Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Разработана методика комбинированной химиотерапии у пациентов с диким типом гена BRAF и пациентов с резистентностью к BRAF-ингибиторам или стандартному курсу химиотерапии с дакарбазином. Проводятся клинические исследования, направленные на оценку эффективности разработанного протокола лечения. Частичный ответ на терапию или стабилизацию заболевания при использовании комбинированной химиотерапии во 2 и 3 линии наблюдали у 48%, что является значимым эффектом в лекарственной терапии диссеминированной меланомы кожи. Сформирована и клинически охарактеризована коллекция образцов материала, полученного от больных меланомой (свежезамороженная опухолевая ткань и периферическая кровь). Коллекция включает клинические образцы от 56 больных меланомой с известными клиническими характеристиками. Пациенты разбиты на группы по типу получаемой терапии (традиционная химиотерапия, таргетная терапия, иммунотерапия). Внутри каждой группы выделены пациенты с первичной, вторичной лекарственной устойчивостью и те, у которых резистентность не развивалась. Из клинических образцов выделена ДНК, определены физико-химические характеристики образцов ДНК (концентрация, степень очистки). В текущем году образцы были использованы в работах, заложенных в планах этого года. Проведено генотипирование пациентов, участвующих в клинических протоколах, с использованием диагностической тест-системы на основе биочипов для анализа соматических мутаций в генах BRAF, NRAS, KIT, GNAQ11, GNA11, MAPK1/2. Мутации были выявлены у 73.2% пациентов (41/56). Мутации в гене BRAF были обнаружены у 33/56 (58,9%) пациентов. Преимущественно была выявлена мутация V600E (31/33, 93.9%), в двух случаях выявлена мутация V600K (2/33, 6.1%). Мутации в гене NRAS обнаружены у 9/56 больных (16.1%). Мутации в генах KIT, GNAQ11, GNA11 и MAPK1/2 обнаружены не были. При анализе объединенной выборки из 309 больных меланомой, протестированных с помощью биочипов с 2014 года, получено, что мутации в гене BRAF чаще встречаются у женщин по сравнению с мужчинами, пациенты с мутациями в гене BRAF моложе, чем пациенты с диким типом BRAF, пациенты с мутациями в гене NRAS старше, чем пациенты с диким типом NRAS (http://www.oncotarget.com/index.php?journal=oncotarget&page=article&op=view&path[]=17014&path[]=54441). Проведен сравнительный анализ спектра мутаций в образцах опухолей с разной степенью дифференцировки и разной агрессивностью. Выявлены патогенные соматические мутации в гене TP53 в образцах метастатической меланомы с агрессивным течением. В метастазах пациентов, получавших лечение таргетными препаратами, выявлены мутации в гене MAP2K1 (P124S) и гене CTNNB1 (D32G). Данные мутации могут приводить к дополнительной активации RAS/RAF/MEK сигнального пути (мутация в гене MAP2K1) или альтернативных сигнальных путей (мутация в гене CTNNB1). Апробированы методические подходы для анализа внутриопухолевой гетерогенности методом полноэкзомного секвенирования образцов опухоли и метастазов. Алгоритм для оценки опухолевой гетерогенности и выявления путей клональной опухолевой эволюции включает в себя все этапы анализа от картирования ридов на геном до выявления путей возможной микроэволюции опухолевых клеток. Алгоритм апробирован на данных экзомного секвенирования первичной опухоли и трёх метастазов меланомы, полученных от одного пациента в течение 2 лет с периодом от 3 до 14 месяцев. Выявлен ряд мутаций, ассоциированных с прогрессией заболевания. Сформирована панель маркеров, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к возникновению меланомы кожи под действием солнечной радиации. Разработана тест-система на основе технологии биочипов для генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов в генах HERC2, OCA2, SLC24A4 , SLC45A2 , TYR, IRF4 и MC1R, MITF, PIGU, MYH7B, NCOA6 и CDK10. Исследованы выборки 200 больных и 200 здоровых индивидуумов, определены частоты аллелей и генотипов по исследованным полиморфным маркерам. Показано, что аллель A полиморфизма rs258322 (ген CDK10), ассоциирован с риском развития меланомы. Исследовано действие таргетного препарата вемурафениба на клеточные линии меланомы MelIBR, MelHN и MelIL, содержащие соматическую мутацию BRAF V600, в системах 2D и 3D культивирования. Показано, что в системе 2D культивирования более высокая клеточная плотность может приводить к устойчивости клеток к действию таргетного препарата вемурафениба. В системе 3D культивирования, помимо