Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проанализированы литературные данные о роли G4 в антигенной диверсификации и латентности вирусов (HIV1, HPV, EPV, Ebola virus;HSV-1, Hepatitis, C Zika virus), в рекомбинационных механизмах поддержания антигенной вариабельности бактерий (Neisseria,Micobacterium tuberculosis, Borrelia), простейших (Plasmonium falciparum и Trypanosoma brucei), а также нематод и растений. Проведено картирование G4/ImG4 геномов ряда социально значимых патогенов (E. coli, Micobacterium tuberculosis, Mycoplasma genitalium и Helicobacterpylori), получена база данных PQS. Начаты работы по анализу колокализации G4 и сайтов рекомбинации на примере Helicobacter pylori. Выбор объекта (HP) обусловлен социальной значимостью данного патогенна; его высокой изменчивостью за счет мутаций в пределах одного штамма и обмена генетическим материалом между различными штаммами (например, при комплексной инфекции). Рекомбинация между штаммами обеспечивает, в частности, вариабельность поверхностных антигенов (hop-белков), позволяющей HP уклоняться от распознавания иммунной системой. Для штаммов NQ392 и NQ367 показано, что большинство G4 (76%) мотивов в окружении CNP (кластера полиморфизмов) содержат однобуквенные T/G петли. Разработан первый вариант FRET-системы для экспресс-скрининга потенциальных G4 лигандов: метаболитов и ксенобиотиков (включая нутриенты, компоненты лекарственныех препаратов и др.). Новизна первого варианта системы состоит, в первую очередь, в оригинальном наборе G4-мишеней. Панель мишеней, помимо G4 промоторов проонкогенов, G4 теломерных повторов, включает G4 вирусного генома и имперфектные квадруплексы. ImG4 и dsDNA (шпилька) добавлены как примеры неспецифических мишеней лигандов, адресованных к квадруплексам онкогенов или теломерных повторов. Стабилизация этих характеризует побочное действие препаратов. Мы продемонстрировали, что разработанная аналитическая система позволяет в плашечном формате провести первичную оценку антипролиферативного, антивирусного потенциала и специфичности лигандов по отношению к конформации и конкретной G4-мишени. Проведенные на 20 природных соединениях испытания позволили обнаружить новые G4-лиганды и подтвердили адекватность и эффективность системы. Данные о природных модуляторах конформационной стабильности дополнительно иллюстрируют нашу гипотезу о регуляторной и синхронизирующей роли конформационных перестроек полинуклеотидов. На следующем этапе планируется провести аналогичный скрининг синтетических производных порфиринов, хлоринов и ряда антибиотиков с противоопухолевой активностью. Лидерные соединения будут проверены с помощью усложненной FRET-cистемы, предусматривающей мониторинг переходов dsDNA-ncDNA. Для анализа влияния эпигенетического метилирования и краудинга на динамику dsDNA-G4/IM проведены дополнительно термодинамические исследования локально CpG метилированных олигомеров (дифференциально метилированных при колоректальном раке). Построены энергетические диаграммы для равновесных переходов дуплекс–GQ/IM. Среди основных выводов отмечены разнонаправленные конформационные эффекты эпигенетических CpG модификаций, выявлено влияние позиции в отношении структурных элементов IM и G4 и количества метилированных сайтов на термостабильность ncDNA. Проведены подробные исследования закономерностей самосборки ДНК с участием или с образованием G4 и IM структур. Выводы были подтверждены с помощью методов FRET, AFM, NMR, MS, CD, hplс, MD и др. Для выяснения роли гетероциклов в петлях G4 на самоассоциацию и взаимодействия G4 олигомер-субстрат был синтезирован набор модифицированных, несущих имитирующие апуринизованные сайты, звенья. На примерах G4 аптамеров TBA, теломерных олигонуклеотидов ТМО и ряда параллельных G4 мы впервые показали возможность использования таких модификаций для топологических переключений G4 и для структурного дизайна G4 аптамеров. Комплекс приемов молекулярного моделирования и анализа внутри- и межмолекулярных nc-структур методами молекулярной динамики позволили сделать ряд структурных предположений, например, о длине минимальных петель в сборках на основе IM. Мы провели экспериментальную проверку возможности формирования IM с однонуклеотидными петлями и показали эффективность образования таких межмолекулярных IM, что подтвердило адекватность разработанных MD-методов для анализа ncDNA. Существенный вклад в характеристику ncDNA-взаимодействий с белками и полинуклеотидами вносит AFM-визуализация на уровне одной молекулы/комплекса. Для оптимизации метода проведены сравнительные исследования поведения адсорбированных биомолекул (плазмидной ДНК, РНК-полимеразы α70 E. сoli и фермента RNAP) на высокоориентированных поверхностях пиролитического графита (HOPG), модифицированных монослоями стеариламина и производным олигоглицина (GM) и слюде. Показано, что