Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Впервые показана новая посттрансляционная модификация ключевого фермента эксцизионной репарации оснований (BER) ‒ ADP-рибозилирование апуриновой/эндонуклеазы 1 (АРЕ1), катализируемое PARP1. Обнаруженная зависимость эффективности модификации от структуры ДНК свидетельствует о том, что ковалентное присоединение ADP-рибозы (PAR) к АРЕ1 происходит в тройном комплексе с ДНК-интермедиатом и автомодифицированной PARP1 и зависит от взаимного расположения белков. Модификация полноразмерной и укороченных с N-конца форм АРЕ1, индуцируемая оптимальной для этого процесса структурой ДНК, усиливается в присутствии Polβ и XRCC1 и превосходит существенно уровень модификации Polβ. Укороченные формы модифицируются в разных условиях более эффективно, чем полноразмерная АРЕ1, что указывает на локализацию сайтов ADP-рибозилирования в С-концевой каталитической части фермента. Впервые показана и охарактеризована PAR-связывающая активность АРЕ1 и Polβ. Ферменты сравнимы по эффективности их взаимодействия с полимерами разной длины, но уступают белкам XRCC1 и YB-1. АРЕ1 и Polβ взаимодействуют более эффективно с длинными и разветвленными цепями PAR, чем с короткими. Связывание PAR с Polβ подавляется более эффективно в присутствии gap-DNA, чем расщепленной AP-DNA (AP-inc-DNA), а в случае АРЕ1 более выражена конкуренция между PAR и AP-inc-DNA, что коррелирует со сродством разных ДНК к данным ферментам. Удаление специфичного для эукариот N-концевого удлинения АРЕ1 (APE1NΔ61) и особенно его положительно заряженного фрагмента (APE1NΔ35) оказывает негативное влияние на PAR-связывающую активность и конкуренцию между PAR и ДНК. В целом, полученные результаты позволяют предположить, что как прямые белок-белковые взаимодействия АРЕ1 и PARP1, так и опосредованные поврежденной ДНК или синтезированным PAR-полимером могут обеспечивать сборку «репаросом» в процессе BER. Главную роль в регуляции ДНК- и PAR-связывающей активностей АРЕ1 играет его N-концевое удлинение. Впервые с использованием метода динамического светорассеяния показано, что большинство белков системы BER (Polβ, APE1, XRCC1, TDP1 и PARP) существуют в равновесных условиях в растворе в основном как димеры, а их бинарные комплексы как гетеротетрамеры (димеры гетеродимеров). Склонный к гомотетрамеризации белок PARP1 формирует гетеротетрамеры с другими белками, а его комплекс с XRCC1 – равновесная смесь гетеротетрамера и октамера. Такая мультимеризация PARP1 и его комплекса с XRCC1 позволяет предположить архитектурную роль PARP1 в сборке преформированных «репаросом» (в отсутствие синтеза PAR). Впервые зарегистрировано образование больших конгломератов, стабилизированных межмолекулярными связями с участием ионов Mg2+, в процессе автомодификации PARP1 и PARP2. Это явление может играть функциональную роль в BER благодаря созданию динамических компартментов. Обнаружено, что XRCC1 подавляет более эффективно автомодификацию PARP2 по сравнению с PARP1, оказывая влияние не только на длину синтезируемого PAR-полимера, но и на олигомерное состояние комплекса моно(ADP-рибозил)ированного PARP2 с XRCC1 (гетеродимера, в отличие от гетеротетрамерной формы комплекса). Показано, что мультифункциональный белок YB-1 стимулирует активность PARP1 в присутствии двухцепочечных модельных ДНК, что сопровождается высоким уровнем поли(ADP-рибозил)ирования как PARP1, так и YB-1. YB-1 ингибирует активность PARP1 в присутствии одноцепочечной ДНК. Установлено, что YB-1 стимулирует расщепление АР-сайтов, катализируемое АРЕ1. Для изучения комплексов PARP1 и PARP2 с ДНК-интермедиатами BER методом АСМ, были синтезированы протяженные ДНК-структуры (1400 п.