высокой плотности клеток, фактором устойчивости является включение в модель клеточного сфероида мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани. Исследованы молекулярные механизмы первичной резистентности к химио- и таргетным препаратам на клеточных линиях меланомы in vitro. В результате селекции клеточных линий получены сублинии с приобретенной вторичной резистентностью к вемурафенибу (Mel IL/R) и темозоломиду (Mel IL-TMZ, Mel Z-TMZ). На вемурафениб-устойчивых клетках показано, что резистентность связана с активацией альтернативных сигнальных путей: PI3K/AKT/mTOR и повышенной активацией рецепторов с тирозинкиназной активностью (РТК). На клетках с разной чувствительностью к темозоломиду показано, что инактивация GRP78 (активатора ЭПР-стресса) приводит к повышению чувствительности к темозоломиду (http://umo.abvpress.ru/jour/article/view/104). Исследовано возможное восстановление чувствительности к вемурафенибу за счет комбинированной терапии BRAF-ингибитором и сунитинибом – мутилькиназным ингибитором РТК на чувствительной линии Mel IL и линии с наработанной резистентностью к вемурафенибу Mel IL/R in vitro и in vivo. Показано, что комбинация вемурафениба и сунитиниба существенно тормозит рост опухоли по сравнению с препаратами в монорежиме как в случае чувствительных к вемурафенибу клеток, так и клеток с вторичной резистентностью. Исследованы механизмы развития вторичной резистентности, связанные к гиперэкспрессией циклина D и CDK4/6 на клеточных линиях меланомы с NRAS мутацией, а также на клеточной линии меланомы с приобретённой резистентностью к вемурафенибу (Mel IL/R). Показано, что ингибитор CDK4/6 абемациклиб (LY2835219) снижал пролиферативную активность всех исследованных линий путем ареста клеточного цикла в фазе G0/G1. Комбинированная терапия абемациклибом и МЕК162 (ингибитор MEK) приводила к статистически значимому снижению выживаемости всех исследованных клеточных линий по сравнению c MEK162 в монорежиме, а также вызывала активацию апоптоза. С использованием новой мутантной люциферазы Metridia longahML164-77I в качестве репортера показана возможность высокочувствительного неинвазивного мониторинга метаболически активных клеток стабильных линий меланомы человека, экспрессирующих репортер, по биолюминесцентной активности аликвот среды (2-5 мкл). Активность репортера hMLuc-77I строго коррелировала с количеством живых клеток в широком линейном диапазоне, позволяя достоверно обнаруживать биолюминесцентный сигнал даже от 5 клеток, что перекрывает возможности стандартного MTT-теста. Полученная линия MelIL-hMLuc-77I может быть использована для мониторинга в реальном времени жизнеспособности клеток, оценки цитотоксичности различных соединений, а также для высокопроизводительного неинвазивного скрининга противоопухолевых препаратов по биолюминесценции отбираемых аликвот среды. Продемонстрирована возможность детекции метаболически активных клеток линии меланомы человека Mel IL-hML-77I в живых мышах по биолюминесцентной активности 1-2 мкл сыворотки крови. Активность секретируемого репортера hMLuc164-77I в крови белых мышей коррелировала с количеством введенных клеток меланомы человека в созданной модели опухоли. В образцах пациентов метастатической меланомы с хорошим ответом на иммунотерапию выявлена повышенная экспрессия гена транскрипционного фактора MYT1L. Сконструирован вектор на основе коротких шпилечных РНК (shRNA) для подавления экспрессии гена MYT1L в клеточных линиях меланомы для дальнейшего изучения роли данного гена в развитии меланомы, а также его связи с ответом на иммунотерапию, Исследованы онколитические свойства вакцинных штаммов вирусов кори и эпидемического паротита на клеточных линиях метастатической меланомы человека c резистентностью к химио- и таргетным препаратам. Установлено, что предпочтительная элиминация неопластических клеток опосредована значительным уровнем экспрессии белков-рецепторов CD46 на поверхности клеток меланомы относительно нормальных клеток. Показано, что зараженные клетки меланомы запускают механизмы апоптотической гибели для элиминации вируса, опосредуя иммунный антиопухолевый ответ в ответ на вирусное заражение. Полученные данные могут способствовать разработке подходов для успешного лечения меланомы на основе онколитических вирусов кори и эпидемического паротита.