Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Наш проект направлен на характеристику новых ферментов и ферментных систем экстремофильных микроорганизмов, исследование механизмов катализа ферментов с необычными функциями и анализ их пространственной структуры с целью выявления характерных особенностей структурной организации ферментов экстремофильных микроорганизмов, определяющих их стабильность и эффективное функционирование в условиях среды обитания. В рамках исследования основных ферментов энергетического метаболизма галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio продолжено изучение структуры и функции нового медь-зависимого фермента - тиоцинатдегидрогеназы (TCDH) из бактерии Tv. paradoxus. Основной задачей на данном этапе выполнения проекта была формулировка и верификация механизма действия TcDH с привлечением данных структурного и функционального анализа, направленного мутагенеза, ЭПР и QM/MM моделирования. Для получения воспроизводимых результатов и корректного сравнения разных препаратов TcDH стандартизирована процедура активации нативной и рекомбинантной TcDH ионами меди. Показано, что полностью активные препараты TcDH содержат не менее трех ионов меди. Согласно данным ЭПР, независимо от способа активации все ионы меди находятся в окисленном состоянии. Получена структура рекомбинантной формы TcDH (разрешение 2.0 А) с тремя ионами меди в активном центре в комплексе с ингибитором – иодид-ионом. Эта структура использована для QM/MM расчета молекулярных стадий реакции разложения тиоцианата в активном центре TcDH. В финальной модели строения фермент-субстратного комплекса атом серы тиоцианата расположен между ионами меди 2 и 3, подобно иодид-иону в стартовой структуре, и образует координационную связь с ионом меди 3. Атом азота тиоцианата при этом образует координационную связь с ионом меди 1. Консервативная молекула воды W1, которая присутствует в экспериментальной и теоретической структурах, образует водородные связи с остатками Glu288 и His136. Отрыв протона от воды W1 и перенос его на His136 приводит к образованию координированного с ионом меди 2 каталитического гидроксила, атакующего атом С тиоцианата с образованием переходного состояния. Механизм химической стадии реакции, основанный на QM/MM симуляции, включает расщепление C-S связи, протекающее в одну стадию с энергией активации 16,4 ккал/моль, которая согласно теории переходного состояния соответствует константе скорости 9 с-1 при 303 К, что превышает экспериментально определенную константу скорости для реакции с цитохромом с (5.4 с-1) и близко к константе скорости реакции с низкомолекулярными акцепторами электронов (8-13 с-1). По-видимому, в реакции с цитохромом с лимитирующей стадией является не разрыв связи C-S, а перенос электрона на высокомолекулярный акцептор. Мутации каталитически значимых остатков His136 и Glu288, приводили к получению неактивных препаратов, что подтверждает роль этих остатков катализе и предполагаемый механизм катализа. Мутация His482, участвующего в связывании иона меди 3, на Gln также приводила к получению неактивного фермента. Для установления структурных факторов, отвечающих за инактивацию TcDH при этой мутации, получены кристаллы мутанта His482Gln для последующего рентгеноструктурного анализа. Продолжена работа по изучению гомологичных восьмигемовых нитритредуктаз из галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio и нейтрофильных негалофильных бактерий рода Geobacter, которые в нашем проекте являются одним из объектов анализа структурных механизмов адаптации белков к экстремальным условиям. Для проведения сравнительного структурного анализа впервые выделена и охарактеризована восьмигемовая нитритредуктаза (GaNiR) из Geobacter ammonificans. Получены кристаллы GaNiR, собран набор кристаллографических данных до разрешения 1.8 А. Интерес к исследованию GaNiR связан еще и с тем, что это первая восьмигемовая нитритредуктаза, для которой подтверждено участие в респираторной аммонификации нитрита в клетке. Ранее в нашей лаборатории была подробно исследована восьмигемовая нитритредуктаза (TvNiR) из галоалкалофильной бактерии Tv. nitratireducens, однако физиологическая функция этого белка в клетке не была установлена до конца. Продолжены работы по структурно-функциональной