КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-16-01099

НазваниеИзучение молекулярных механизмов эволюции вирулентности и клонального доминирования эпидемических штаммов хламидий у сельскохозяйственных животных

РуководительФедорова Валентина Анатольевна, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии", Владимирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2017 г. - 2019 г.

, продлен на 2020 - 2021. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№18 - Конкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-203 - Ветеринария

Ключевые словаChlamydia, MLST, omp1, генотипирование, филогенетический анализ, хламидиоз, мультилокусное секвенирование-типирование, SNP, HLA, спекл-микроскопия, DWS

Код ГРНТИ68.41.35

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Хламидиозы – группа контагиозных заболеваний млекопитающих, рептилий, птиц, рыб и аквакультуры, отличающихся высоким полиморфизмом клинических проявлений и вызываемых генетически родственными грамотрицательными микроорганизмами, облигатными внутриклеточными паразитами (Обухов, Васильев, 2003). Особое место среди них занимает хламидиоз сельскохозяйственных животных, который Решением комиссии Евроазиатского таможенного союза в 2010 г. включен в перечень опасных и карантинных инфекционных болезней. Согласно закону РФ о ветеринарии от 14.05.1993 г. № 4979-1, хламидиозы относятся к заразным болезням, общим для человека и животных, способным нанести ощутимый экономический ущерб животноводству, который складывается из недополучения прироста живой массы и приплода, увеличения падежа и вынужденного убоя животных, а также затрат на проведение мероприятий по профилактике и ликвидации болезни (Ковалев, 1971; Моисеев, 2000; Чугунова, 2004; Равилов, 2010; Фомченко, Наконечный, 2013; Митрофанов, 2013). В последние годы хламидийная инфекция получила повсеместное распространение, и в настоящее время представляет собой реальную угрозу для здоровья как животных, так и людей, в первую очередь, постоянно контактирующих с животными по роду своей деятельности - профессиональные зоонозы (Макеева, 2001; Караваев и др., 2005; Нехороших и др., 2005; Митрофанов, Митрофанова, 2009; Обухов, 2013). По официальной статистике, в РФ количество неблагополучных по хламидиозу хозяйств в 2008-2010 г составило 28,9-69%, а заболеваемость – 6,2-18,9%, соответственно. В последние годы отмечаются трудности диагностики хламидиозов и появление случаев бессимптомного течения хламидийной инфекции, приводящих к спонтанным абортам, в частности, у овец (Полянина с соавт., 2010, 2014; Федорова с соавт., 2016). В определенной степени это может быть связано с низкой концентрацией хламидий в клиническом образце, зачастую находящейся за пределами чувствительности рутинных методов диагностики, в частности, бактериоскопии, прямой иммунофлуоресценции (ПИФ), РСК, индикаторных полосок, культурального метода и т.д., что может обеспечивать до 40-70% ложно-отрицательных результатов (Schachter J, 2016). С другой стороны, недавно появились научные доказательства отсутствия у хламидий строгой специфичности по отношению к своим биологическим хозяевам. Так, в последние годы с развитием молекулярно-генетических методов анализа стало появляться все больше сообщений о том, что хламидии, выделенные от животных и птиц, при попадании в организм человека могут вызывать разнообразные по клинической картине заболевания, от легкой формы острого респираторного заболевания и пневмонии до менингоэнцефалита, от энтерита до аборта и тяжелой генерализованной инфекции. Более того, Chlamydia trachomatis, ранее считавшийся традиционно антропонозным патогеном, может вызывать генитальные и генерализованные формы заболевания как у человека, так и у животных, причем могут иметь место и перекрестные заражения (Deptula et al., 1990; Busch et al., 2000; Pospisil, Canderle, 2004; Ozbek et al., 2008; Митрофанов, Митрофанова, 2009 и др.). Также, доказано, что именно C. abortus, первоначально считавшийся исключительно зоонозным патогеном, возбудителем хламидийных генитальных инфекций у крупного рогатого скота (КРС), мелкого рогатого скота (МРС), лошадей, свиней, домашних питомцев, может вызывать заболевания даже у человека (Pantchev et al., 2009; Longbottom et al., 2013 etc.). C. psittaci serovar 1 – «птичий штамм» (avian strain) у животных ассоциируют в основном с респираторными инфекциями (как правило, это «зоонозные» хламидийные пневмонии) (Essig et al., 1995; Vanrompay et al., 1995; Moroney et al., 1998; Roca, 2007; Beeckman et al., 2009; Harkinezhad et al., 2009 и т.д.). Более того, C. psittaci недавно наряду с C. abortus и C. trachomatis был выявлен у женщин с симптоматической хламидийной вагинальной инфекцией (Osman et al., 2012). В то же время C. trachomatis, помимо человека, связывают с развитием генитальных инфекций у некоторых диких и с/х животных (Cevenini et al., 2002; Ozbek et al., 2008; Osman et al., 2012; Feodorova et al., 2013; Федорова с соавт., 2016). Доказано, что возбудитель хламидиоза зоонозного происхождения может являться также одной из причин возникновения рака шейки матки и яичников у человека (Chumduri et al., 2013). Недавно при сравнительном анализе геномов C. pneumoniae, изолированных от коалы и от человека с хламидийной пневмонией, установлена их высокая гомология и подтверждено зоонозное происхождение анцесторных штаммов хламидий, дериваты которых способны в настоящее время вызывать заболевания у человека (Myers et al., 2009). Также на модели этого вида хламидий приведены убедительные доказательства того, что люди были первоначально инфицированы плазмидсодержащим штаммом хламидий зоонозного происхождения, которые впоследствии адаптировались к организму человека, прежде всего, за счет потери некоторых хромосомных генов и плазмиды – т.е. типичного варианта редуктивной эволюции, причем животное больше не является резервуаром и не требуется для передачи инфекции, вызываемой хламидиями C. pneumoniae. Интересно, что в природе встречаются плазмидсодержащие делеционные варианты C. pneumonia, н-р, штамм (N16) с делецией размером 150 кб в криптической плазмиде (Wills et al., 1990), а также другой вид делеционных мутантов, так называемые новые «шведские» варианты, несущие делецию в плазмидном репликоне, но большего размера (377 кб), обнаруженные недавно пока только у C. trachomatis (Ripa, Nilsson, 2006, 2007; Unemo et al., 2007, 2011). Вполне вероятно, что обнаружение и детальное изучение подобных мутантных вариантов хламидий поможет прояснить происхождение, эволюцию и адаптацию хламидий разных видов к «традиционным» хозяевам - представителям животных и людей. Более того, будет способствовать пониманию насколько штаммы хламидий, изолированные от сельскохозяйственных животных с хламидийной инфекцией, являются генетически идентичными клиническим изолятам возбудителя хламидиоза человека, или они не взаимосвязаны и представляют собой различные подвиды данного микроорганизма. Также нет сведений о генетическом разнообразии и распространенности таких штаммов в нашей стране, их роли в развитии инфекционного процесса человека и животных. Не менее важным является прояснение путей и закономерностей их распространения, филогенетический анализ и выявление конкретных популяционных групп хламидий, в частности, C. trachomatis, циркулирующих в регионах РФ, имеющих высокий эпидемический потенциал для сельскохозяйственных животных и людей, профессионально занятых в животноводстве, ветеринарии и других областях сельского хозяйства. Ключевыми также могут быть сведения об иммунобиологических особенностях штаммов хламидий, определяющих способность инфицировать макроорганизм, преодолевать эффективные механизмы врожденного иммунитета путем прерывания развития адекватного адаптивного иммунного ответа, вызывать инфекционный процесс в модельных экспериментах с использованием чувствительных лабораторных животных, а также обеспечивать длительное пребывание возбудителей бактериальных инфекций в клетке-мишени чувствительных млекопитающих с развитием персистирующих латентных форм течения инфекции. Не менее важным является возможная корреляция хламидийной инфекции с развитием злокачественных новообразований. Вместе с тем, определенная роль генетической предрасположенности характера иммунного ответа макроорганизма, во многом предопределяющего особенности развития воспалительных, аллергических и других постинфекционных реакций, также должна быть принята во внимание. Поэтому особую значимость имеет прояснение механизмов повышенной чувствительности последних к инфицированию хламидиями и развитию профессиональных зоонозов хламидийной этиологии (Нехороших и др., 2005), в то время как недавно была установлена генетическая детерминированность хронических хламидиозов у людей по наличию в их геномах аллелей DRB1 или В27 (Sahlberg et al., 2010). Однако остается неясным существует ли подобная взаимосвязь и в отношении «профессиональных» хламидиозов, что позволило бы объединить указанных людей в группу повышенного риска и, тем самым, значительно снизить риск приобретения профессиональных заболеваний хламидийной этиологии. Как известно, в 1966 году на 9-м Международном съезде микробиологов хламидии были исключены из класса вирусов и, в настоящее время, после секвенирования геномов, признаны бактериями, включенными в РФ в 3-ю группу патогенности. Недавно у хламидий, по крайней мере, 6 из 12 известных в настоящее время видов (Sachse et al., 2015) обнаружена способность, как и у других бактерий, приобретать резистентность к антибиотикам в результате точковых мутаций, горизонтального переноса генов, гомологичных рекомбинаций и т.д. (Sandoz et al., 2010). Так, стабильно резистентные штаммы C. suis впервые были изолированы от больных и клинически здоровых свиней еще в середине 90-х гг. в США, а затем обнаружены в назофарингеальных, конъюнктивальных и ректальных образцах людей, обслуживающего персонала свинофермы, в виде моно- или ко-инфекция с C. trachomatis в Бельгии и Непале (Sachse et al., 2015). Примерно 83% позитивных свиноматок с конъюнктивитами и/или диареей оказались инфицированы тетрациклин-резистентными штаммами C. suis в Бельгии, Кипре, Израиле (Borel et al., 2012; Schautteet et al., 2013). Штаммы C. pneumonia обладают устойчивостью к большинству препаратов для лечения инфекций респиранторного тракта (Jama-Kmiecik et al., 2015), а C. trachomatis - к одному или более антибиотикам, включая доксициклин, азитромицин, офлоксацин, тетрациклин, эритромицин, клиндамицин и сульфаметоксазол (Krupp, Madhivanan, 2015), хинолоны (Vougaet al., 2015). Однако сведений о выявлении или выделении в РФ антибиотикорезистентных штаммов хламидий, включая мультиантибиотикорезистентные варианты, отсутствуют. Очевидно, получение такой информации, а также научные доказательства возможности зоонозной трансмиссии как это было сделано недавно зарубежными учеными на модели штаммов C. suis, резистентных к тетрациклину (H. Marti, 2016), является актуальным и составляет особый приоритет настоящего исследования. Таким образом, разработка и проведение типирования хламидий, т.