модифицированный графит позволяет изучать биомолекулы, надмолекулярные комплексы и биомолекулярные процессы на HOPG поверхности с контролируемой ионной силой и создает новые возможности для AFM высокого разрешения биокомплексов. В соответствии с планом осуществлен дизайн и синтезированы олигонуклеотидные конструкции, несущие дистальные PQS или их фрагменты. Структура олигонуклеотидов позволяет моделировать взаимодействия G-блоков, расположенных либо в разных молекулах, либо на значительном расстоянии друг от друга. Эти исследования необходимы для детализации двух механизмов G4-синапсиса ДНК, описанных нами ранее при исследовании конформационного полиморфизма Alu-повторов человека. Подготовлен аналитический обзор, в котором обсуждаются предпосылки и последствия образования G4 при транскрипции или репликации. Гипотетические механизмы G4-зависимых перестановок предполагают ассоциацию G-богатых сайтов. Важно проанализировать общую молекулярную основу для возможных механизмов самоассоциирования, то есть формирования межмолекулярных сборок. В состав моделей были включены как PQS, IM-сайты, так и их фрагменты. Олигонуклеотиды состояли из двух частей GQ или IM, разделенных длинным (25-30 н.) олиго-Т трактом. FRET-эффект позволил судить о формировании внутримолекулярной структуры, а характерный CD-спектр свидетельствовал об образование IM/G4. Результаты подтвердили возможность фолдинга ncDNA из фрагментов, причем разного состава. Эти данные говорят об универсальности механизма образования межмолекулярных ncDNA структур и обосновывают иной принцип поиска признаков участия G4 в геномных перестройках. Начаты эксперименты по изучению вариантов G4-синапсиса, как предполагаемой стадии хромосомных перестроек. Осуществлен дизайн и синтез олигомеров, отработаны условия сборки и амплификации для протяженных dsDNA (0m, 2m, 3m, 4m, 5m и 6m,~200 н.п.), несущих G-богатые сайты в середине дуплекса. Было продолжено исследование влияния квадруплексных структур на активность ряда ДНК-зависимых ферментов - киназ и нуклеотидилтрансфераз, играющих существенную роль в работе клеточных систем репликации и репарации ДНК. Для исследования были выбраны три олигонуклеотидные модели: шпилька-дуплекс, имеющая тупой конец, одноцепочечная ДНК фланкированная двухполочным квадруплексом на 3’конце, а также олигонуклеотид не образующий выраженной третичной структуры (расплавленная нить). Оценка скорости безматричного нуклеотидилирования осуществлялась как с использованием природных трифосфатов нуклеотидов, так и модифицированного уридина, имеющего по С-5 положению гидрофобный Cy5 флуорофор. Для анализа реакционных смесей был использована МАЛДИ времяпролётная масс спектрометрия в сочетании с оптимизированным методом подготовки образцов, позволяющим существенно повысить чувствительность МАЛДИ МС метода и воспроизводимость анализа. Данные полученные для нуклеотидилтрансферазы и для ДНК-полимераз позволяют предположить, что в случае 3’-флануирующего G4 гидрофобное взаимодействие между нуклеотид трифосфатами и плоскостями квадруплекса вносит наиболее важный вклад как в селективность в отношении нуклеотидов, присоединяемых к 5’ концу ДНК цепи, так и в термодинамику процесса самой трансферазной реакции.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Существенный вклад в формирование и стабильность неканонических динамических структур полинуклеотидов (ncNA или non-B - неканоническая структура полинуклеотидов) вносит микроокружение потенциальных ncNA сайтов ДНК/РНК. В 2018 году в рамках проекта были продолжены исследования влияние на стабильность и топологию ncNA низкомолекулярных эндогенных и экзогенных соединений, белкового окружения и некомплементарных взаимодействий полинуклеотидов с образованием межмолекулярных G4 и IM. В рамках проекта разработана скрининговая FRET-система, которая в 2018 году была усовершенствована, дополнена использованием двух флуоресцентных меток, была расширена панель мишеней, протестированы возможности бимолекулярного варианта, предусматривающего мониторинг переходов dsDNA-ncDNA. Эффективность применения усовершенствованного мономолекулярного варианта в 2018 году продемонстрирована на примере более 60 природных и синтетических соединений и панели мишеней, впервые включающей ImG4 (несовершенные G4)и IM (i-мотивы). Панель мишеней была расширена, как и планировалось, с включением G4/IM бактериальных геномов (Chlamydia trachomatis, Streptococcus pyogene, N. gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis). Полученные данные объясняют глубокие изменения транскриптомных и протеомных профилей под действием известных G4-лигандов. Впервые показана возможность стабилизации ncNA конформаций ДНК рядом известных лекарственных средств и синтетических производных (например, феноксазина и хлоринов). Основной результат этой части