характеристике новых трансаминаз III и IV классов, стереоспецифичных в реакциях с первичными (R)- и (S)- аминами, представляющих интерес для биотехнологических приложений. Акцент в биотехнологической составляющей проекта в 2017 году был сделан на исследовании стабильности и субстратной специфичности трансаминаз, на анализе структур с целью выявления особенностей организации активного центра. Проанализирована устойчивость в органических растворителях трансаминаз (ТА) из бактерии Thermobaculum terrenum и из археи Methanococcus vanielii. Обнаружено, что ТА из T. terrenum сохраняет 100% активности после 24 часов инкубации при 50 °С в 50% диметилсульфоксида (ДМСО) и 50% ацетонитрила и 70 и 85%% активности в 50% метанола и 50% этанола, соответственно, в Tris-буфере рН=8.0. Кроме того, добавление 15% растворителя (ДМСО, ацетонитрила или метанола) в реакционную смесь при 50 °С увеличивает активность ТА в 1.5-1.6 раза. На основании полученных данных был сделан вывод, что ТА из T. terrenum стабильна в водно-органических смесях, операционная стабильность фермента позволяет вводить органические растворители в реакционную смесь. Неожиданно оказалась нестабильна при высоких температурах и в водно-органических смесях ТА из археи M. vanielii, поэтому далее как перспективный фермент для биотехнологии она рассматриваться не будет. Сравнение свойств двух трансаминаз подтверждает общее наблюдение, что термостабильность ферментов коррелирует с устойчивостью в водно-органических средах. В рамках проекта проведен анализ структур холо-формы ТА из T. terrenum, холо-формы ТА из M. vanielii и ее комплекса с необратимым ингибитором габакулином. Проведен сравнительный анализ субстрат-связывающей полости и активного центра обеих трансаминаз. Обнаружено, что малый субстрат-связывающий карман TA из M. vanielii имеет больший размер по сравнению с малым карманом TA из T. terrenum, а большие карманы имеют сходный размер, но существенно разную форму за счет различного расположения больших гидрофобных групп, образующих этот карман. Эти различия, по-видимому, влияют на субстратную специфичность данных ферментов. Для ТА из T. terrenum была проведен детальный анализ остатков, формирующих большой и малый карманы субстрат-связывающей полости, были определены элементы структуры и отдельные остатки, которые, по нашему наблюдению, отвечают за реализацию нового варианта двойного субстратного узнавания, наблюдаемого в TA из T.terrenum: распознавание отрицательно заряженного кетосубстрата альфа-кетоглутарата и аминосубстрата - ароматического R-первичного амина в одном центре. Нами была установлена принципиальная возможность связывания в большом и малом карманах активного центра ТА из T. terrenum как заряженных групп, так и гидрофобных фрагментов молекул субстратов. Связывание гидрофобного ароматического амина было уточнено молекулярным докингом (R)- альфа метилбензиламина (R-MBA) в активный центр трансаминазы. В целях улучшения эффективности ТА из T.terrenum в реакции с (R)-первичными аминами были сконструированы и выделены мутанты с мутациями в малом кармане (M1:R43S, M2:R43S+Y101F, M3:R43S+G41V+Y101F) в большом кармане (M4:Arg115) и в малом и большом карманах одновременно (М5: R43S+G41V+Y101F+F39Y, M6: R43S+G41V+Y101F+W32H, M7: R43S+G41V+Y101F+F39Y+W32H, M8: R43S+G41V+Y101F+S115R, M9: R43S+G41V+Y101F+S115R+вставка А108). Выбор мутаций определялся консервативностью остатка и его ролью в катализе у грибных R-амин:пируват трансаминаз. Мутация Arg43 в малом кармане привела к снижению активности ТА из T.terrenum в полной реакции из-за нарушения координации альфа-карбоксильной группы кетосубстрата (пирувата или альфа-кетоглутарата), мутант M3 полностью потерял активность в полной реакции. Однако, как следует из кинетических параметров полуреакции с субстратом R-MBA, эффективность деаминирования R-MBA у M3 повысилась в 21 раз. Наиболее эффективным в полуреакции c R-MBA оказался М8: эффективность деаминирования R-MBA возросла в 100 раз. При этом мутация S115R привела к частичному восстановлению активности фермента в полной реакции с кетосубстратом альфа-кетоглутаратом. То есть сформировался новый сайт связывания альфа-кетосубстрата вместо разрушенного в малом кармане. При этом рН оптимум полной реакции (R-MBA+альфа-кетоглутарат) сместился