е. возможность выявлять сходство или различия между штаммами клинических изолятов хламидий зоо- и зооантропонозной природы равно как детальное изучение их иммунобиологических характеристик имеют как теоретическую, так и практическую значимость как для решения вопросов локальной и глобальной эпидемиологии, так и – в перспективе – для создания эффективных мероприятий по контролю и прогнозированию распространения патогенных штаммов и клонов хламидий. В настоящее время в России и за рубежом разработаны и широко используются различные молекулярно-генетические методы индикации и типирования патогенных бактерий (Сидоренко и др., 2010; Романов, Дехнич, 2011; Кушнир и др., 2012), позволяющие проводить исследование бактериальной ДНК без выделения чистых культур возбудителя непосредственно в клиническом образце. Основываясь на доступности полных нуклеотидных последовательностей геномов в мировом генном банке, для внутривидового дифференцирования клинических изолятов хламидий по наличию или отсутствию однонуклеотидных полиморфизмов (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) предложены: - генотипирование по вариабельности нуклеотидной последовательности гена omp1, кодирующего основной белок наружной мембраны МОМР (Millman et al., 2001; Шаркеев и др., 2005; Quint et al., 2007 etc.); - варианты мультилокусного типирования последовательностей (Multilocus Seguence Typing, MLST) по аннотированным или гипотетическим генам, а также генам «домашнего хозяйства» (Klint et al., 2007; Pannekoek et al., 2008; Dean et al., 2009, 2014; Ikryannikova et al., 2010); - анализ варьирующих по числу тандемных повторов (Variable Number Tandem Repeat, VNTR) (Pedersen et al., 2008; Ikryannikova et al., 2010). При этом исследования проводились с применением клинических образцов только больных хламидиозом людей. Сведения о генетическом разнообразии и эпидемическом потенциале штаммов хламидий, в том числе, C. trachomatis, выделяемых от сельскохозяйственных животных с соответствующей патологией (хламидийной инфекцией) в виде мно- или коинфекции с другими видами хлламидий отсутствуют. Поэтому настоящее исследование будет посвящено изучению генетического разнообразияхламидий в клиническом материале сельскохозяйственных животных с генитальной и генерализованной хламидийной инфекцией с применением комплекса молекулярно-генетических, иммунобиологических и когерентно-оптических методов, включая молекулярное типирование, изучением иммунобиологических характеристик штаммов, прояснением их филогенетического родства и оценкой эпидемического потенциала для людей, профессионально занятых в сельском хозяйстве как этиологического фактора профессиональных зоонозов. Вместе с тем, прояснение роли хламидий в этиологии и патогенезе хламидиозов животных и человека невозможно без проведения полногеномного секвенирования оригинальных клинических изолятов, особенно, природных мутантов и делеционных вариантов, с применением самых современных технологий высокопроизводительного секвенирования следующего поколения. Помимо использования общепринятых методов чрезвычайно перспективным для индикации, тонкой характеристики и мониторинга биологических объектов, в том числе, патогенных бактерий, в различном биоматериале (образцы тканей, крови, биологических жидкостей и т.д.) считаются когерентно-оптические методы диагностики, основанные на принципах высокоразрешающей одно- и двухканальной спекл-микроскопии, интерференционной спекл-микроскопии и LASCA-микроскопии. Преимущества последних, как известно, связаны с возможностью выявления бактерий как в образцах биологических жидкостей, тканей, так и в бактериальных взвесях на этапе выделения чистых культур даже в случае их относительно небольших количеств, не детектируемых рутинными микробиологическими методами (бактериоскопия, ПИФ, РСК и т.д.). Более того, изучение динамики биоспеклов позволяет выявлять и дифференцировать активно растущие (пролиферирующие) и погибшие бактерии (Ulianova et al., 2016), что является большим преимуществом по сравнению с ПЦР, определяющей только наличие или отсутствие ДНК патогена даже в случае, когда сам патоген уже отсутствует в макроорганизме, например, как следствие эффективной антибиотикотерапии или при хронической форме болезни. Сравнительный анализ статистических характеристик спектра типовых биоспеклов позволяет определять малейшие различия, отражающие структурные особенности бактерий и их размеров на уровне индивидуальной бактериальной клетки, позволяя, тем самым, структурное разнообразие, наличие или отсутствие между ними родственных взаимосвязей. В первую очередь, это важно, для выявления природных мутантов и штаммов с резистентностью к антибиотикам (Arun Bhunia, Applied and Environmental Microbiology, 2016), а также для межвидовой и внутривидовой дифференциации хламидий, визуализирующихся как фактически идентичные включения, различить которые методами световой микроскопии на уровне вида не представляется возможным. Особую важность это имеет на этапе оценки эпидемического потенциала штаммов и изучения феномена преодоления межвидовых барьеров у хламидий. Не менее перспективной следует считать возможность успешного применения этого подхода для изучения влияния хламидий на рост новообразований в организме инбредных линий лабораторных животных (Ulyanov et al., 2012). Для достижения поставленной цели планируется решить следующие основные задачи: 1. Провести детальные комплексные исследования клинического материала от сельскохозяйственных животных и обслуживающего персонала из неблагополучных по хламидиозу хозяйств Российской Федерации на наличие хламидий видов C. psittaci, C. abortus, C. pneumoniae и C. trachomatis или их генетического материала с применением молекулярно-генетических, микробиологических, иммунобиологических и когерентно-оптических методов, биоинформатики, а также верифицированных коммерческих и экспериментальных диагностических тестов. 2. Изучить полиморфизмы генов «домашнего хозяйства», omp1 и других таргетных регионов, отличающихся высокой степенью внутривидовой вариабельности, в соответствии с рекомендациями (Klint et al., 2007; Pannekoek et al., 2008; Pedersen et.al., 2008; Dean et al., 2009, 2014; Ikryannikova et al., 2010), у штаммов хламидий, выявляемых в клиническом материале от сельскохозяйственных животных, сравнить полученные данные с расшифрованными нуклеотидными последовательностями, депонированными в GenBank, с последующим построением филогенетических деревьев. 3. Изучить основные иммунобиологические характеристики изолятов хламидий классическими микробиологическими (бактериоскопия, способность формировать вакуоль, накапливать гликоген, инфицировать куриные эмбрионы, клеточные линии разных видов животных и чувствительные биомодели), иммуносерологическими (РСК, ТИФА, ПИФ и иммуноблот с хламидийными антителами), иммунологическими методами для определения способности оказывать влияние на адекватный провоспалительный ответ со стороны макроорганизма. С этой целью будет изучена способность хламидий к Th1/Th2/Th17-поляризации иммунного ответа на клеточном и организменном уровнях в модельных экспериментах in vitro и in vivo по уровню спонтанной и антиген-/митоген-стимулированной продукции цитокинов Th1 (IL-2, IFN-gamma, IL-12, TNF-alfa) и Th2 ряда (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13), Th17 (IL-17A), а также когерентно-оптические методами для выявления особенностей биоспеклов диких типичных и мутантных штаммов возбудителя хламидиоза. Составить карту сравнительных статистических характеристик биоспеклов, типичных для штаммов хламидий видов C. psittaci, C. abortus, C. pneumoniae и C. trachomatis, в том числе, диких и мутантных вариантов. 4. Исследовать клинические изоляты хламидий на наличие естественной или индуцированной в культуре in vitro резистентности к антибиотикам с последующим сопоставлением с данными интерактивной карты резистентности к антимикробным препаратам Resistance Open для мониторинга, организации и визуализации отчетов о характеристиках штаммов, вызывавших глобальные вспышки заболевания неблагополучных по хламидиозу хозяйствах в РФ. 5. Изучить влияние штаммов хламидий на рост новообразований в организме инбредных линий лабораторных животных с применением когерентно-оптических методов диагностики в соответствии с рекомендациями (Ulyanov et al., 2012). 6. Провести полногеномное секвенирование оригинальных клинических изолятов хламидий, изолированных от сельскохозяйственных животных (Feodorova et al., 2013; Федорова с соавт., 2016), с применением современных технологий высокопроизводительного секвенирования следующего поколения. 7. Исследовать роль аллелей МНС I-II класса в потенциальной генетической предрасположенности к профессиональным зоонозам хламидийной этиологии у людей, профессионально занятых в сельском хозяйстве и постоянно контактирующих с больными хламидиозами животными из неблагополучных по хламидиозу хозяйств РФ с применением HLA-B27- и DRB1*15(2)-типирования. 8. Определить эпидемический потенциал штаммов хламидий, детектируемых в клинических образцах животных, и создать общую базу данных, доступную для широкой научной общественности в РФ и за ее пределами. Научная новизна исследования связана с тем, что впервые с помощью современных молекулярно-генетических, микробиологических, иммунобиологических и когерентно-оптических методов будет проведено комплексное изучение генетического разнообразия штаммов хламидий из клинического материала больных сельскохозяйственных животных с верифицированным диагнозом генитальный или генерализованный хламидиоз. Впервые по результатам кластерного анализа будет определено количество основных групп/типов штаммов хламидий с построением филогенетического дерева, их распространенность среди сельскохозяйственных животных в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах, выявлены особенности геномов внутри каждой популяционной группы, наиболее значимые с точки зрения локальной и глобальной эпидемиологии, изучено наличие или отсутствие родственных связей с возбудителем хламидиоза у людей. Научный приоритет будут иметь сведения о распространенности на территории РФ новых вариантов хламидий несущих делеции в плазмиде, прояснении их вклада в развитие инфекционного процесса человека и животных, оценке эпидемического потенциала и понимании основных трендов в эволюции патогенности и преодолении межвидовых барьеров у хламидий. Особую значимость будут иметь данные о наличии и распространенности штаммов хламидий с естественной резистентностью к антибиотикам.