н.), содержащие в качестве повреждения урацил (U) в заданной позиции цепи ДНК и далее с использованием APE1 и Polβ получены еще 2 ДНК-интермедиата BER. Для сравнения специфичности связывания PARP1 и PARP2 с АР-сайтом, брешью или разрывом в ДНК методом АСМ было проанализировано взаимодействие этих белков с соответствующими субстратами. На основании анализа АСМ-изображений и статистического распределения белковых комплексов, регистрируемых вдоль молекулы ДНК, были рассчитаны кажущиеся константы диссоциации комплексов этих белков с AP-сайтом, брешью или разрывом ДНК: 31, 6.0 и 5.8 нМ для PARP1 и 142, 22 и 3.7 нМ для PARP2 соответственно. Согласно полученным данным, PARP2 связывается с АР-сайтом и брешью примерно в четыре раза менее эффективно, чем PARP1. При этом сродство к разрыву сопоставимо для обоих белков. Полученные результаты указывают на то, что PARP2, аналогично PARP1, может связываться с ранними интермедиатами BER, но эффективно конкурировать с PARP1 только за связывание с разрывом, не исключено также формирование функционально активного гетеродимера PARP1-PARP2 в присутствии данного типа повреждения ДНК. При исследовании механизма репарации объемных повреждений ДНК (NER) с помощью методов молекулярной динамики доказана взаимосвязь искажений двухцепочечной структуры областей ДНК, близких к повреждению, и эффективности эксцизии повреждения системой NER. nAnt-ДНК имеет область значительной дестабилизации структуры, смещенную в 5'-сторону от повреждения, что оптимально для эксцизии. В случае Flu-dU-ДНК выявлено существование обширной области дестабилизации, что приводит к неоптимальному связыванию ХРС и снижению уровня эксцизии. В случае Fap-dC-ДНК участок дестабилизации регулярной двухцепочечной структуры ДНК располагается с 3'-стороны от повреждения, что приводит к образованию непродуктивных комплексов ХРС-ДНК и последующему ингибированию эксцизии. Созданы модельные ДНК, в которых напротив объемного повреждения (nAnt или dC-FAB) расположены остатки nFlu или DEG (диэтиленгликоль). Методом дифференциального плавления показано, что введение nFlu в позиции от -3 до +3 снижает термостабильность ДНК на 10-13°С. Методом равновесного флуоресцентного титрования показано, что белок-сенсор объемных повреждений – XРС – обладает наибольшим сродством к ДНК, содержащим кластеры с повреждениями dC-FAB/nAnt и DEG, расположенными на расстоянии меньше 4 п.н. Эффективность удаления фрагмента, содержащего объемное повреждение, была резко снижена, если повреждения разделяло менее 4 п.о. В то же время, вставка DEG, сдвинутая на 8-20 п.о. относительно объемного повреждения, не влияла на уровень эксцизии данного повреждения из модельной ДНК. Для ДНК с DEG в участке от -6 до+6 наблюдается отрицательная зависимость между сродством к ХРС и ее субстратными свойствами. Таким образом, после связывания ХРС с исследованными структурами ДНК продуктивные комплексы не формируются, вероятно, в результате неоптимального связывания ХРС с локусом повреждения. С использованием специфических субстратов проведен сравнительный анализ активности ряда ферментов BER в цельноклеточных экстрактах фибробластов Heterocephalus glaber (Hgl) и Mus musculus (Mmu) для сравнения с выполненными на предыдущем этапе исследованиями с использованием NER-компетентных экстрактов, в которых часть белков может быть утрачена при их приготовлении. Активность флэпэндонуклеазы 1 проверена в различных препаратах экстрактов Hgl и Mmu. Несмотря на варьирование времени реакции и концентрации белков экстракта, ни в одном случае не удалось достоверно зарегистрировать активность этого фермента. Анализ АР-лиазной активности экстрактов, проведенный с использованием одно- и двухцепочечной АР-ДНК, продемонстрировал, что экстракты Hgl и Mmu различаются по паттерну расщепления АР-сайтов в составе одно- и двухцепочечной ДНК. Различие в специфичности экстрактов клеток Hgl и Mmu в расщеплении АР-сайтов в зависимости от типа ДНК, позволяет предположить разный уровень в этих экстрактах АР-лиаз, специфически функционирующих на одно- и двухцепочечных субстратах. Анализ зависимости степени выщепления 5ʹ-dRP-остатка в целом показал более высокую активность в Hgl. Следует отметить, что суммарная 5ʹ-dRP-лиазная активность обусловлена не только действием ДНК-полимеразы β но и ряда других белков, к числу которых относятся PARP1, PARP2, NEIL1 и NEIL2. Действительно, в условиях синтеза ДНК, когда проявляется 5ʹ-dRP-лиазная активность Polβ, степень выщепления 5ʹ-dRP остатка несколько увеличена. В совокупности это указывает на значительный вклад других 5ʹ-dRP-лиаз экстракта (кроме Polβ) в общую эффективность выщепления 5ʹ-dRP остатка. Сравнительный анализ эффективности удаления остатков урацила из ДНК и расщепления АР-сайтов показал, что