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Апробировано 2 протокола лечения больных меланомой: один включал комбинированную терапию BRAF- и МЕК-ингибиторами; второй — применение иммунотерапии, направленной на блокирование PD-1. Исследовано применение комбинации BRAF-ингибитора дабрафениба и МЕК-ингибитора траметиниба на 14 пациентах с меланомой кожи во 2 линии терапии. Показано, что частота объективных ответов на терапию составила 61,5%, стабилизацию наблюдали у 15,4%, прогрессирование - 23,1% пациентов. Медиана общей выживаемости составила 13,3 мес. в сравнении 7,8 мес. при терапии дабрафенибом. Показано, что данная комбинация была эффективна и в группе пациентов с метастазами в головной мозг: медиана ОВ составила 9 мес. против 6 мес. при химиолучевом лечении. Изучена эффективность ниволумаба – анти-PD-1 моноклональных антител, при лечении 20 больных метастатической меланомы кожи, ранее получавших лечение по поводу заболевая. Частота объективного ответа составила 22,6%, полный ответ достигнут у 13,2% пациентов. Стабилизация более 6 мес. наблюдалась у 15,2% пациентов. Прогрессирование заболевания наблюдалось у 53,8% пациентов. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 4,37 мес. Таким образом, обе апробированные методики показали свою эффективность в преодолении резистентности пациентов к выбранной терапии (резистентности, связанной с реактивацией МАРК-сигнального каскада и активацией иммунологических чекпойнтов) и могут быть использованы как терапия 2-3 линии. Сформирована коллекция от больных меланомой, проходящих лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Клинический материал от больных меланомой был представлен свежезамороженным опухолевым материалом, полученным в результате эксцизионной биопсии, и цельной кровью. У всех образцов была определена концентрация, все образцы были охарактеризованы и разделены на группы для исследований. Сформирована таргетная панель, включающая более 50 генов-кандидатов, которые участвуют в процессе опухолеобразования и метастазирования, или важны для выбора и прогноза противоопухолевой терапии. Валидацию панели проводили на ретроспективных образцах пациентов с акральной меланомой и проспективных образцах пациентов с метастатической меланомой, а также пациентов-детей с врожденной меланомой кожи. Молекулярно-генетический анализ у 33 пациентов с подногтевой меланомой на наличие 39 наиболее частых соматических мутаций в генах BRAF, NRAS, KIT, GNAQ и GNA11 показал существенные отличия в мутационном профиле по сравнению с поверхностно-распространенной меланомой кожи. Мутации в гене BRAF были выявлены только у 2 (6%) больных (в обоих случаях V600E), в то время как при меланоме кожи мутации в данном гене встречаются примерно в 50% случаев. У 5 (15%) больных были выявлены мутации в гене NRAS, частота соответствует таковой при меланоме кожи. Исследованы образцы опухоли пациентов с первичной лекарственной резистентностью к таргетной терапии, выявлены дополнительные маркеры в генах для индивидуализации лечения и более точного подбора протокола лечения (мутации в генах WNT7A, PTPRQ, GPC5, CNTNAP5, ADGRV1, SOX10, KLK1). Исследованы образцы опухоли пациентов с вторичной лекарственной резистентностью к таргетной терапии, представлены генетические маркеры, определяющие возникновение вторичной резистентности (мутации в генах ATF6, ITGB4, NRAS, LGI1, NBEA, R3HDM1, NYAP2, PCDHB14, OR52D1 и SGK3). Выявлены дополнительные маркеры для индивидуализации лечения и более точного подбора протокола лечения с помощью химиотерапии в результате анализа образцов пациентов с лекарственной резистентностью к химиотерапии и пациентов, демонстрирующих ярко выраженный ответ на терапию (мутации в генах DOCK6, SLX4, GCM2, USH2A, CTNND2, KRIT1, VEGFA). С помощью созданного прототипа исследован 361 образец ДНК пациентов с диагнозом меланома и 341 образец здоровых доноров. Показано, что аллель A и генотип A/A гена CDK10 (rs258322), увеличивает риск развития меланомы в 2.26 (p <0.0001) и 8.82 (p=0.04) раза, соответственно. Аллель A (rs1393350) гена TYR повышает риск развития меланомы в 1.27 раза (p=0.05). Полиморфизмы в генах CDK10, TYR и MC1R рекомендованы для включения в скрининговые программы по выявлению лиц, имеющих предрасположенность к онкологии (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914018306611?via%3Dihub). Исследованы молекулярные механизмы возникновения вторичной резистентности к таргетным препаратам на клеточных линиях меланомы in vitro. Показано, что разная чувствительность к биниметинибу (ингибитор MEK) среди клеточных линий меланомы с мутациями BRAF и NRAS ассоциирована