисковой активности, тревожности, краткосрочной и долговременной памяти), но и существенно изменяет ответ всех вышеперечисленных показателей на потребление животными избыточного по калорийности рациона. Эти наблюдения были подтверждены путем определения у этих животных биохимических маркеров, из которых наиболее информативным было соотношение активности трансаминаз АСТ/АЛТ (т.н. «коэффициент Де Ритиса»), демонстрирующий сравнительную эффективность утилизации аминокислот через образование щавелевоуксусной кислоты и через глюкозо-аланиновый шунт, что является отражением различий эффективности утилизации жиров и углеводов, с одной стороны, и белка - с другой в процессах катаболизма. Помимо это, у животных с нормальным и нарушенным рецепцией дофамина выявлены различия в ответе уровней адипокинов (грелин, лептин и их соотношение) и ряда про- и противовоспалительных цитокинов на гиперкалорийный рацион. Этот результат показывает, что дофаминэргическая система является перспективным объектом лечебных манипуляций при ожирении, в том числе с использованием БАВ, способных повлиять на синтез в ЦНС, обмен и клиренс этого нейротрансмиттера (в особенности это относится к т.н. «большим нейтральным аминокислотам», таким как триптофан, тирозин, фенилаланин). В результате врожденного дефекта рецепции лептина у крыс Zucker-Leprfa ожирение развивается уже при потреблении контрольного сбалансированного рациона и значительно усиливается при потреблении избытка жира и фруктозы. У этих животных отсутствует (блокируется) влияние БАВ кверцетина на поведенческие реакции, наблюдаемое у крыс обычной линии и состоящее у них в снижении тревожности; одновременно данное БАВ провоцировало у крыс Zucker снижение краткосрочной памяти, что не наблюдалось у крыс обычной линии. На транскриптомном уровне как кверцетин, так и гиперкалорийный рацион вызывали у крыс Zucker изменения в экспрессии более 1600 генов, включенных в различные метаболические пути, из которых 7 метаболических путей (связанные с обменом стероидов, лекарственных препаратов, детоксикацией ксенобиотиков, обменом жирных кислот и витамина А) были затронуты при всех вариантах пищевого воздействия. При этом в ряде случаев добавка кверцетина обращала или отменяла изменения, обусловленные избыточной калорийностью. Сравнение величин транскрипции генов, отвечающих за липидный обмен и гликолиз, показало, что кверцетин по-разному влияет на этот показатель у крыс Zucker и крыс обычной группы. Подобные различия выявлены также в биохимических показателях, продукции адипокинов и цитокинов. Полученный результат показывает, что одно и то же БАВ совершенно разным образом влияет на обычных животных, у которых ожирение может развиваться в ответ на избыточное потребление калорий и у животных с генетически врожденным ожирением, причем выявлены генетические (транскриптомные), иммунологические и биохимические маркеры таких различий. Это следует учитывать при перенесении данных in vivo модели на людей в случае разработки персонифицированных схем введения БАВ у пациентов с различным генотипом. Аналогичным образом, в экспериментах 2018 года было показано, что приём в одинаковых таких БАВ, как ресвератрол, карнитин, аминокислоты тирозин и триптофан по-разному влияет на измения поведенческих реакций, биохимические показатели, уровни цитокинов и хемокинов, а также морфологические особенности ткани печени и тонкой кишки у мышей двух линий, из которых одна была высоко резистентна к развитию вызванного гиперкалорийным рационом ожирения, а другая, напротив, склонна к этому. Набранный в ходе проведенных экспериментов 2018 года биологический материал (образцы плазмы крови, печени, отделов головного мозга) крыс и мышей, получавших различные экспериментальные рационы и добавки БАВ, будет дополнительно исследован в 2019 году с использованием транскриптомных, протеомных и иммунологических методов. Будет также проведен эксперимент по сочетанному действию не менее 2 БАВ на животных выбранных чувствительных линий. По материалам исследований, проведенных в 2017 и частично в 2018 году по состоянию на декабрь 2018 года вышло в свет 5 публикаций в журналах, индексируемых в базах данных Scopus и РИНЦ, 2 тезиса в трудах международной научной конференции. 2 статьи приняты к публикации журналами, индексируемыми в Scopus и РИНЦ, и будут напечатаны в первых номерах за 2019 год.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году были продолжены исследования на in vivo моделях у лабораторных животных (крыс и мышей) по поиску звеньев метаболизма, являющихся потенциальными мишенями биологически активных веществ (БАВ) при ожирении, для разработки инновационных специализированных пищевых продуктов. Актуальность темы исследования диктуется широким распространением среди взрослого населения ожирения и сопряженных с ним неинфекционных заболеваний (сердечно-сосудистых, сахарного диабета 2-го типа, атеросклероза, метаболического синдрома, остеопороза, подагры и др.). В основе патогенеза ожирения лежит превышение дневной энергетической ценности рациона над фактическими энерготратами, что связано с массовым внедрением средств механизации и автоматизации труда, развития общественного и личного транспорта, сферы услуг. При этом общая калорийность пищевого рациона, обусловленная потреблением такого объёма пищевых продуктов, который содержит в адекватных количествах необходимые для жизни белки, витамины, эссенциальные минеральные вещества (макро- и микроэлементы), осталась неизменной или снизилась незначительно. В процессе дальнейшего развития и отягощения ожирения важную роль начинает играть воспаление в жировой ткани, печени, головном мозгу, приводящее к снижению чувствительности клеток организма к инсулину. Следствием этого является вторичное изменение