эффективности протекания указанных реакций в экстрактах различаются не более чем на 20%. Экстракт клеток Mmu более активен в выщеплении урацилов, а экстракт Hgl обладает большей эффективностью в расщеплении АР-сайтов. Профили эффективности выщепления урацила и расщепления АР-сайтов в зависимости от структуры использованной ДНК между экстрактами отличаются несущественно. Следует отметить, что АР-эндонуклеазная активность в цельноклеточных экстрактах более чем на порядок выше, чем в NER-компетентных экстрактах, а эффективность выщепления урацила мало зависит от способа приготовления экстракта. На основании данных сшивки ДНК (с одиночными и кластерными АР-сайтами) с белками экстрактов фибробластов Hgl с разным временем культивирования после облучения и индивидуальным HMGB1 выдвинуто предположение, что продукт 37 кДа (который имеет повышенную интенсивность в экстрактах клеток Hgl, культивированных в течение 1, 3 или 9 час после УФ-облучения) связан с HMGB1, и именно повышенным содержанием этого белка может быть обусловлен стимулирующий эффект в синтезе ДНК по длиннозаплаточному пути BER. Показано, что скорость синтеза PAR в цельноклеточных экстрактах фибробластов Hgl, выше, чем в мышиных экстрактах, а скорости деградации PAR сопоставимы. Анализ PAR-илированных белков в экстрактах Hgl и MMu, проведенный в условиях моно- и поли(ADP-рибозил)ирования, не выявил других белков-мишеней, кроме PARP1. Изучен апоптотической ответ фибробластов Hgl и Mmu с использованием трех потенциально проапоптотических агентов с различным механизмами действия на клетки: метилметансульфонат (MMS), 5-фторурацил и этопозид. Анализ показал, что во всем интервале концентраций воздействующих цитотоксических агентов метаболическая активность у клеток голого землекопа остается более высокой по сравнению с клетками мыши. Совокупность данных МТТ-теста и проточной цитометрии для клеток, подвергнутых цитотоксическому воздействию, свидетельствует о большей устойчивости фибробластов Hgl к цитотоксическим факторам с различным механизмом действия. Влияние 5-фторурацила и этопозида на оба типа клеток имеет в целом одинаковый характер – количество апоптотических клеток растет с увеличением дозы реагента, при высоких его концентрациях – резко падает, но увеличивается количество клеточного дебриса. Ожидалось, что в таком случае должен увеличиваться процент клеток, погибающих путем некроза. Однако в наших экспериментах с использованием этопозида и 5-фторурацила популяция некротических клеток не увеличивалась. При обработке изучаемых клеток MMS фибробласты мыши формируют значительную (до 40 % от общего количества клеток) популяцию апоптотических клеток, а фибробласты Hgl в основном принадлежат к популяции некротических (или поздне-апоптотических) клеток. Таким образом, на данном этапе проекта получены абсолютно новые результаты проливающие свет на структурно-функциональную организацию «репаросом» млекопитающих и роли PARP1, PARP2 и поли(АDP-рибозил)ирования в комплексах репарации. Запланированные исследования проведены полностью. Помимо опубликованных ряд статей находится в журналах на этапе заключительного рецензирования в журналах PLoS ONE, Scientific Reports, Analytical Biochemistry, Nucleic Acids Research, Oncotarget.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
С целью создания полной картины взаимодействий белков в cистеме эксцизионной репарации оснований (BER) и их роли в координации процесса в дополнение к ранее охарактеризованным нами комплексам ключевых участников (АРЕ1, Polβ, XRCC1, TDP1 и PARP1) [Moor et al, 2015, Nucleic Acids Res; Vasil’eva et al, 2018, Biochem Byophys Acta; Моор, Лаврик, 2018, Биохимия] исследованы взаимодействия второго фермента семейства PARP (PARP2) и ДНК-лигазы IIIα (LigIIIα), завершающей процесс репарации, с другими белками равновесными методами флуоресцентной спектроскопии и впервые измерены кажущиеся константы диссоциации комплексов (EC50). Значения EC50 для гомо-олигомера PARP2 и его гетеро-олигомера с PARP1 практически одинаковы и сравнимы с EC50 для гомо-олигомера PARP1. Эти данные подтверждают предположение о функционировании двух белков семейства PARP в процессе BER в виде гетеро-олигомера [Schreiber et al, 2002, J Biol