с активацией альтернативного PI3K/AKT/mTOR-сигнального пути, а также повышенной экспрессией CDK4/6. Одновременное применение ингибитора МЕК киназы (биниметиниб) и mTOR киназы (рапамицин) приводило к синергичному снижению пролиферативной активности по сравнению с препаратами в монорежиме, снижению активации PI3K/AKT/mTOR и MEK/ERK сигнальных путей, активации каспаз-опосредованного апоптоза и аресту клеточного цикла в G0/G1 фазе. Одновременное воздействие биниметиниба и рапамицина на клетки меланомы в культуре приводило к снижению уровня мезенхимальных маркеров N-кадгерина и B-катенина, что говорит о восстановлении чувствительности клеток к применяемой терапии. Исследованы молекулярные механизмы возникновения резистентности к таргетным препаратам за счет угнетения АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК) на 6 клеточных линиях меланомы с BRAF и NRAS мутациями. Продемонстрирована возможность восстановления чувствительности к таргетной терапии за счет метформина — антидиабетического препарата, в комбинации с МЕК-ингибитором биниметинибом. В 4 из 6 клеточных линий отмечался пониженный уровень АМРК при усиленной экспрессии ERK киназы. Применение обоих препаратов приводило к усиленному антипролиферативному эффекту по сравнению с препаратами в монорежиме независимо от мутационного статуса клеточных линий. Эффект сохранялся и при длительной культивации клеток с препаратами, при этом метформин в монорежиме вызывал менее выраженный антипролиферативный эффект в сравнении с биниметинибом или их комбинацией. В 4 исследованных клеточных линиях метформин в монорежиме снижал миграционную способность меланомных клеток. Показано, что снижение уровня фосфорилированного ERK ассоциировано с увеличенной экспрессией AMPKα во всех 6 исследованных клеточных линиях. Применение метформина приводило к дальнейшей активации AMPKα, не было отмечено значимого блокирования mTOR киназы. Эффективность AMPKα активации также коррелировала с 2-кратным увеличением апоптотических клеток и расщеплением PARP в 4 из 6 клеточных линиях. Таким образом, использование метформина для индукции экспрессии AMPKa позволяет преодолевать резистентность к существующей таргетной терапии ингибиторами МЕК. Данная комбинация может оказаться перспективной для лечения меланомы. В качестве экспериментальной модели in vivo для выбора препаратов первой и второй линии терапии у пациентов с меланомой получена серия PDX перевиваемых опухолей, изучена динамика их роста и морфологические характеристики. Ксенографты были получены из первичного очага или метастазов 10 больных с метастатической меланомой. Пальпируемые опухоли были обнаружены в четырех случаях. Перевитые ксенографты достигали объема 1000 мм3 в среднем за 15±2 недели. Гистологический анализ, проведенный после забоя мышей и выделения ксенографта показал морфологическую картину сходную с исходным опухолевым образцом. Молекулярно-генетический анализ выявил наличие аналогичных мутаций в ксенографте и опухолевом материале. Перевиваемые опухоли могут быть использованы для тестирования лекарственной чувствительности опухоли и подбора персонализированной терапии 1-2 линии. Оптимизирована модель опухолевой прогрессии и протестирован оптимальный режим введения вирусов для изучения эффективности применения онколитических вирусов in vivo. Серия интратуморальных инъекций вирусами кори или паротита в перевиваемую мышам опухоль mel Z in vivo позволила добиться снижения опухолевой прогрессии. Морфологическое исследование опухолевой ткани показало наличие участков с деструктивными изменениями в местах имплантации клеток меланомы, в отличие от контрольной группы, что подтверждает онколитическую активность вирусов кори Ленинград-16 и паротита Ленинград-3 в отношении меланомы человека. Полученные данные демонстрируют возможность применения онколитических вирусов кори и паротита для лечения метастатической меланомы. Разработан высокочувствительный метод определения уровня экспрессии белка МIA в тканях с использованием рекомбинантного аналога МIА, конъюгированного с Са2+-регулируемым фотопротеином обелином. Белок MIA–секретируемый ингибитор клеточного роста, который препятствует присоединению клеток меланомы к внеклеточному матриксу, тем самым способствуя инвазии и метастазированию. Уровень экспрессии белка может быть использован как индикатор ответа на терапию. Бифункциональный гибридный белок МIА-Оbl является биосенсором при проведении конкурентного твердофазного анализа.