в рН=7.0. Единичная мутация S115R в диком типе (мутантная форма М4) не привела к значительному повышению эффективности деаминирования R-MBA, кроме того активность М4 в полной реакции снизилась до уровня активности М8. Удлинение петли – вставка A108- в M9 не привела к улучшению связывания R-MBA и росту активности фермента в полной реакции. Мутанты М5, М6 и М7 были не активны в полной реакции, эффективность деаминирования R-MBA была выше, чем у дикого типа, но ниже чем у М3. Таким образом, в результате мутагенеза достигнуто повышение эффективности деаминирования R-MBA, однако увеличить скорость полной реакции трансаминирования, катализируемой ТА из T. terrenum, пока не удалось. Были успешно продолжены работы по структурно-функциональной характеристике омега-трансаминазы из психрофильной бактерии Psychrobacter cryohalolentis (Pcryo0361), которая относится к малоизученному семейству узкоспецифичных трансаминаз 7,8-диаминопеларгоновой кислоты (DAPA_TA) и отличается нехарактерной для DAPA_TA специфичностью к (S)-альфа-метилбензиламину, альдегидам и дикетонам. Детально была охарактеризована специфичность фермента к дикетонам и низкотемпературная активность фермента. Установлено, что при 35 ºС специфическая активность Pcryo0361 в полной реакции убывает в ряду бензальдегид>2,3-гександион>2,3-пентандион>2,3-бутандион> изобутаналь. Значения специфической активности с дикетонами при 35 °С составили 0.17-0.24 U/mg (это высокий уровень активности для данного семейства трансаминаз даже для специфического субстрата7-кето-8-аминопеларгоновой кислоты). При 0 °С в полной реакции с 2,3-пентандионом Pcryo0361 сохраняет 70% активности от значений при 35 °С. Показано, что активность Pcryo0361 в стандартном эксперименте не изменяется в течение 4 часов при инкубации при 0 ºС в 100 мМ карбонатном буфере рН=10.0. При инкубации при 5 ºС в тех же условиях активность фермента в стандартном эксперименте снижается на 30% за первый час и далее не меняется в течение 3 часов. Другими словами за указанный период времени низкотемпературной денатурации не наблюдается и, кроме того, фермент сохраняет активность в отличие от инкубации при 35 °С в течение нескольких часов. Уточненная структура Pcryo0361 депонирована в банк данных RCSB (www.rcsb.org) с кодом 6ERK.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках исследования основных ферментов энергетического метаболизма галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio продолжено изучение структуры и функции нового медь-зависимого фермента - тиоцинатдегидрогеназы (TcDH) из бактерии Tv. paradoxus. Согласно нашим данным, строение каталитического медного кластера TcDH, содержащего три иона меди, не имеет аналогов среди других медь-содержащих белков, что в свою очередь обеспечивает возможность катализа ранее не описанной реакции окисления тиоцианата до цианата и элементной серы. Для изучения молекулярного механизма действия TcDH: -оптимизирована процедура активации TcDH ионами меди с контролем результата по активности, данным металлоанализа и ЭПР. Полученные результаты подтвердили, что максимальная активность TcDH наблюдается при связывании трех ионов меди на субъединицу белка. -охарактеризованы свойства и получена структура мутанта TcDH с заменой остатка His482, координирующего ион меди Cu3, на остаток Gln. Анализ аминокислотных последовательностей белков – гомологов TcDH показал, что His482 – наименее консервативный из каталитически важных остатков. Согласно структурным данным, мутант TcDH His482Gln связывал два иона меди. Ион меди Cu3 в структуре отсутствовал. TcDH H482Q с двумя ионами меди в активном центре не обладал каталитической активностью в реакции окисления тиоцианата, что подтверждает нашу гипотезу, что для окисления тиоцианата нужен минимальный набор из трех ионов меди. Полученные результаты также ставят под сомнение наличие тиоцианатдегидрогеназной активности у рассматриваемых гомологов TcDH. -идентифицирован и охарактеризован потенциальный акцептор электронов TcDH в реакции окисления тиоцианата в клетке. Им оказался одногемовый цитохром с (С552, WP_006748979.1) с молекулярной массой 18 кДа. Ген С552 расположен в геномах бактерий рода Thioalkalivibrio рядом с опероном, содержащим ген TcDH. Получена рекомбинантная форма С552. Показано, что