Chem]. Константы диссоциации комплексов PARP2 с Рolβ и XRCC1 сопоставимы и превышают соответствующие величины для комплексов PARP1. Более низкое сродство PARP2 к белкам-партнерам может быть обусловлено отсутствием в нем характерного для PARP1 BRCT-домена, ответственного за взаимодействие с белками. Сродство PARP2 к Рolβ и XRCC1 увеличивалось в разной степени в присутствии ДНК-интермедиата с однонуклеотидной брешью (субстрата Рolβ), что указывает на ДНК-зависимую регуляцию эффективности взаимодействия PARP2 с другими белками системы BER. Такое свойство PARP2 отличает его от PARP1. ДНК-интермедиаты не влияют на сродство PARP1 к Рolβ и XRCC1, несмотря на структурные перестройки комплексов, зарегистрированные методом FRET [Moor et al, 2015, Nucleic Acids Res]. Не исключено, что поли(ADP-рибозил)ирование PARP2 играет основную роль в регуляции его взаимодействия с белками в процессе формирования мультибелковых ансамблей (репарасом). Зарегистрированы и охарактеризованы гомо-олигомеризация LigIIIα и ее взаимодействие с Polβ и XRCC1. Самым прочным является комплекс LigIIIα с XRCC1, что согласуется с литературными данными: XRCC1 рассматривается как постоянный партнер LigIIIα, необходимый для защиты от внутриклеточной деградации [Caldecott et al, 1995, Nucleic Acids Res; Fang et al, 2014, Nat Commun]. Cравнительное исследование реакции поли(ADP-рибозил)ирования, катализируемой PARP1 и PARP2 в отсутствие и в присутствии известных мишеней (ADP-рибозил)ирования, Рolβ и XRCC1, показало, что в одинаковых экспериментальных условиях XRCC1 ингибирует гораздо эффективнее автомодификацию PARP2, чем автомодификацию PARP1. XRCC1 превосходит Рolβ в ингибирующем действии на автомодификацию как PARP1, так и PARP2. PARP1 модифицирует XRCC1 более эффективно, чем Рolβ, в то время как в случае PARP2 не выявлено различий в эффективности (ADP-рибозил)ирования этих мишеней. В условиях сравнимых уровней автомодификации PARP1 и PARP2 белок XRCC1 модифицируется гораздо эффективнее в присутствии PARP1, чем в присутствии PARP2. Согласно общепринятым представлениям о механизме функционирования системы BER, XRCC1 – основной партнер PAR-PARP1 при инициации репарации одноцепочечных разрывов благодаря высокому сродству к коротким полимерам ADP-рибозы [Caldecott, 2014, Exp Cell Res]. Полученные нами результаты позволяют предположить, что относительный вклад PARP1 и PARP2 в координацию процессов BER может зависеть от уровня экспрессии белка XRCC1. Поли(ADP-рибозил)ирование белков модулирует их физико-химические свойства и функции [Teloni et al, 2016, Nucleic Acids Res]. В проведенном нами исследовании АР-эндонуклезной активности АРЕ1 после PARP1-катализируемого (ADP-рибозил)ирования не обнаружено влияния новой посттрансляционной модификации ключевого фермента BER на его основную активность. Выявлена строгая корреляция между начальной скоростью расщепления АР-сайт-содержащих ДНК, различающихся контекстом, и эффективностью (ADP-рибозил)ирования АРЕ1 в присутствии этих ДНК в роли активаторов PARP1. Полученные результаты указывают на то, что эффективность модификации зависит не только от стабильности комплекса АРЕ1 с ДНК (как показано нами ранее), но и от способа связывания АР-ДНК в активном центре АРЕ1. Исследования (ADP-рибозил)ирования АРЕ1, катализируемого PARP2, не выявили зависимости эффективности модификации от структуры ДНК. Этот результат указывает на уникальное свойство PARP1 катализировать модификацию АРЕ1 по ДНК-зависимому механизму. Дальнейшая локализация сайта(ов) модификации для позволит установить ее биологическую роль. В отличие от других белков системы BER, АРЕ1 характеризуется наиболее многочисленными и разнообразными типами посттрансляционной модификации, которые модулируют в основном функции АРЕ1 как регулятора транскрипции [Limpose et al, 2017, DNA repair]. В результате сравнительного анализа эффективности автоPARилирования PARP1 и PARP2, активируемых протяженными ДНК-структурами (1400 или 1200 п.