Ожидаемые результаты
Предполагается получение следующих приоритетных результатов, важных для ветеринарной микробиологии, ветеринарной медицины и в целом для приоритетного направления развития науки, технологий и техники РФ (в соответствии с Указом Президента РФ № 899) «Науки о жизни» и критических технологий «Биомедицинские и ветеринарные технологии» и «Геномные, протеомные и постгеномные технологии»: 1. Разработка и оптимизация методов мультилокусного типирования геномов хламидий, в том числе, C. trachomatis, выявляемых в клиническом материале сельскохозяйственных животных из неблагополучных по хламидиозу хозяйств, с последующим сравнением идентичности полученных/расшифрованных нуклеотидных последовательностей с депонированными в международной базе данных GenBank, построением филогенетических деревьев и сравнительным анализом с аннотированными геномами хламидий с целью определения генетического родства между ними: - Все полученные в настоящем исследовании оригинальные последовательности, включая полногеномные сиквенсы, будут депонированы в GenBank (мировой уровень исследований); - Результаты филогенетического анализа позволят прояснить наличие или отсутствие генетического родства у штаммов хламидий, циркулирующих на территории РФ и выделяемых в других регионах мира, выявить наиболее распространенные популяционные группы, определить их эпидемический потенциал и разработать алгоритмы молекулярной дифференциации хламидий, важные для контроля и прогнозирования распространения патогенных штаммов и клонов хламидий как внутри страны, так и за рубежом, с целью их паспортизации (пункт 1 «Биомедицинские и ветеринарные технологии») и предотвращения распространения опасных для человека зоонозных инфекций (пункт 11 там же) – все данные будут представлены в виде публикаций в отечественной и зарубежной печати (мировой уровень исследований); - Определение композиции молекулярных таргетов, позволяющих проводить внутривидовую дифференциацию штаммов хламидий на вирулентные, эпидемически опасные для человека и/или животных, и авирулентные (мировой приоритет); - Будут заложены основы теоретического фундамента создания новых эффективных автоматизированных систем молекулярно-генетической и когерентно-оптической диагностики патогенных бактерий (национальный и мировой уровень исследований); - Мониторинг за распространением хламидийной инфекции на региональном, национальном и глобальном уровнях (национальный и мировой уровень исследований). 2. Детальная молекулярная характеристика особенностей геномов штаммов хламидий, выявляемых у сельскохозяйственных животных, и исследование наличия или отсутствия родственных связей с вариантами хламидий, являющихся этиологическим фактором хламидиоза у людей (соответственно, C. trachomatis геноваров А-L по международной классификации): - Получение приоритетных сведений об эволюционных связях хламидий, структурах бактериальной популяции в кластерах, факторах, обеспечивающих доминирование клональных линий микроорганизмов с повышенной вирулентностью, участии конкретных генов/локусов в обеспечении их распространения и получении данных о специфических генетических маркерах/полиморфизмах, характерных типовых признаках штаммов, общих как для человека, так и для животных или циркулирующих только у животных (мировой приоритет); - Прояснение механизмов преодоления хламидиями межвидового барьера, эволюции вирулентности и адаптивной изменчивости для прояснения особенностей этиологии и патогенеза хламидиозной инфекции у сельскохозяйственных животных (мировой приоритет); - Выявление новых вариантов геномов хламидий, в том числе, C. trachomatis, в первую очередь, клонов с делецией в плазмиде со всеми возможными комбинациями геновар-ассоциированных полиморфизмов, а также резистентных к антибиотикам штаммов возбудителя хламидиоза (мировой приоритет); - Получение приоритетных сведений о наличии у хламидий антибиотикорезистентности и составление интерактивной карты резистентности к антимикробным препаратам в рамках Resistance Open (национальный и мировой приоритет); 3. Применение когерентно-оптических методов высокого временного и пространственного разрешения для индикации и дифференциации хламидий, детектируемых в материале от больных хламидиозом животных на индивидуальном или видовом уровне, включая мутанты и штаммы с естественной резистентностью к антибиотикам. - Исследование статистических характеристик выходного сигнала лазерного спекл-микроскопа при сканировании биообразцов, содержащих хламидии C. psittaci, C. abortus, C. pneumoniae и C. trachomatis, зафиксированных на твердом носителе (предметное стекло) с целью индикации и дифференциации штаммов бактерий. - Исследование статистических характеристик биоспеклов, формирующихся при зондировании микрообъема взвесей хламидий C. psittaci, C. abortus, C. pneumoniae и C. trachomatis в различных концентрациях. - Исследование возможности использования методов LASCA-микроскопии для индикации и дифференциации хламидий, зафиксированных на твердом носителе (предметное стекло). 4. Получение данных о распределении аллелей МНС I-II класса у работников из неблагополучных по хламидиозу хозяйств, непосредственно вовлеченных в постоянные контакты с сельскохозяйственными животными по роду своей профессиональной деятельности, и их инфицированности хламидиями: - Будут получены приоритетные данные о наличии или отсутствии генетической детерминированности профессиональных зоонозов хламидийной этиологии у людей, работающих в сельском хозяйстве, важные для снижения риска развития у персонала профессиональных болезней, контроля заболеваемости хламидиозом в хозяйствах и разработке эффективных профилактических мероприятий (национальный и мировой уровень исследований); - Выявление корреляций между конкретными MLST-, VNTR- и omp1-типами хламидий и их потенциальной вирулентностью для обслуживающего персонала (мировой уровень исследований). 5. Создание электронной базы данных о геномных портретах/вариабельности геномов хламидий, выявляемых у сельскохозяйственных животных на территории РФ, доступную для широкой научной общественности в РФ и за ее пределами (национальный и мировой уровень исследований). Работа будет выполнена на высоком научно-техническом уровне в соответствии с мировыми стандартами благодаря привлечению ресурсов и ведущих ученых в области микробиологии, биоинформатики и молекулярного типирования четырех научных организаций: ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, ФГБНУ «Саратовский НИВИ», Национального исследовательского Саратовского государственного университета имени Н. Г. Чернышевского и ФГБОУ ВО Саратовский государственный аграрный университет (СГАУ). Предстоящее объединение ресурсного и кадрового потенциала ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и ФГБНУ «Саратовский НИВИ» в конце 2016 – начале 2017 гг. в Федеральный Исследовательский Центр (ФИЦ) позволит существенно повысить качество проводимых исследований специалистами соответствующих организаций. Тесная кооперация научно-исследовательских