пищевого поведения, нарушение регуляции чувства голода и насыщения, аппетита. Тем самым формируется порочный круг, состоящий в том, что больной начинает потреблять ещё больше вкусной, высококалорийной, богатой жирами и простыми углеводами пищи, что далее утяжеляет его состояние. При лечении ожирения традиционно применяются редуцированные по общей калорийности (часто до 600-800 ккал в сутки) и содержащие сниженную квоту животного жира и простых сахаров диеты. Однако эти диеты плохо переносятся больными, и лечение часто приводит к рецидиву, как только больной выходит из клиники и возвращается к привычному образу жизни. Поэтому в последнее время внимание нутрициологов привлекает использование в лечебном питании больных ожирением БАВ, таких, как полифенольные соединения ресвератрол и кверцетин, являющиеся сильными антиоксидантами и иммунорегуляторами, а также витаминоподобное вещество карнитин, отвечающее за перенос жирных кислот в митохондрии и выполняющее, тем самым, функцию "сжигателя жира". Сведения о клинической эффективности этих добавок в настоящее время противоречивы, по-видимому, из-за их неодинаковой эффективности у больных с различным генотипом и «предысторией» развития заболевания. Для выяснения этих вопросов проводятся экспериментальные исследования в строго контролируемых условиях на линейных лабораторных животных с использованием арсенала современных биохимических, физиологических (оценка пищевого поведения и связанных с ним поведенческих реакций), иммунологических и постгеномных (транскриптомных, протеомных) методов. В ходе проведенных в 2019 году исследований с использованием биологического материала, полученного от линейных (мыши C57Bl/6J, DBA/2J, крысы Wistar), гибридных (мыши DBCB) мутантных (мыши db/db, крысы Zucker lepr-fa) и нокаутных (крысы DAT-KO) животных, был получен ряд новых результатов. Завершено полнотранскриптомное исследование печени на двух моделях у мышей - линии db/db, генетически предрасположенных к развитию ожирения на стандартном рационе и обычной линии C57Bl/6J, которых для развития ожирения в течение 2 месяцев кормили высокожировым высокоуглеводным рационом (ВУВЖР- 30% жира по массе и замена питьевой воды на раствор фруктозы). Показано, что изменения, вызываемые в спектре синтезируемой мРНК, под действием добавки кверцетина значительно различаются на этих двух мышиных моделях, причем направленность изменения активности большого числа генов, включая отвечающие за синтез жирных кислот, стероидов, метаболизм производных витамина А, иммунные реакции и другие оказалась противоположной. Протеомный анализ ткани печени и плазмы крови крыс позволил выявить 46 белков, изменяющихся при потреблении ВУВЖР и являющихся мишенью воздействия кверцетина; при этом были выявлены различия в характере ответа у животных Wistar (W), Zucker (Z) и DAT-KO. Полученные результаты позволяют объяснить неодинаковый характер реакции на прием БАВ у больных с различным генотипом. Были продолжены эксперименты по влиянию добавок к рациону БАВ различной природы - карнитина, ресвератрола, аминокислот тирозина и триптофана на развитие ожирения у двух линий мышей - DBA/2J и DBCB, а также двух линий крыс - Wistar и DAT-KO. В числе наиболее значимых результатов следует указать на нормализацию ряда показателей, нарушенных при потреблении ВУВЖР мышами склонной к развитию ожирения линии DBCB, под воздействием добавки карнитина и ресвератрола, включая накопление жира в печени, активность печеночных трансаминаз, продукцию адипокинов и цитокинов. С другой стороны, влияние добавок аминокислот, способных по данным литературы, модулировать обмен нейромедиаторов дофамина и серотонина, участвующих в регуляции чувства голода и насыщения, на мышей и крыс линий Wistar и DATKO было менее однозначным - по ряду показателей наблюдалось ухудшение состояния животных, получавших ВУВЖР. Впервые получены данные по содержанию 17 эссенциальных и токсичных микроэлементов в печени, почках и головном мозгу крыс Wistar, Zucker и DATKO, мышей db/db, C57Bl/6J и DBCB, получавших ВУВЖР и добавку кверцетина. Установлено, что развитие ожирения и нарушенный обмен дофамина в ЦНС приводят к усиленному накоплению ряда токсичных элементов, нарушению статуса жизненно важных железа, магния, селена; добавка кверцетина способствовала нормализации некоторых их этих показателей, однако эффект в значительной мере зависел от генотипа животных. Проведен эксперимент по влиянию 2-месячного кормления биологически-активной добавкой (БАД), содержащей комбинацию ресвератрола и карнитина, на крыс Wistar и мышей DBA/2J. Показана способность указанной БАД повышать мышечный тонус у мышей, снижать уровень тревожности у мышей и крыс, повышать локомоторную активность у крыс. У потреблявших БАД крыс и мышей отмечался ряд изменений в биохимических показателях плазмы крови, что указывало на способность добавки нормализовать нарушенные в ходе развития ожирения процессы белкового и липидного обмена. В печени крыс, получавших БАД с высокожировым рационом, повышалась активность участвующего в детоксикации токсических веществ цитохрома Р-450 формы CYP3A. По материалам исследований, в 2019 году опубликовано 8 научных работ, из них 5 в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus и РИНЦ, в том числе 1 статья в журнале Q1, 3 тезиса в трудах международной и всероссийской научных конференций. 1 статья принята к публикации журналом, индексируемыми в Scopus и Web of Science. Практическое значение полученных результатов состоит в разработке критериев персонифицированного назначения БАВ в качестве вспомогательных средств в диетотерапии ожирения у больных с различным генотипом, а также в создании системы доклинических испытаний эффективности современных методов диетотерапии ожирения на in vivo моделях.