работы состоит в подтверждении возможности избирательного воздействия на целевые группы или индивидуальные ncNA-мишени. Анализ полученных данных позволил выявить некоторые структурные особенности взаимодействий модулятор-ncDNA и уточнить подходы к рациональному дизайну лигандов G4. Важным результатом применения скрининговой системы стало обнаружение аффинности к G4/ImG4-мишеням известных лекарственных препаратов (например, этопозида), что расширяет представления о механизме их действия и способствует развитию доказательной медицины. Среди новых синтетических лигандов подробно были изучены бензотиазольные производные. В экспериментах с модельными и геномными олигомерами показано, что новые бензотиазольные лиганды могут быть использованы как молекулярные инструменты для характеристики ДНК структур, а моно / дизамещенные могут рассматриваться как перспективные стабилизаторы и световые зонды для G4. Некомплементарные полинуклеотид-полинуклеотидные взаимодействия - один из существенных факторов микроокружения потенциальных ncNA-сайтов, влияющих на формирование и стабильность G4/IM-структур. Актуальность исследований в этой области связана, в первую очередь, с механизмами геномных перестроек и генерацией DSB, которые лежат в основе многих онкологических и нейродегенеративных патологий. В 2018 году были дополнены работы по анализу структурного разнообразия ДНК-самосборок С-богатых сайтов полинуклеотидов. Мы показали управляемую сборку рН-чувствительных наноструктур, определили закономерности комплексообразования, размер минимальных петель, состав и структуры мультимеров. Существование IM in vivo было показано только в 2018 году (Zeraati 2018), что значительно усилило интерес к таким конформационным формам ДНК как к регуляторным элементам и мишеням для поиска новых лекарств. Материалы суммированы в статье «The structural diversity of C-rich DNA aggregates: unusual self-assembly of beetle-like nanostructures», опубликованной в текущем году в журнале Physical Chemistry Chemical Physics, https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2018/cp/c7cp05380k. Для более детального изучения IM и способов модуляции их pH-переходов мы исследовали возможность направленно изменять свойства внутри- и межмолекулярных IM с помощью химических модификаций олигонуклеотидов. В рамках проекта нам впервые удалось осуществить рациональный дизайн нового замещенного феноксиазин-2'-дезоксинуклеотида (i-clamp) для стабилизации IM. Мы изучили влияние i-clamp на рН-зависимую стабильность для внутри- и межмолекулярных структур IM. В результате подробных предварительных физико-химических исследований и моделирования молекулярной динамики тетрамолекулярных IM с clamp-clamp парами удалось определить оптимальную структуру и расположение clamp-звеньев в составе IM. Новая модификация повышала термостабильность IM при слабокислом рН (5,8), в среднем на + 5 °С. Таким образом, мы разработали новую модификацию, которая проявляет значительный IM-стабилизирующий эффект и увеличивает значения рН перехода IM. I-clamp можно использовать для тонкой настройки датчиков pH на основе IM, сборки дополнительных стабильных структур IM, для различных in vivo приложений, исследований геннорегуляторной функции IM. Эта работа, выполненная нами совместно с ИБХ РАН (синтез производных феноксазина), опубликована в 2018 г («i-Clamp phenoxazine for the fine tuning of DNA i-motif stability», NAR, 2018, https://academic.oup.com/nar/article/46/6/2751/4883328). Для изучения участия в геномных перестройках и двухцепочечных разрывах G-богатых сайтов ДНК были продолжены исследования их колокализации с сайтами рекомбинации на примере Helicobacter pylori и Streptococcus pyogenes. Задача этой части проекта состояла в поиске биоинформатическими методами связи между потенциальными G4 сайтами (PQS) и процессами рекомбинации. На примерах выравнивания геномов и анализа сайтов рекомбинации и PQS 6 штаммов Streptococcus pyogenes и 4 Helicobacter pylori показано, что в процессе рекомбинации происходит увеличение GC-состава генома, PQS являются одними из самых консервативных сайтов. В каждом геноме Streptococcus pyogenes было найдено от 34 до 44 сайтов PQS, из которых 17 присутствовали во всех геномах. Способность формировать G4 для повторяющихся последовательностей была подтверждена спектральными методами. Функциональный анализ генов H. pylori в составе выборки CNP (кластеры нуклеотидных полиморфизмов, идентифицированные как сайты рекомбинации), фланкированных с двух сторон PQS, в пределах ~350 bp показал, что эта группа генов участвует в процессах адаптации и эффективной колонизации бактерии. Полученные результаты аргументируют возможность in vivo реализации предложенного механизма G4-синапсиса и его участия в рекомбинационных процессах. В 2018 году были продолжены работы по исследованию