институтов с учреждениями ВПО в рамках настоящего проекта обеспечит подготовку квалифицированных научных кадров, способных решать актуальные междисциплинарные фундаментальные и прикладные задачи на современном уровне. В целом поддержка данного проекта позволит получить прорывные научные результаты мирового уровня с ориентацией на достижение ведущих конкурентных позиций в соответствующих актуальных областях современной науки. Все данные, полученные в ходе выполнения настоящего проекта, будут оригинальными, новыми и не имеющими аналогов в мировой научной практике. Поэтому результаты исследования смогут быть использованы для подготовки серии научных публикаций в зарубежных и отечественных высокорейтинговых научных изданиях, а также диссертационных работ для аспирантов, соискателей и приглашенных молодых исполнителей, участников настоящего проекта. Расшифрованные нуклеотидные последовательности будут депонированы в мировом генном банке (GenBank) и использованы для создания доступной отечественной электронной базы данных. Научный приоритет будет защищен также суммированием полученных результатов в монографию, посвященную прояснению молекулярно-генетических механизмов эволюции возбудителей хламидиозов. Издание монографии планируется на русском и английском языках для привлечения отечественной и зарубежной научной общественности, а также студентов и аспирантов сельскохозяйственных и медико-биологических ВУЗов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Для изучения молекулярных механизмов эволюции вирулентности и клональной распространенности эпидемических штаммов хламидий у сельскохозяйственных животных (СХЖ) были тщательно исследованы клинические образцы от абортировавших животных - крупного рогатого скота (КРС, коров) и мелкого рогатого скота (МРС, овец). Также тестировали образцы людей с хламидийными абортами и бесплодием из города и некоторых сельских районов вокруг ферм с отмеченными случаями генитальной хламидийной инфекции. Для этого был успешно использован комплекс рутинных и современных исследовательских инструментов, таких как обнаружение хламидийных включений методом бактериоскопии, обнаружение специфических антител/антигенов хламидий иммунно-серологическими методами (реакция связывания комплимента/прямой иммунофлуоресцентный тест, дот-иммуноанализ и т. д.), обнаружение хламидийных клеток с использованием лазерной спекл-микроскопии, сканирующей диффузионно-волновой микроскопии и динамической двухкаскадной спекл-микроскопии, обнаружение присутствия ДНК представителей сем. Chlamydiaceae (C. psittaci, C. felis, C. abortus, C. caviae и C. trachomatis (CT)) с помощью ПЦР, в том числе, в режиме реального времени с использованием коммерческих наборов ПЦР, молекулярное omp1-генотипирование, MLST-типирование позитивных образцов ДНК после выравнивания расшифрованных нуклеотидных последовательностей, филогенетический и кластерный анализ. В ходе реализации Проектного плана было обнаружено: - отсутствие детектируемых концентраций ДНК четырех наиболее распространенных видов хламидий, а именно: Chlamydia psittaci/Chlamydia felis/Chlamydia abortus/Chlamydia caviae в клинических образцах, полученных от абортировавших СХЖ с диагностически значимым уровнем сывороточных антител к общему орнитозному антигену (21/21 коров, 55/55 овец, 100%); наличие детектируемых концентраций как хромосомной, так и плазмидной ДНК СТ геновара E у 8/21 коров (38,1%) и 18/55 овец (32/7%), что было подтверждено секвенированием соответствующих нуклеотидных последовательностей (8/8, 100%); - наличие ДНК или дикого типа (wtCT), или «нового шведского» варианта (nvCT), несущих криптическую плазмиду в ПЦР-положительных образцах; СТ-штаммы, обнаруженные как у домашнего скота, так и у людей с хламидийной генитальной инфекцией, были идентичны друг другу, по крайней мере, по пяти хромосомным и плазмидным локусам; - анализ последовательности гена omp1 выявил 7 геноваров СТ у ПЦР-положительных пациентов, а именно: E, G, F, K, D, J и H у мужчин (19,7%), женщин (68,8%) и анонимных (11,5%), в возрасте от 19 до 45 лет (в среднем 26,4); субтипирование на основе SNP и филогенетическая реконструкция выявили наличие 13 вариантов гена omp1 - E (E1, E2, E6), G (G1, G2, G3, G5), F1, K, D (D1, Da2), J1 и H2; генетическое распределение различных геноваров СТ было представлено: среди городских (E> G> F) и сельских (E> K) популяций, в славянских (E> G> D) и неславянских (E> G> K) этнических группах; - мультилокусное типирование (MLST) выявило пять «сиквенс» типов (ST) СТ: ST4, ST6, ST9, ST10 и ST38, среди которых наиболее распространенными были ST4 и ST9. В ходе выполнения первого этапа проекта были разработаны и созданы следующие когерентно-оптические установки: - экспериментальная установка для LASCA-имиджинга злокачественных опухолей, привитых лабораторным животным. Общий вид представлен на иллюстрациях https://yadi.sk/i/3pKv23Q93QNwUh и https://yadi.sk/i/pHWRiQrz3QNwVn; - экспериментальная установка для LASCA-имиджинга, предназначенную для исследования состояния микроциркуляции крови куриных эмбрионов, см. https://yadi.sk/i/yxminDfK3QMHT4; - экспериментальная установка для зондирования бактериальных клеток во взвеси малого объема, см. https://yadi.sk/i/lZuDewIt3QMKfd; - двухкаскадный лазерный спекл-микроскоп с осветителем, использующим динамические спекл-поля, для визуализации внутренней структуры отдельной клетки Chlamydia trachomatis, см. https://yadi.sk/i/JX3-iIHl3QMKLm. Лазерная сканирующая спекл-микроскопия была впервые применена в высокоразрешающей экспресс-диагностике хламидийных инфекций. Была детально проанализирована роль спеклов и их влияние на результаты измерений, так же был проведен детальный анализ выходных характеристик спекл-микроскопа, используемого для сканирования бактерий C. trachomatis внутри эпителиальных клеток человека. Диффузионно-волновая спектроскопия была впервые адаптирована к проблеме быстрого детектирования бактерий C. trachomatis, выделенных из крови пациентов, больных хламидиозом. Разработана теория формирования спекл-модулированных спеклов при дифракции остросфокусированных гаусовых пучков в суспензиях, содержащих клетки C. trachomatis. Проведено исследование статистических характеристик биоспеклов, формирующихся при зондировании микрообъема взвеси бактерий в различных концентрациях. Выявлена зависимость ширины спектра временны́х флуктуаций интенсивности биоспеклов от концентрации клеток C. trachomatis в измерительном объеме. Разработаны принципы двухкаскадной лазерной спекл-микроскопии применительно к задачам экспресс-диагностики хламидийных инфекций. Разработан и протестирован прототип уникального двухкаскадного спекл-микроскопа, предложен также уникальный подход, основанный на освещении бактериальных клеток динамическими спеклами. Методы t-LASCA- и s-LASCA-имиджинга впервые были адаптированы к задачам мониторинга микроциркуляции крови куриных эмбрионов, инфицированных C. trachomatis. Фотография установки приведена на рис. https://yadi.sk/i/yxminDfK3QMHT4.