С552 может служить акцептором электронов в реакции окисления тиоцианата, катализируемой TcDH in vitro. Охарактеризовано влияние рН и ионной силы на скорость реакции с С552 в качестве акцептора электронов. Согласно данным потенциометрического титрования, потенциал гема с в C552 равен 130 мВ. Все полученные на данном этапе результаты структурно-функциональных исследований TcDH «дикого типа» и мутантных форм не противоречат сформулированному нами ранее с привлечением молекулярно- и квантовомеханических расчетов молекулярному механизму каталитического действия TcDH. В рамках исследования механизмов адаптации ферментов из галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio проведен сравнительный анализ структур гомологичных флавоцитохром с сульфиддегидрогеназ (FCC) из галоалкалофильной бактерии Tv. paradoxus, мезофильной нейтрофильной бактерии Allochromatium vinosum и термофильной бактерии Thermochromatium tepidum. Анализ выявил уменьшение содержания остатков лизина в формировании открытой поверхности (поверхности, доступной растворителю) у FCC из галоалкалофильной бактерии по сравнению с FCC из двух других организмов. Эта структурная особенность характерна для механизмов адаптации как гало-, так и алкалофильных белков и связана с высокой гидрофобностью алифатической боковой цепи лизина, незаряженной в условиях щелочных рН и способствующей агрегации молекул в растворах с высокой концентрацией солей. Ранее эта особенность была отмечена нами как один из механизмов адаптации у восьмигемовых нитритредуктаз из бактерий Tv. paradoxus (Popinako A et al., 2017, PLoS One; 12(5):e0177392). Механизм структурной адаптации в семействе восьмигемовых нитритредуктаз был сформулирован нами ранее на основании сравнительного анализа структур ферментов из галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio и пространственных моделей гомологичных ферментов из нейтрофильных негалофильных бактерий рода Geobacter. Для верификации этого механизма получена пространственная структура восьмигемовой нитритредуктазы из бактерии Geobacter ammonificans (GaNiR), проведен предварительный сравнительный анализ полученной структуры и структур нитритредуктаз из галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio (TvNiR). Значительные изменения были обнаружены в строении мономеров в области контакта двух тримеров в структуре TvNiR. Пространственное расположение дополнительных петель в структуре мономера GaNiR делает невозможным образование гексамерной структуры этим ферментом. Ранее нами было показано, что образование гексамера является одним из основных механизмов стабилизации TvNiR в высокосолевых растворах, которые соответствуют условиям функционирования TvNiR в периплазме галоалкалофильных бактерий. Продолжены работы по структурно-функциональной характеристике новых пиридоксаль-5’-фосфат (PLP)-зависимых трансаминаз III класса (I тип PLP укладки) и IV класса (IV тип PLP укладки), стереоспецифичных в реакциях с первичными (R)- и (S)- аминами, представляющих интерес для биотехнологических приложений. Исследования 2018 г. сконцентрированы на изучении биотехнологически значимых свойств ферментов: стабильности при разных температурах и в органических растворителях и характеристике продуктов трансаминирования; детально исследовались структурные основы субстратной специфичности новых трансаминаз. Проанализирована устойчивость в органических растворителях PLP –зависимой трансаминазы I типа укладки из холодоактивной бактерии Psychrobacter cryohalolentis (Pcryo361). Показано, что стабильность фермента при инкубации в 25% (v/v) органического растворителя в течение 24 ч при 35 °С убывает в порядке DMSO>DMFA>метанол>ацетонитрил. Оптимальным растворителем является DMSO: Pcryo361 сохраняет 60% активности после инкубации в 50% DMSO при 35 °С. Для повышения растворимости субстратов/продуктов допустимо введение до 25% ДМСО непосредственно в реакционную смесь. Особенностью Pcryo361 является ее уникальная активность в реакции аминирования альфа-дикетонов с (S)-альфа-метилбензиламином в качестве донора аминогруппы при температурах 10-35 °С. Из анализа значений кинетических параметров аминирования дикетонов при разных температурах следует, что специфичность Pcryo361 к 2,3-бутандиону сохраняется постоянной в интервале температур