механизмов самоассоциации полинуклеотидов с образованием межмолекулярных неканонических структур. Литературные данные о реализации таких взаимодействий in vivo и гипотезы о механизме таких процессов и их роли в геномных перестройках были суммированы и опубликованы в аналитическом обзоре «G4 self-assembly as an intrinsic nucleic acid function», Advanced Materials Letters, 2018, https://www.vbripress.com/aml/articles/details/1153/. В рамках проекта были исследованы молекулярные основы механизмов самоассоциации полинуклеотидов на основе некомплементарных связей. В 2018 г. были продолжены исследования надмолекулярных сборок G4 с использованием атомно-силовой микроскопии, оптических и электрофоретических методов, ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования. Наши результаты показывают, что параллельные G4 с однонуклеотидными или модифицированными петлями могут образовывать различные типы мультимеров от стопок внутримолекулярных структур и / или сцепленных димеров, тримеров до нанопроволок. Снижение скорости отжига и увеличение концентрации соли или олигонуклеотида сдвигало равновесие от внутримолекулярных G4 к структурам более высокого порядка. Контрольные антипараллельные и гибридные G4 не продемонстрировали никакого полиморфизма или склонности к агрегации. В экспериментах с модельными G4, содержащими в петлях «апуринизованные» звенья, нам удалось продемонстрировать решающую роль G4 коровой структуры в формировании стопок и нанопроволок. По полученным материалам опубликована статья «Polymorphism of G4 associates: from stacks to wires via interlocks» в журнале Nucleic Acids Research, 2018, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6158749/. В совокупности исследования взаимодействий G-богатых сайтов Alu-повторов, проведенные нами ранее в рамках проекта (Sekridova 2017; Varizhuk 2017), и результаты исследования молекулярных основ IM/G4 самосборок (Protopopova 2018; Varizhuk 2018) впервые проливают свет на правила, регулирующие перегруппировки с участием ncNA сайтов – основы многих онкологических и нейродегенеративных патологий. Кроме того, контролируемый фолдинг и ассоциация G4 позволяют использовать потенциал таких структур для управляемой сборки супрамолекулярных структур ДНК для нанотехнологий. Для изучения влияния микроокружения на конформационную динамику ДНК мы исследовали взаимодействия G4 различной топологии с белками. В рамках проверки гипотезы взаимодействия нуклеолина с геномными G4 оценивали аффинность белка к фрагментам микросателлитов генома человека 2G_L1 (частота встречаемости ~5/10^6 b.p.) и 3G_L1 (частота встречаемости ~3/10^7 b.p.), а также фрагмента Алу-повторов -Alu-G4 (частота встречаемости ~1/10^5 b.p.) Эффективность связывания оценивали микротермофоретическим методом, используя флуоресцентно-меченый рекомбинантный нуклеолин. Параллельные G4 2G_L1 и 3G_L1 показали сродство к нуклеолину, сопоставимое с таковым для положительных контролей (G4 c-myc и аптамер к нуклеолину AS1411); антипараллельный Alu-G4 показал сравнительно низкое сродство, что согласуется с гипотезой избирательности нуклеолина к топологии G4. Полученные результаты опровергают выдвинутое ранее другими исследователями предположение о решающей роли в связывании нуклеолина длинных петель G4 (Amato 2017) и указывают на возможность связывания нуклеолина с широко представленными в геноме G4 микросателлитов. Данные о взаимодействии G4 различной топологии с белками человека частично опубликованы в статье «Data set on G4 DNA interactions with human proteins» в журнале Data in Brief 2018 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352340918302051. Адаптация методов к задачам исследования ncNA – неотъемлемая часть исследования. В этом году получены модифицированные олигомеры, которые потребовали оптимизации синтетических подходов, методов ВЭЖХ-очистки и анализа. Для проверки данных профилирования мы использовали, например, PCSW-сенсор. Особое внимание было уделено методам определения констант диссоциации комплексов ncNA, в том числе, микротермофоретическому анализу. Для характеристики мультимерных сборок G4 впервые был применен метод DOSY NMR. В статьях, опубликованных в этом году, описаны новые приемы молекулярного моделирования и динамики комплексов ncNA. В работе использовался оригинальный пакет биоинформатических программ, включающих наши новые разработки. Многие методы могут быть использованы для различных медико-биологических исследований. Так, например, приемы (stop-flow), найденные при определении кинетических параметров фолдинга ncNA, оказались полезными для анализа быстродействия внутриклеточных биосенсоров ионов кальция («NTnC-like genetically encoded calcium indicator with a positive and enhanced response and fast kinetics». Scientific Reports, 2018 https://www.nature.com/articles/s41598-018-33613-6 ).