о.) c различными типами повреждений в одной из цепей (одноцепочечный разрыв, однонуклеотидная брешь или АР-сайт) обнаружено, что только в случае PARP2 эффективность автомодификации строго коррелирует со сродством этого белка к ДНК-повреждению, оцененному методом атомно-силовой микроскопии [Sukhanova et al, 2016, Nucleic Acids Res]. Отсутствие такой корреляции в случае PARP1 может быть обусловлено более высоким вкладом автомодификации этого белка за счет взаимодействия с тупыми концами ДНК в общий уровень. Анализ синтеза PAR при совместном присутствии PARP1 и PARP2 выявил снижение эффективности синтеза PAR в сравнении с PARP1-катализируемой реакцией только в случае ДНК-субстратов, содержащих одноцепочечный разрыв или однонуклеотидную брешь. Наблюдаемый эффект может быть как следствием конкуренции между этими белками, так и результатом прямого взаимодействия PARP1 и PARP2 на сайте повреждения и формирования гетеродимера, который обладает более низкой ферментативной активностью, чем мономер или димер PARP1. В результате исследования модификации ряда основных и вспомогательных белков системы BER ДНК-зависимыми поли- и моно(ADP-рибоза)трансферазами (PARP1/PARP2 и PARP3) с целью проверки гипотезы о кооперативном действии этих ферментов в пошаговом синтезе поли(ADP-рибозы) на белках, как показано нами в случае ADP-рибозил)ирования ДНК [Belousova et al, 2018, Sci Rep], найдена селективная мишень для PARP3. Таким белком является ДНК-полимераза ι. Поли(ADP-рибозил)ирования Polι не обнаружено при последовательной модификации, катализируемой PARP1/PARP2 и PARP3, что не исключает возможность ступенчатого (ADP-рибозил)ирования Polι in vivo с участием дополнительных факторов. В результате исследования действия белка YB-1 на PAR-синтезирующую активность PARP1 с использованием делеционных мутантов YB-1 установлено, что главная роль в стимулирующем действии принадлежит положительно заряженному C-концевому домену YB-1. Его основной вклад в эффект активации проявляется в отсутствие ионов магния. Результаты исследования стимулирующего действия белка YB-1 на активность PARP1 в присутствии его ингибиторов позволяют предположить, что применение ингибиторов PARP1 совместно с ДНК-повреждающими агентами при терапии онкологических заболеваний может быть особенно выгодной стратегией в отношении опухолей, сверхэкспрессирующих YB-1. Однако, учитывая стимулирующий эффект YB-1 на активность PARP1, следует иметь в виду, что в этом случае для эффективной терапии могут потребоваться повышенные дозы ингибиторов PARP1. Результаты опубликованы в журнале Oncotarget (Alemasova et al, 2018). В рамках исследования функциональной роли PARилирования RPA, катализируемого PARP1, показано, что эффективность модификации RPA в присутствии частичных ДНК-дуплексов с протяженным одноцепочечным (оц) участком, зависит от ориентации этого участка – эффективность модификации RPA в случае ДНК с выступающим 3'-концом значительно выше, чем с 5′-концом. Предложена модель связывания RPA и PARP1 с такими ДНК, объясняющая наблюдаемое различие. Можно предположить, что таким образом регулируется участие RPA в процессах репликации и рекомбинации ДНК, протекающих с образованием ДНК-интермедиатов с 5′- и 3′-выступающими оц участками. Подтверждена специфичность обнаруженного ранее стимулирующего влияния RPA на активность PARP1. Результаты опубликованы в журнале DNA Repair (Maltseva et al, 2018). С целью изучения особенностей функционирования репаросомы долгоживущего животного, голого землекопа (Heterocephalus glaber, Hgl), проведен сравнительный анализ количества мРНК ряда основных и регуляторных белков репарации в клетках голого землекопа и мыши до и после воздействия генотоксических реагентов. Показано, что уровни мРНК ряда белков BER и NER изменяются более значительно в ответ на UVC-облучение клеток [Evdokimov et al, 2018, Aging], чем при обработке перекисью водорода или метиметансульфонатом. Проведен сравнительный анализ эффективности элонгации праймера ДНК-полимеразами цельноклеточных или фракционированных (NER-компетентных) экстрактов фибробластов мыши, голого землекопа и человека с использованием субстратов коротко- и длиннозаплаточного путей BER. Электрофоретический анализ набора продуктов синтеза ДНК и количественная оценка распределения этих продуктов свидетельствуют о более эффективном синтезе в экстрактах клеток голого землекопа и человека по сравнению с экстрактами мыши, в особенности с учетом длины образующихся продуктов. В