Публикации

1. Полянина Т.И., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Федорова В.А Получение хламидийных антител с использованием инбредных мышей линии BALB/c Ветеринария и кормление, № 4 стр.30-33 (год публикации - 2017)

2. Ульянов С.С., Зайцев С.С., Ульянова О.В., Салтыков Ю.В., Федорова В.А. Using of methods of speckle optics for Chlamydia trachomatis typing Proceedings of SPIE, UNSP 103360D; T.10336 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1117/12.2270760

3. Ульянов С.С., Ларионова О.С., Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Полянина Т.И., Ляпина А.М., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Калдузова И.А., Утц С.Р., Моисеева Ю.М., Федорова В.А. Application of laser scanning speckle-microscopy for high-resolution express diagnostics of chlamydial infection Proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160N (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314703

4. Ульянов С.С., Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Федорова В.А. Statistics on gene-based laser speckles with a small number of scatterers: implications for the detection of polymorphism in the Chlamydia trachomatis omp1 gene Laser Physics Letters, Volume 15, Number 4 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1088/1612-202X/aaa11c

5. Ульянов С.С., Ульянова О.В., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Моисеева Ю.М., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Полянина Т.И., Ляпина А.М., Калдузова И.А. Ларионова О.С., Утц С.Р., Федорова В.А. Detection of the presence of Chlamydia trachomatis bacteria using diffusing wave spectroscopy with a small number of scatterers Proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160O (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314570

6. Ульянов С.С., Филонова Н.Н., Ульянова О.В., Утц С.Р., Моисеева Ю.М., Субботина И.А., Калдузова И.А., Ларионова О.С., Федорова В.А. Using of dynamic speckles with a small number of scatterers for study of suspension of Chlamydia Proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160P (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2315142

7. Ульянова О.В., Моисеева Ю.М., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Полянина Т.И., Ляпина А.М., Ульянов С.С., Ларионова О.С., Утц С.Р., Федорова В.А. Development of principles of two-cascaded laser speckle-microscopy with implication to high-precision express diagnostics of chlamydial infection Proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160L (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314586

8. Ульянова О.В., Субботина И.А., Филонова Н.Н., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Полянина Т.И., Ляпина А.М., Ульянов С.С., Ларионова О.С., Федорова В.А. Application of LASCA imaging for detection of disorders of blood microcirculation in chicken embryo, infected by Chlamydia trachomatis Proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160K (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2313867

9. Федорова В.А., Салтыков Ю.В., Зайцев С.С., Ульянов С.С., Ульянова О.В. Application of virtual phase-shifting speckle-interferometry for detection of polymorphism in the Chlamydia trachomatis omp1 gene Proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160M (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314700

10. Федорова В.А., Султанахмедов Э.С., Салтыков Ю.В., Утц С.Р., Мотин В.Л. Совершенствование лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции у пациентов с нарушением репродуктивной функции, инфицированных новым «шведским» штаммом Chlamydia trachomatis Вестник дерматологии и венерологии, №2 2017 стр. 34-44 (год публикации - 2017)

11. Федорова В.А., Ульянов С.С., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ульянова О.В. Optimization of algorithm of coding of genetic information of Chlamydia Proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160Q (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314640

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Для выполнения плана работ, предусмотренных на второй год выполнения проекта, нами было продолжено формирование коллекции клинических изолятов хламидий зоонозного и антропонозного происхождения. С этой целью клинические образцы (n=28) от абортировавших коров черно-пестрой породы из двух хозяйств Нижнего Поволжья, неблагополучных по хламидиозу крупного рогатого скота (КРС), были исследованы аналогично комплексному подходу, разработанному в первый год выполнения проекта (бактериоскопия, РДСК, ПИФ, ПЦР, ДИА, когерентно-оптические методы). В результате комплексного исследования микробиологическими, иммунологическими, молекулярно-генетическими и когерентно-оптическими методами удалось выявить новые делеционные варианты хламидий. При культивировании хламидий пролиферировать in vitro на клеточной линии McKoy, но не HeLa, а также на куриных эмбрионах определены требуемые параметры современных неинвазивных бесконтактных методов лазерной диагностики для практической ветеринарии. В частности, показана принципиальная возможность применения современных высокочувствительных методов лазерной доплеровской флуометрии для высокоразрешающей и сверхвысокочувствительной экспресс-диагностики хламидиоза, в том числе, благодаря амплификации разрешающего сигнала за счет применения комплекса моноклональных антихламидийных антител к наночастицами золота. Разработана методика определения жизнеспособности КЭ с помощью доплеровской диагностики, высокочувствительным эффективным и перспективным современным инструментом на этапе отбора доброкачественных племенных КЭ, а также лабораторной диагностики хламидиоза с применением культурального метода, в том числе, в слабо оснащенных лабораториях или условиях хозяйства как альтернативный метод дорогостоящим молекулярно-генетическим тестам. Предложен прототип простого в использовании устройства, состоящего из серийно выпускаемого смартфона и дешевой лазерной указки (предпочтительно с длиной волны излучения 650 нм), что позволит использовать данный метод для практической ветеринарии. При изучении основных иммунобиологических характеристик полученных изолятов хламидий зоонозного и антропонозного происхождения в соответствии с планов работ выявлены два иммунодоминантных антигена белковой природы, относящийся к белку внешней мембраны MOMP, с высокой кросс-реактивностью с гомологичным антигеном С. trachomatis. Изучение цитокиновых профилей позволило сделать вывод о способности исследуемого антигена индуцировать in vitro развитие первичного иммунного ответа по смешанному Th17/Th1/Th2 пути, с явной поляризацией в сторону Th17 и Th1. Проведено пилотное секвенирование двух штаммов хламидий зоонозного происхождения на платформах Illumina (HiSeq 2500) и minION (Oxford Nanopore). Предварительный анализ с применением современного пакета биоинформатического программного обеспечения показал вероятную принадлежность указанных штаммов к виду C. psittaci. Изучение полиморфизма генов «домашнего хозяйства» и резистентности с последующим сравнением профилей с референтными последовательностями штаммов хламидий вида C. psittaci, депонированных в базе данных PubMLST, позволило выявить относительно высокую гомологию с хламидиями штамма C. psittaci GR9, имеющего сиквенс тип 28 (ST28) и изолированного в Нидерландах от кряквы (Mallard) в 2012 году. Однако принципиальные отличия в виде однонуклеотидных полиморфизмов могут указывать на дальнейшую эволюцию штаммов хламидий, выделенных от сельскохозяйственных животных в РФ, от европейского предка и/или обнаружение новой клональной линии. В результате анализа спектра естественной резистентности к антибиотикам в расшифрованных геномах хламидий обнаружено 5 генов, специфические инсерции в которых, как правило, обеспечивают приобретение бактериям устойчивость к конкретным антибиотикам (рифампицин, спектиномицин, сульфаниламиды, тетрациклины, фторхинолоны). Однако ни в одном из изученных образцов типичных мутаций не выявлено, что указывает на отсутствие у обоих изолятов свойств резистентности к данным антибиотикам. С помощью молекулярного типирования, филогенетического и кластерного анализа образцов ДНК из штаммов хламидий, изолированных от добровольцев из группы риска с клиническим диагнозом урогенитальная хламидийная инфекция (бессимптомное течение) и осложнением в виде бесплодия обнаружен новый делеционный вариант СТ (ddCT), отличающийся от «Шведского» варианта (nvCT) дополнительной делецией и ST (ST13 вместо ST4) и от мексиканского варианта (nvCT-D) - по 4 из 7 аллелей (данные MLST). С помощью omp1-типирования доказаны идентичность ddCT и nvCT по гену omp1 (геновар Е) и различия между ddCT и nvCT-D по этому гену (геновары Е и D, соответственно). Предполагается, что отдаленным предком штамм ddCT могут быть хламидии зоонозного происхождения.