реакции 10-35 °С. Более того, фермент отличается низкотемпературной активностью с аминами, дикетонами и альдегидами и характеризуется устойчивостью к денатурации при 0-10 °С. Методом ГХ-МС идентифицирован продукты аминирования 2,3-бутандиона - 2,3,5,6-тетраметилпиразин и продукты аминирования 2,3-пентандиона -гетероциклические ароматические соединения 2,6-диэтил-3,5-диметилпиразин и/или 2,5-диэтил-3,6-диметилпиразин. По-видимому, эти соединения являются следствием димеризации и последующей окислительной ароматизации исходных продуктов аминирования – кетоаминов. Замещенные пиразины востребованы в производстве как компоненты косметических препаратов и ароматических добавок. По аминокислотной последовательности и характеристическим мотивам, формирующим активный центр, Pcryo361 относится к DAPA трансаминазам (7,8-diaminopelargonic acid transaminase, EC 2.6.1.62), узкоспецифичным ферментам, активным с S-аденозил-L-метионином (SAM) и 7,8-кетоаминопеларгоновой кислотой (KAPA). Структурный анализ и молекулярное моделирование показали, что в активном центре Pcryo361 присутствуют субстрат-специфические мотивы, характерные как для DAPA трансаминаз, так и для S-амин трансаминаз. Показано, что специфичность Pcryo361 к нетипичному субстрату – ароматическому амину - S-альфа-метилбензиламину заложена в специфичности фермента к природным субстратам SAM и KAPA. Связывание амина наблюдается в области распознавания гидрофобных частей субстратов SAM и KAPA в активном центре фермента и усиливается в результате общей подвижности остатков в активном центре. Проведен детальный структурный анализ PLP-зависимых трансаминаз IV-типа укладки из термофильной бактерии Thermobaculum terrenum (ТА-ТТ) и галотолерантной бактерии Haliangium ochraceum (Hoch3033). Обе трансаминазы отличаются заменами в характеристических мотивах, определяющих субстратную специфичность у суперсемейств трансаминаз IV типа PLP-укладки. Показано, что организация активного центра Hoch3033 сходна с активным центром трансаминаз разветвленных аминокислот (BCAT). Однако, в активном центре Hoch3033 обнаружены следующие отличия от ВСАТ: (1) отсутствует сайт связывания отрицательно заряженной карбоксильной группы в большом кармане; (2) большой карман более гидрофобный по сравнению с типичными ВСАТ; (3) из двух сайтов связывания альфа-карбоксильной группы субстратов-альфа-аминокислот в малом кармане присутствует только один. Указанные особенности приводят к изменению профиля субстратной специфичности Hoch3033 по сравнению с типичными ВСАТ: фермент не активен с альфа-кетоглутаратом и пируватом, фермент активен с ароматическим амином – (R)-альфа-метилбензиламином и катализирует уникальную реакцию аминирования кетоаналогов разветвленных аминокислот с (R)-альфа-метилбензиламином в качестве донора аминогруппы с образованием L-аминокислоты и ацетофенона. Продолжен анализ свойств мутантов TA-TT для целей повышения эффективности связывания R-первичных аминов и определения роли остатков, формирующих активный центр ТА-ТТ. Сконструированы и охарактеризованы мутанты с заменами в малом кармане G41V + Y101F (М10), с заменами в малом и большом карманах G41V+Y101F + Y166W+F39Y (М11) и R43S+G41V+Y101F+R115+ Y166W+F39Y (М12). Введение двойной мутации Y166W+F39Y (замены предложены на основании сравнения активных центров ТА-ТТ и специфичных (R)-амин трансаминаз) не привело к повышению каталитической эффективности ТА-ТТ в реакции с (R)-альфа-метилбензиламином. По-видимому, для целей повышению каталитической эффективности ТА-ТТ в реакции с (R)-первичными аминами при сохранении его термостабильности наиболее эффективными являются замены в малом кармане. В ходе выполнения проекта решена с разрешением 1.85 Å и проанализирована структура мутанта ТА-ТТ с тремя заменами в малом кармане активного центра - R43S+G41V+Y101F. Три замены не изменили ход основной цепи в малом кармане активного центра, однако значительно увеличили гидрофобность малого кармана, что, по-видимому, привело к повышению сродства мутанта к ароматическому амину (R)-альфа-метилбензиламину и, как следствие, к повышению каталитической эффективности ТА-ТТ в соответствующей полуреакции. Работы в рамках проекта в 2018 г. выполнены в полном объеме. Опубликовано 10 статей, из них 6 в журналах первого квартиля (Q1).