NER-компетентных экстрактах фибробластов мыши и голого землекопа обнаружены различия в паттернах синтеза ДНК при сопоставимой эффективности синтеза [Evdokimov et al, 2018, Aging]. Анализ активности синтеза и деградации PAR в исследуемых экстрактах показал, что скорость синтеза PAR в экстрактах Hgl примерно в 3 раза выше, чем в экстрактах мыши. Скорости расщепления PAR различались примерно в 1,5 раза. Следует отметить, что более высокая скорость синтеза PAR в экстрактах клеток голого землекопа по сравнению с мышью согласуется с данными литературы о большей эффективности этого процесса в клетках других долгоживущих организмов [Beneke et al, 2000, Exp Gerontol; Beneke et al, 2010, Mech Ageing Dev]. Анализ результатов фотоаффинной модификации белков экстрактов и индивидуальных белков фотоактивными FAP-dCMP-содержащими аналогами ДНК-субстратов BER показал, что в экстракте клеток человека HEK293T эффективно образуются аддукты ДНК с белками, соответствующими PARP1 и обеим субъединицам Ku70 и Ku80 Ku-антигена. В экстракте Hgl регистрировались незначительные количества продуктов, которые можно отнести к PARP1, а в экстракте клеток мыши такие продукты не детектировались. Сшивки ДНК с белками экстрактов, которые можно отнести к Polβ и FEN1, однозначно детектировались с сопоставимой интенсивностью во всех трех экстрактах, что коррелирует с эффективностью синтеза ДНК в экстрактах. Интенсивность продуктов, относимых к HMGB1 – кофактору BER [Prasad et al, 2007, Mol Cell], сопоставима для экстрактов клеток грызунов и ниже, чем в экстракте НЕК293Т. Анализ продуктов сшивки белков экстрактов и ряда индивидуальных белков с набором 5'-dRP-ДНК показал, что в экстракте НЕК293Т регистрируются продукты, которые можно отнести к PARP1 и Ku70 и Ku80 субъединицам Ku-антигена, тогда как в экстрактах клеток голого землекопа и мыши соответствующие продукты не детектируются. В целом, данные по модификации белков экстрактов клеток грызунов и человека химически активными ДНК-интермедиатами репарации (фотоактивными или 5'-dRP-содержащими) хорошо согласуются между собой и демонстрируют общие закономерности. Для клеток человека по сравнению с другими исследованными клетками характерно очень высокое содержание PARP1 и Ku-антигена, что может обусловливать значительные различия в эффективности репарации некоторых типов повреждений ДНК и способов регуляции репаративных процессов в клетках человека и грызунов. В результате исследований генотоксического воздействия проапоптотических реагентов MMS, 5-фторурацила и этопозида на клетки голого землекопа и мыши было выяснено, что клетки голого землекопа отличает большая устойчивость ко всем видам использованных реагентов: снижение метаболической активности клеток, а также их гибель происходят при более высоких концентрациях цитотоксических агентов. При этом клетки голого землекопа, в отличие от клеток мыши, демонстрируют особую устойчивость к некоторым проапоптотическим реагентам, как показано в нашем исследовании на примере 5-фторурацила. Повышение активности каспаз при действии проапоптотических реагентов было зарегистрировано как в клетках голого землекопа, так и в клетках мыши, однако в клетках мыши такое повышение было заметно более выраженным. Анализ зависимости изменения активности каспаз от времени, показал, что каскад апоптотических событий в клетках голого землекопа протекает быстрее, а элиминация клеток занимает меньшее время по сравнению с аналогичными процессами в клетках мыши. Данные, полученные с использованием проточной цитометрии, электронной микроскопии и измерения активности каспаз во времени, позволили подтвердить возникшее на предыдущих этапах выполнения проекта предположение, что при высоких дозах токсических агентов клетки голого землекопа, в отличие от клеток мыши, подвергнутых аналогичным воздействиям, погибают предпочтительно путем некроза, а не апоптоза. Таким образом на завершающем этапе проекта выполнены все запланированные работы и получены важные результаты, значительно расширившие представления о структурно-функциональной организации репаросом млекопитающих и ее регуляции, а также о функционировании систем репарации в клетках долгоживущего организма и их ответа на генотоксические воздействия.