КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 14-25-00160

НазваниеКлеточные источники «патогенного» интерлейкина-6 при заболеваниях: сравнение результатов генетических подходов и антицитокиновой терапии нового типа.

РуководительНедоспасов Сергей Артурович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2017 г. - 2018 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований коллективами существующих научных лабораторий (кафедр)».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словацитокины, рак, аутоиммунитет, ИЛ-6, антицитокиновая терапия, мышиные модели

Код ГРНТИ62.00.00

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Интерлейкин-6 – один из главных провоспалительных цитокинов с широким спектром иммунорегуляторных свойств. В некоторых ситуациях этот цитокин проявляет патогенные свойства и поэтому системная терапевтическая блокировка IL-6 или его рецепторов используется для лечения нескольких аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидного артрита или воспалительных болезней кишечника), а также некоторых видов неоплазий. Несмотря на это многие механистические аспекты биологии IL-6 остаются неизвестными, примером чему может служить недавние работы (Heink, S., et al., Trans-presentation of IL-6 by dendritic cells is required for the priming of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol, 2016; Zhang, C., et al., CD5 Binds to Interleukin-6 and Induces a Feed-Forward Loop with the Transcription Factor STAT3 in B Cells to Promote Cancer. Immunity, 2016). IL-6 продуцируется многими типами клеток. Основная гипотеза, которую мы предлагали проверить экспериментально, состояла в том, что в каждом конкретном случае только некоторые типы клеток продуцируют IL-6, оказывающий патогенный эффект при данном заболевании. На предыдущем этапе проекта нам удалось создать и частично охарактеризовать уникальные мышиные линии, полученные специально под изучаемую нами научную проблему. Мы также выявили и отработали три экспериментальные мышиные модели заболеваний человека, которые зависят от IL-6 и для которых анти-IL-6 терапия может быть актуальной. Для двух из них мы продемонстрировали патогенную роль IL-6, продуцируемого миелоидными клетками. На основании этих результатов нами был сконструирован новый вид биспецифических антител. Как в любом творческом исследовании, в ходе выполнения нашего проекта возникли новые научные и технологические вопросы, которые еще предстоит решить, и ответы на которые позволят усилить наши результаты и значительно повысить качество итоговых публикаций по проекту, приблизив его к высоким мировым стандартам. Кроме того, уникальные мыши, уже созданные нами, позволяют поставить и решить дополнительные актуальные проблемы, в том числе и во внешних коллаборациях, связанные с физиологией такого важного и многофункционального цитокина, как IL-6, в частности, его роли в репродукции, метаболизме и в развитии неоплазий. Стоит отметить, что до 2014 г. наша лаборатория не занималась исследованиями, связанными с изучением IL-6. В связи с неожиданно «острым» фенотипом мышей со сверхэкспрессией IL-6 только миелоидными клетками встал вопрос о создании более тонкой генетической модели. Несмотря на 20 лет работ в области обратной генетики мышей, у лаборатории есть относительно небольшой опыт работы с индуцибельными системами. Поэтому основной акцент в ближайшие два года будет сделан на CX3CR1-CreERT2 тамоксифен-зависимом делиторе, который с 2015 г. находится в нашем распоряжении. На его основе уже получены первые мыши с индуцибельной делецией IL-6 в миелоидных клетках. Эти новые мыши, а также полученные ранее тканеспецифичные нокауты IL-6 в миелоидных клетках и дендритных клетках теперь будут изучены в отработанных моделях заболеваний человека с целью установления в них источника «патогенного» IL-6. Эти модели включают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, экспериментальная модель астмы, экспериментальный артрит и химически-индуцированный рак кожи. Кроме того, поскольку IL-6 является важным гомеостатическим цитокином, мы используем модель заживления полнослойных ран кожи, в которой IL-6 играет протективную роль, чтобы изучить возможные побочные эффекты блокировки цитокина из одного клеточного источника. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в мышах индуцируют при помощи иммунизации мышей аутологичным пептидом (аминокислотные остатки 35-55) миелинового гликопротеина олигодендроцитов (MOG) в полном адъюванте Фрейнда с параллельной пермеабилизацией ГЭБ коклюшным токсином. Помимо оценки симптомов и тяжести развития заболевания, современные методы анализа, имеющиеся в лаборатории, позволяют исследовать динамику накопления субтипов клеток иммунной системы как на периферии, так и в ЦНС, а также продукцию ключевых белков, необходимых для дифференцировки патогенных клеток. Основной новый компонент этого раздела – использование индуцибельного нокаута IL-6 в миелоидных клетках, который позволит, кроме всего прочего, прояснить и возможную роль IL-6 из микроглии в ЭАЭ, а также изучение возможности использования комбинированной анти-TNF анти IL-6 терапии в лечении заболевания. Экпериментальная модель астмы, успешно валидированная нами на предыдущем этапе исследования, основана на индукции заболевания путем интраназального введения экстракта пылевого клеща (house dust mite, HDM-индуцированная астма). Развитие воспаления в легких оценивается по интенсивности инфильтрации в ткани легких и дыхательные пути лейкоцитов, в особенности гранулоцитов (нейтрофилов и эозинофилов) и Th2 клеток, играющих важную роль в патогенезе астмы. Кроме того, проводится цитофлуориметрический анализ клеток, выделенных из ткани и экссудата, полученного при проведении бронхоальвеолярного лаважа (BALF). Ранее нами были получены результаты первых экспериментов в модели острой астмы на мышах с фармакологической блокировкой IL-6 или генетической инактивацией IL-6 во всех типах клеток или только в дендритных клетках. Мы хотим продолжить изучение вклада IL-6 из дендритных клеток в развитие астмы, причем не только в острой, но и в хронической форме заболевания. Экспериментальный артрит в мышах индуцируют системным введением коктейля моноклональных антител, специфичных к различным регионам молекулы коллагена второго типа, с последующим введением липополисахарида (ЛПС) для индукции воспаления. Ранее мы показали, что появление и уровни IL-6 в сыворотке крови мышей с артритом, индуцированным антителами к коллагену, коррелируют с развитием и тяжестью заболевания (Друцкая М.