Публикации

1. Богун А.Г., Федорова В.А., Кисличкина А.А., Сизова А.А., Дятлов И.А. Изучение геномной организации Chlamydia psittaci с применением алгоритмов метагеномных исследований Бактериология, том 3, №3, с. 7–13. (год публикации - 2018) https://doi.org/10.20953/2500-1027-2018-3-7-13

2. Ульянов С.С., Ларионова О. С., Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю. В., Полянина Т. И., Ляпина А. М., Субботина И. А., Филонова Н. Н., Калдузова И., Утц С.Р., Моисеева Ю. М., Федорова В.А. Application of laser scanning speckle-microscopy for high-resolution express diagnostics of chlamydial infection proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160N (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314703

3. Ульянов С.С., Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Федорова В.А. Statistics on gene-based laser speckles with a small number of scatterers: implications for the detection of polymorphism in the Chlamydia trachomatis omp1 gene Laser Physics Letters, Volume 15, Number 4 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1088/1612-202X/aaa11c

4. Ульянов С.С., Филонова Н. Н., Субботина И. А., Моисеева Ю. М., Зайцев С.С., Салтыков Ю. В., Полянина Т. И., Ляпина А. М., Ульянова О.В., Ларионова О. С., Утц С. Р., Федорова В.А. Detection of the presence of Chlamydia trachomatis bacteria using diffusing wave spectroscopy with a small number of scatterers proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160O (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314570

5. Ульянов С.С., Филонова Н. Н., Ульянова О.В., Утц С.Р., Моисеева Ю. М., Субботина И. Калдузова И., Ларионова О. С Федорова В.А. Using of dynamic speckles with a small number of scatterers for study of suspension of Chlamydia proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160P (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2315142

6. Ульянова О. В. Моисеева Ю. М., Филонова Н. Н., Субботина И. А., Зайцев С.С., Салтыков Ю. В., Полянина Т. И., Ляпина А. М., Ульянов С.С., Ларионова О. С., Утц С. Р., Федорова В.А. Development of principles of two-cascaded laser speckle-microscopy with implication to high-precision express diagnostics of chlamydial infection proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160L (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314586

7. Ульянова О. В., Субботина И. А., Филонова Н. Н., Зайцев С.С., Салтыков Ю. В., Полянина Т. И., Ляпина А. М., Ульянов С.С., Ларионова О. С., Федорова В.А Application of LASCA imaging for detection of disorders of blood microcirculation in chicken embryo, infected by Chlamydia trachomatis proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160K (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2313867

8. Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю. В., Ляпина А. М., Субботина И. А., Филонова Н. Н., Ульянов С.С., Федорова В.А. Speckle-interferometry and speckle-correlometry of GB-speckles Frontiers In Bioscience, 24, 597-597 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.2741/4744

9. Ульянова О.В., Колосова А.А., Филонова Н.Н., Ляпина А.М., Салтыков Ю.В., Субботина И.А., Зайцев С.С., Грашкина И. Г., Ульянов С.С., Федорова В.А. Detection of blood microcirculation of chicken embryo using LASCA-imaging with application of the new techniques of optical clearing Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0N (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2523025

10. Ульянова О.В., Салтыков Ю.В., Зайцев С.С., Субботина И.А., Филонова Н.Н., Ляпина А.М., Ульянов С.С., Федорова В.А. Application of s-LASCA technique for processing of GB-speckles, coding sequences of nucleotide sequences of omp1 gene of Chlamydia trachomatis Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0I (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2522584

11. Ульянова О.В., Субботина И.А., Филонова Н.Н., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ляпина А.М., Скрипаль А.В., Добдин С.Ю., Ларионова О.С., Ульянов С.С., Федорова В.А. Detection of viability of chicken embryo by method of laser Doppler diagnostics Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0M (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2522993

12. Федороа В.А., Коннова С.С., Салтыков Ю.В., Зайцев С.С., Субботина И.А., Полянина Т.И., Ульянов С.С., Ламерс С.Л., Гайдос С.А., Куин Т.С., Мотин В.Л. Urogenital Chlamydia trachomatis multilocus sequence types and genovar distribution in chlamydia infected patients in a multi-ethnic region of Saratov, Russia PLOS ONE, Vol. 13, No. 4. (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0195386

13. Федорова В.А., Салтыков Ю. В., Зайцев С.С., Ульянов С. С., Ульянова О. В. Application of virtual phase-shifting speckle-interferometry for detection of polymorphism in the Chlamydia trachomatis omp1 gene proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160M (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314700

14. Федорова В.А., Салтыков Ю.В., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Зайцев С.С., Ульянова О.В., Ларионова О.С., Евстифеев В.В., Ревзина Е.М., Ульянов С.С., Мотин В.Л. Детекция нового шведского варианта Chlamydia trachomatis у крупного рогатого скота Ветеринария, Вып.7, С. 27-31 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.30896/0042-4846.2019.22.7.27-31

15. Федорова В.А., Султанахметов Э. С., Салтыков Ю. В., Зайцев С.С., Утц С.Р., Корбел М. Д., Гайдос Ш. А., Квин Т. С., Мотин В. Л. First Detection of Chlamydia trachomatis 'Swedish' Variant (nvCT) in a Russian Couple with Infertility The Open Microbiology Journal, 12:343-352 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.2174/1874285801812010343

16. Федорова В.А., Ульянов С. С., Зайцев С.С., Салтыков Ю. В., Ульянова О. В. Optimization of algorithm of coding of genetic information of Chlamydia proceeding of SPIE, Vol. 10716 107160Q (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1117/12.2314640

17. Филонова Н.Н., Ульянова О.В., Субботина И.А., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ульянов С.С., Ларионова О.С., Моисеева Ю.М., Федорова В.А. Перспектива применения когерентно-оптических методов для ранней диагностики хламидиоза Аграрный Научный Журнал, № 3, С. 51-54. (год публикации - 2019)

18. Федорова В.А., Коннова С. С., Салтыков Ю. В., Зайцев С.С., Субботина И. А., Ляпина А. М., Ульянов С.С., Ульянова О.В., Мотин В. Л. Chlamydia trachomatis biodiversity detected in clinical urogenital samples in the Southeastern European Region of Russia FEBS Open Bio, Volume 8, P.489 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12453

19. Федорова В.А., Салтыков Ю. В., Зайцев С.С., Султанахметов Э. С., Утц С.Р., Мотин В. Л. Detection and Chlamydia trachomatis genovar distribution in blood and genital samples of Chlamydia patients FEBS Open Bio, Vol. 8. P. 490 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12453