С. и др., Роль интерлейкина 6 в экспериментальном артрите, вызванном переносом артритогенных антител. Медицинская иммунология, 2016). Кроме того, на завершающем этапе нашего проекта, мы планируем отработать протокол получения и охарактеризовать первичные культуры фибробласт-подобных синовиоцитов, выделенных из пораженных суставов больных мышей, так как они также могут источником патогенного IL-6 который участвует в регуляции продукции патогенных антител в артритном суставе. Роль IL-6 в физиологии кожи неоднозначна, с одной стороны, IL-6 участвует в заживлении кожи и способствует регенерации ( Lin, Z.Q., et al., Essential involvement of IL-6 in the skin wound-healing process as evidenced by delayed wound healing in IL-6-deficient mice. J Leukoc Biol, 2003) с другой стороны, в различных заболеваниях, как например псориаз, была показана провоспалительная роль IL-6 (Goodman, W.A., et al., IL-6 signaling in psoriasis prevents immune suppression by regulatory T cells. J Immunol, 2009). При этом роль IL-6 из различных источников в этих процессах недостаточно изучена. В связи с этим мы хотим изучить влияние IL-6, продуцируемого миелоидными клетками и кератиноцитами, в двух моделях заболеваний кожи: модель химически-индуцированного рака кожи и модель заживления полнослойных ран кожи у мышей. Экспериментальный рак кожи индуцируют однократным нанесением полициклического ароматического углеводорода ДМБА (7,12-диметилбензантрацена), который вызывает мутации в кератиноцитах, с последующим многократным нанесением TФА (12-0-тетра-деканоилфорбол-13-ацетат) - промотором опухолевого роста и индуктором воспаления. В результате возникают папилломы, часть которых позднее перерождается в плоскоклеточную карциному. Результаты наших предварительных исследований на мышах с полным нокаутом свидетельствуют о возможной протективной роли IL-6 в модели острого воспаления кожи, и его инактивация может приводить к усилению воспаления и развитию рака кожи. В качестве продолжения проекта будут поставлены опыты с кондиционным нокаутом IL-6 в иммунных клетках, а также отработан протокол выделения и окрашивания клеток кожи. Ранее мы также изучали модель полнослойных ран кожи и показали положительное влияние умеренного воспаления на процесс регенерации. В этой модели мышам под анестезией с помощью стилета для биопсии кожи наносили полнослойные раны на коже спины, а затем наблюдали динамику их заживления, продукцию провоспалительных и регенеративных факторов, пролиферацию и миграцию кератиноцитов. Теперь мы хотим более подробно изучить вклад IL-6 из разных клеточных источников, а именно из миелоидных клеток, а также из кератиноцитов, в случае получения соответствующего Cre-делитора, на процесс заживления. Поскольку в модели регенерации кожи IL-6 играет протективную роль, результаты этих опытов важны в контексте разработки специфических блокаторов этого мультифункционального цитокина. В разделе биоинженерии антител мы предлагаем создать и испытать новый тип биспецифических антител – Fab фрагмент полноразмерных антител к IL-6, сшитый с «таргетирующим модулем» в виде VHH из мозоленогих. Сначала будет проведена химическая конъюгация, которая может потребовать дополнительной инженерии, с тем чтобы конъюгация не приводила к потере связывания одного из модулей. Если этот подход окажется неудачным, в качестве альтернативного подхода, мы рассматриваем генетический фьюз между “одноцепочечным” антителом против IL-6 (Krebs, B., et al., Recombinant human single chain Fv antibodies recognizing human interleukin-6. Specific targeting of cytokine-secreting cells. J Biol Chem, 1998) и VHH против маркеров миелоидных клеток. Ожидаемым конечным результатом станет научное обоснование нового принципа анти-цитокиновой терапии тех аутоиммунных и раковых заболеваний, в которых IL-6 играет патогенную роль.

Ожидаемые результаты
Венцом нашей 5-летней работы станет научное обоснование нового принципа анти-цитокиновой терапии. Ожидается, что при модельных аутоиммунных заболеваниях болезнетворный IL-6 будет производиться ограниченным числом типов клеток – предположительно, миелоидными клетками в ЭАЭ, артрите и раке коже, и дендритными клетками при астме. Такой результат помимо фундаментального значения откроет дорогу стратегиям более тонкой и более специфической фармакологической нейтрализации IL-6. Параллельно будет создана и апробирована на животных моделях принципиально новая, основанная на бифункциональных антителах, стратегия нейтрализации IL-6, производимого определенным типом клеток. Впервые для нашей страны будут валидированы конкретные животные модели заболеваний, позволяющие в будущем проводить на них предклинические исследования. Наконец, в этом исследовании будут созданы прототипы лекарств, которые могут быть интересны промышленности. Предлагаемые исследования уникальны, а часть предложенных экспериментов высоко оригинальны. Конкретно таких исследований в других лабораториях в настоящий момент не проводится.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---