20. - «Новый оптический процессор выявит даже минимальные отличия в ДНК» «Индикатор», 14 июня 2018 г. (год публикации - )

21. - «Саратовские ученые разработали новую методику расшифровки ДНК» сайт РНФ, 15 июня 2018 г. (год публикации - )

22. - «Профессор СГУ – участник проекта РНФ по инновационной методике диагностики заболевания» сайт Саратовского государственного национального исследовательского университета им. Н.Г. Чернышевского, 21 июня 2018 г. (год публикации - )

23. - «Диагностика со скоростью света» «Диагностика со скоростью света», сентябрь 2018 г. (год публикации - )

24. - С.С. Ульянов -участник совместного проекта гранта РНФ Газета "Саратовский университет ", № 6 ((2143), сентябрь, 2018 г. (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках выполнения плана работ, предусмотренных на третий год реализации проекта, были проведены комплексные исследования по изучению генетического разнообразия возбудителя хламидиоза у продуктивных животных и волонтеров из группы риска – персонала, профессионально занятого в сельском хозяйстве в секторе животноводства. Применение филогенетического и кластерного анализа позволило выявить циркуляцию в нашей стране нескольких клональных линий, сформированных как известными европейскими штаммами, так и новыми, ранее не обнаруженными ни в России, ни за рубежом вариантами хламидий. Так, среди детектированных у продуктивных животных штаммов обнаружено несколько клональных линий, представленных штаммами хламидий с выраженным генетическим полиморфизмом. Первая клональная линия включала штаммы C. psittaci, относящиеся к сиквенс типу 28 (ST28), ранее (в 2012 г) обнаруженному в Германии и сформированному изолятами от диких уток. Поскольку в ГенБанке отсутствовали последовательности расшифрованных геномов российских штаммов хламидий указанного вида, нами проведено полногеномное секвенирование штамма хламидий, изолированного в России от животного (КРС) с хламидийным абортом (первый российский штамм хламидий, секвенированный, собранный de novo, аннотированный и депонированный в международной базе данных NCBI (GenBank) под номером CP041038.1). Для этого использовали платформы второго (NGS, Immunina) и третьего (Оксфорд Нанопор, MinIon) поколения. Сравнительный анализ полногеномных последовательностей российского штамма и изолятов, депонированных ранее в международную базу NCBI (GenBank), показал отсутствие полной гомологии с европейскими штаммами, в том числе, имеющими сходный сиквенс тип. Так, российский штамм обладал криптической плазмидой, однако формировал единый клайд с бесплазмидным вариантом, но не со штаммом, несущим плазмиду. При этом между российскими и германскими штаммами обнаружены различия в 50 генах (гены аннотированы) и уникальная гомологичная рекомбинация в виде отдельного кластера из 30 генов. Анализ полногеномной последовательности другого штамма, также изолированного от больного хламидиозом продуктивного животного (КРС), подтвердил принадлежность хламидий данного штамма к аналогичному сиквенс типу (ST28), наличие экстрахромосомального плазмидного репликона и выраженного полиморфизма (последовательность генома на стадии обработки). Следовательно, российские штаммы эволюционно представляют собой новую клональную линию, вероятным родоначальником которой был европейский штамм ST28, общий с изолятами, обнаруженными ранее в Германии. Второй клональной линией оказался делеционный мутант типа nvCT, несущий дополнительную делецию размером 16 bp в гене orf1 криптической плазмиды. Примечательно, что штаммы данной клональной линии были изолированы от МРС с диагнозом «энзоотический аборт овец» и обладали высокой гомологией со штаммами, обнаруженными у волонтеров из группы риска с хламидийной инфекцией урогенитального тракта, но несущими дополнительную делецию в том же гене другого размера (17 bp) – обозначены как ddCT. Штаммы с идентичной дополнительной делецией размером 17 bp были нами обнаружены в материале больных хламидиозом КРС. Установлено, что штаммы ddCT и nvCT эволюционно произошли от разных прогениторов (предков) – клональных линий ST13 и ST4, соответственно. Представлены возможные механизмы появления и доминирования основных клональных линий эпидемически значимых штаммов хламидий с несколькими вероятными биологическими сценариями, приводящими к нарушениям репродуктивной функции как животных, так и волонтера из группы риска и проявляющихся в виде энзоотического аборта овец, хламидиоза КРС или урогенитального хламидиоза человека с осложнением в виде хламидийного аборта бесплодия, соответственно. Показано, что наличие мутации в гене orf1 криптической плазмиды может быть генетическим маркером патогенности и указывает на принадлежность штаммов хламидий к эпидемически значимой клональной линии. Обнаружена взаимосвязь указанных мутаций с адаптивной изменчивостью штаммов хламидий, направленной на эффективное преодоление патогеном межвидового барьера и селекцию эпидемически значимых, трудно диагносцируемых вариантов как у продуктивных животных, так и у человека. С помощью молекулярного типирования определены еще три доминирующие клональные линии хламидий, циркулирующие в России преимущественно у волонтеров из группы риска, состоящие из штаммов сиквенс типов: (1) ST6, ST9, ST10, ST270 и ST13 (ST13 как основатель группы), (2) ST2 и ST11 (основатель не установлен), (3) ST4, ST12, ST38 и ST118 (основатель группы - ST4). На основании анализа данных из международной базы PubMLST показано, что три указанных клональных комплекса состояли из известных штаммов хламидий, идентифицированных ранее на территориях Великобритании, США, Швеции, других Европейских государств и, позднее, России, а также идентифицированного нами нового ST270, представляющего собой промежуточный вариант между клональными группами I и III и относящегося к клональной линии ST13. При исследовании генетических полиморфизмов генов «домашнего» хозяйства штаммов хламидий, изолированных на территории сопредельного государства, оказано преимущественное генетическое родство клональных линий хламидий, циркулирующих в Европейской части Евразии. При этом выявлена новая клональная линия, сформированная штаммами ST95, не обнаруженная в настоящее время в РФ и не связанная напрямую с другими обнаруженными в рамках настоящего исследования штаммами хламидий. По результатам настоящего исследования представлены схемы молекулярно-генетического типирования возбудителя хламидиоза при исследовании материала от больных хламидиозом продуктивных животных, включающие обязательные этапы для целей локальной и глобальной эпидемиологии. Показана целесообразность проведения регулярного мониторинга штаммов хламидий на наличие или отсутствие типичных мутаций в соответствующих таргентных генах, мутации в которых приводят к приобретению резистентности к антибиотикам несмотря на то, что в рамках настоящего исследования таких вариантов выявлено не было. С помощью алгоритма, разработанного на предыдущем этапе выполнения проекта, сгенерированы GB-спеклы, типичные для гена omp1 разных видов хламидий: C. psittaci, C. abortus, C. pneumoniae и C. trachomatis, а также таргентного гена orf1 криптической плазмиды дикого и мутантных вариантов. Показана принципиальная возможность и перспективы дальнейшего применения предлагаемого метода для межвидовой дискриминации & дифференциации хламидий с целью получения быстрого и высокоточного результата, позволяющего определить принадлежность хламидий к к II (для штаммов C. psittaci), III (C. pneumoniae) группам патогенности или не обладающим, согласно действующим нормативным документам, потенциалом заразных, в том числе, особо опасных инфекций животных и человека, а также определения новых эпидемически значимых линий возбудителя хламидиоза как важный этап лабораторной диагностики хламидиоза для целей локальной и глобальной эпидемиологии. При изучении влияния хламидий на рост злокачественных новообразований в организме инбредных линий лабораторных животных (белые крысы линии Wistar) с применением методов спекл-микроскопии, допплеровский микроскопии и LASCA- имиджинга показана возможность мониторинга динамики роста опухолей в условиях in vivo неинвазивным путем без необходимости изолировать опухоль постмортально. Установлено, что обработка биомоделей препаратами хламидийных орнитозных антигенов может приводить к заметной частичной регрессии опухоли (примерно на 20%) по сравнению с контрольным животным, которое не подвергали инъекции соответствующих хламидийных антигенов. Нуклеотидные последовательности всех выявленных в настоящем исследовании вариантов хламидий депонированы в международные базы данных (NCBI и PubMLST) и доступны для широкой научной общественности в РФ и за ее пределами в электронном виде. При исследовании способности хламидий модулировать иммунный ответ по уровню спонтанной или антиген-стимулированной продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в модельных экспериментах на мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) здорового донора (который ранее не имел контактов с возбудителем хламидийной инфекции у животных и человека или с больным скотом, а также с клиническими проявлениями хламидийной инфекции), установлена ранняя продукция спектра провоспалительных (IFN-γ, TNF- α, IL-6) и регуляторных (IL-10) цитокинов. Сравнительные исследования показали более высокий уровень стимуляции при использовании инактивированных хламидийных клеток штаммов АМК и Ростиново-70, чем гомологичных орнитных антигенов; не было обнаружено существенной разницы между штаммами. Выявлено определенное снижение уровня продукции IFN-γ, основного защитного Th1-цитокина, у доноров с аллелем DQB1 * 06 по сравнению с донорами с аллелем DQB1 * 05. Обнаружена выраженная тенденция к увеличению продукции противовоспалительных Th2-цитокинов в ответ на стимуляцию инактивированными хламидийными клетками штаммов AMK и Ростиново-70 по сравнению с соответствующими гомологичными орнитными антигенами. Предполагается наличие определенной генетической детерминированности иммунного ответа на возбудитель хламидиоза; зарегистрирована относительно большая чувствительность доноров, являющихся носителями аллеля DBQ1 * 06, по сравнению с донорами с аллелем DQB1 * 05. Этот факт имеет большое значение при первичном контакте персонала, профессионально занятого в секторе животноводства, и непосредственно работающем с животными, потенциально больными хламидиозом, в свете высокого риска развития профессионального профессионального зооноза хламидийной природы, склонного к рекуррентному течению с повторяющимися эпизодами ре-инфицирования. Полученные данные суммированы в монографию, посвященную прояснению молекулярно-генетических механизмов эволюции и современной классификации возбудителей хламидиозов животных и человека, включающей 17 известных в настоящее время видов.

Публикации

1. Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ляпина А.М., Субботина И.А., Филонова Н.Н., Ульянов С.С., Федорова В.А. Speckle-interferometry and speckle-correlometry of GB-speckles Frontiers in Bioscience, Landmark, № 24, С. 700-711 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.2741/4744

2. Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Ляпина А.М., Бакулев А.Л., Ульянов С.С., Федорова В.А. Study of statistical properties of GB-speckles, generated on nucleotide sequences of omp1 gene of Chlamydia trachomatis, simulated using different algorithms of re-coding. Part II. Statistics of phase fluctuations Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0H (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2522583

3. Ульянова О.В., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Ляпина А.М., Бакулев А.Л., Ульянов С.С., Федорова В.А. Study of statistical properties of GB-speckles, generated on nucleotide sequences of omp1 gene of Chlamydia trachomatis, simulated using different algorithms of re-coding. Part I. Statistics of intensity fluctuations Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0G (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2522580

4. Ульянова О.В., Субботина И.А., Филонова Н.Н., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ляпина А.М., Скрипаль А. В., Добдин С.Ю., Ларионова О.С., Ульянов С.С., Федорова В.А. In-vivo pulse wave diagnostics of chicken embryo using high-frequency modulation of intensity of illuminating laser light Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0L (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2522990

5. Ульянова О.В., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Дыкман Л.А., Ульянов С.С., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ляпина А.М., Грашкина И.Г., Ларионова О.С., Федорова В.А. Amplification of output signal of laser scanning speckle-microscope using gold nanoparticles for detection of Chlamydia trachomatis bacteria. Part 1: theoretical study Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0O (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2523029

6. Ульянова О.В., Филонова Н.Н., Субботина И.А., Дыкман Л.А., Ульянов С.С., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ляпина А.М., Ларионова О.С., Федорова В.А. Amplification of output signal of laser scanning speckle-microscope using gold nanoparticles for detection of Chlamydia trachomatis bacteria. Part 2: experiments Proceedings of SPIE, Vol. 20, No. 55, P. 11065 0F (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1117/12.2522578

7. Ульянова О.В., Филонова Н.Н., Ульянов С.С., Дыкман Л.А., Ларионова О.С., Федорова В.А. Amplification of speckle-microscope signal by using gold nanoparticle stable of contents Frontiers in bioscience (Elite edition), - (год публикации - 2020)

8. Федорова В.А., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Султанахмедов Э.С., Бакулев А.Л., Ульянов С.С., Мотин В.Л. An Asymptomatic Patient with Fatal Infertility Carried a Swedish Strain of Chlamydia trachomatis with Additional Deletion in The Plasmid orf1 that Belonged to A Different MLST Sequence Type Microorganisms, Vol. 7, No. 187, P. 1-12. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3390/microorganisms7070187

9. Федорова В.А., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ульянов С.С., Мотин В.Л. Multi-locus sequence analysis reveals a novel sequence type of Chlamydia trachomatis in Saratov Region, Russia New Microbes and New Infections, Vol. 3, P.100584 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.nmni.2019.100584

10. Филонова Н.Н., Ульянова О.В., Субботина И.А., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Ульянов С.С., Федорова В.А. Когерентно-оптические методы – как один из способов ранней диагностики инфекций Агрофорсайт, № 1., C. 6 (год публикации - 2019)

11. Федорова В.А., Ляпина А.М., Хижнякова М.А., Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Субботина И.А., Филонова Н.Н., Колосова А.А., Ларионова О.С., Ульянова О.В., Грашкина И.Г., Ульянов С.С., Мотин В.Л. Хламидиозы животных и человека ФГУП "Издательство "Наука", г. Москва, 135 с. (год публикации - 2019)

12. Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Субботина И.А., Филонова Н.Н., Федорова В.А Молекулярно-генетическое типирование штаммов Chlamydia trachomatis Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, Т. 37- С.27 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.17116/molgen2019s-tez

13. Зайцев С.С., Салтыков Ю.В., Яковлев С.И., Ларионова О.С., Евстифеев В.В., Федорова В.А. Результаты пилотного секвенирования штамма хламидий зоонозного происхождения на платформе Illumina HiSeq 2500 Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, Т. 37, С. 27 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.17116/molgen2019s-tez

14. Салтыков Ю.В., Зайцев С.С., Субботина И.А., Федорова В.А. Полиморфизм гена omp1 Chlamydia trachomatis Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, Т. 37, С. 57 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.17116/molgen2019s-tez

15. - Наночастицы золота и антитела позволили расшифровать и оцифровать геном хламидий Индикатор, 28 августа 2019 (год публикации - )

16. - Ученые разработали метод диагностики хламидиоза с помощью наночастиц золота ТАСС, 28 августа 2019 (год публикации - )

17. - Российские ученые впервые расшифровали геном возбудителя хламидиоза газета.ru, 29 августа 2019 (год публикации - )

18. - Хламидию расшифровали и оцифровали Российские ученые применили новый подход к геному возбудителя известной инфекции Коммерсантъ, 02 сентября 2019 (год публикации - )

19. - С помощью саратовских ученых расшифрован геном хламидии СарБК, 29 августа 2019 (год публикации - )

20. - Российским ученым также удалось записать впервые расшифрованный геном возбудителя с высокой точностью Вести недели, 28 августа 2019 (год публикации - )

21. - Ученые разработали метод диагностики хламидиоза с помощью наночастиц золота New9 RU, 28 августа 2019 (год публикации - )

22. - Ученые разработали метод диагностики хламидиоза с помощью наночастиц золота РНФ, 30 августа 2019 г (год публикации - )

23. - Ученые разработали метод диагностики хламидиоза с помощью наночастиц золота yandex.ru, - (год публикации - )

24. - Хламидиоз начнут выявлять с помощью наночастиц золота Medical Note, 28 августа 2019 (год публикации - )

25. - Российские ученые впервые расшифровали геном возбудителя хламидиоза Об этом сообщает "Рамблер". Рамблер, 29 августа 2019 (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Не предусмотрено.