Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В текущем году мы собрали уникальную коллекцию изолятов и геновариантов вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (ВЯП НШ) с территории Краснодарского края, Западносибирской равнины, Горного Алтая, Киргизии, Хабаровского края и, благодаря сотрудничеству с японскими коллегами, с островов Хонсю и Хоккайдо. В настоящее время проведено полногеномное секвенирование части этой коллекции . Одним из неожиданных результатов, было обнаружение нового варианта вируса (киргизский изолят), который эволюционно значительно отличается от ближайших вариантов и не охарактеризован ранее по геномной последовательности. В связи с этим, киргизский штамм представляет определенный интерес для дальнейших биологических исследований. Было закончено геномное секвенирование пяти геновариантов (B1B; 203; 122HP; A21-MPV; 122b) выделенных из одного изолята, обладающих разной вирулентностью. На основе полученных результатов нами была разработана схема диагностики изучаемых генотипов для определения их селективного преимущества при вертикальной или горизонтальной передаче вируса с помощью ПЦР. Полученный метод включает в себя использование участка 4404-4909 (относительно референсного генома AF081810 GenBank) гена LdOrf-4 («mucin-like protein»). Расчетные последовательности гаплотипов: B1B – AAATTGGTC; 203 – CGGGGAACT; 122HP – CAATTGGCC; A21-MPV – CAATTGGTC; 122b – CGGTTAACC. Использование данных последовательностей позволит безошибочно определять целевой гаплотип изолята бакуловируса в его случае вертикальной передачи. Во время анализа погибших гусениц от ВЯП НШ нами был обнаружен уникальный штамм, формирующий полиэдры нестандартной - «кубический» формы. Подобный феномен упоминается исследователями, но, как правило, только при размножении вируса в культурах клеток. Мы заинтересовались найденным штаммом и провели всесторонний анализ, так как он может обладать и другими уникальными свойствами. Во время первого пассажа данного изолята через организм непарного шелкопряда, наблюдалась почти полная потеря его морфологического признака. Однако, при повторном пассаже произошла дивергенция популяции вируса на классические (т.е. полиэдрической формы) и кубические тела включения. Во втором пассаже кубические тела включения встречались примерно в 30% случаев, нередко образуя смесь классических и кубических форм. Полученный результат указывает на то, что «кубический» штамм не всегда проявляет себя фенотипически, но, тем не менее, «дочерние» полиэдры кубической формы формируются регулярно (в то время как вероятность обнаружения таких полиэдров при инфицровании дикими изолятами бакуловируса составляет менее 1%). Полученные нами результаты по заражению кубическим морфотипом вируса in vivo показали относительно высокую биологическую эффективность: полулетальная концентрация составила 4,6х106 полиэдров/мл. Полулетальное время «кубического» морфотипа составило 21 (±1,1) день, что значимо не отличалось от других сибирских штаммов при инфицировании схожими дозами. Однако, отмечалось существенное снижение продуктивности кубического штамма по равнению с другими сибирскими штаммами: 6,3х107 ±7х106 полиэдров/гусеницу, в то время как для сибирских штаммов: от 6,2х108 до 2х109 полиэдров/гусеницу. Для секвенирования были выбраны образцы с максимальной представленностью квадратных тел включений (свыше 80% тел включений). Генетический анализ пассажей кубического морфотипа показал высокую консервативность гена полиэдрина (основной кристаллический белок, формирующий тело включение), независимо от того, обладали тела включения кубической или классической (многогранной) формой. Проверка гена оболочки полиэдра (polyhedral calyx protein, LdOrf-136) также не выявила мутаций, сопряженных с морфотипом вируса. В настоящее время проводится анализ других генов, кодирующих структурные белки ВЯП НШ. На сегодняшний день по материалам гранта готовятся 3 публикации: 2 российской стороной и 1 японской.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Во второй год выполнения проекта были получены уникальные результаты по изучению нового штамма вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (ВЯП НШ), формирующего белковые включения (полиэдры) кубической формы. С помощью просвечивающей электронной микроскопии мы обнаружили, что данный штамм сохраняет вирионы внутри полиэдров, в отличие от других подобных изолятов. Эта особенность позволяет сохранять данному штамму свою вирулентность, тогда как описанные ранее «кубические» изоляты практически полностью ее теряют. При этом впервые было показано, что найденный нами штамм формирует в основном нуклеокапсиды с одним вирионом, тогда как ранее для данного вида были описаны исключительно мультинуклеокапсидные штаммы, то есть – формирующие несколько вирионов в одном нуклеокапсиде. Еще одним, крайне интересным моментом, оказалось пространственное расположение нуклеокапсидов, которые были все упакованы в одном направлении, тогда как в классических штаммах всегда наблюдается их хаотичное расположение. Филогенетический анализ показал близость данного штамма с Вирином-ЭНШ – биопрепаратом на основе ВЯП НШ в России. В тоже время, сравнительный анализ структурных генов, которые могут быть вовлечены в формирование кубический полиэдров не выявил несинонимичных нуклеотидных замен между кубическим и типовым штаммами изучаемого вируса. Отсюда, мы предполагаем, что кубическая форма включений и особенность упаковки вирионов внутри этих включений являются результатом пост-трансляционных изменений. Но при этом, нам впервые удалось показать in vivo, что особенность формирования полиэдров передается дочерним генерациям вируса. Таким образом, найденный нами штамм на территории Западной Сибири является на данный момент уникальным представителем ядерного полиэдроза непарного шелкопряда с одиночными нуклеокапсидами. Были получены сиквенсы фрагмента гена цитохромоксидазы для собранной коллекции бабочек непарного шелкопряда с целью ее последующего филогенетического анализа. Было показано, что на западносибирской равнине крайне скудное генотипическое разнообразие (Martemyanov et al. under review), тогда как в горном Алтае напротив – более богатое. Популяции краснодарского края существенно отличались от остальных образцов, и, согласно данным недавно опубликованной работы (Djoumad et al., 2017), были сильно схожи с новым гаплотипом, который был открыт для иранской популяции непарного шелкопряда. Имея в коллекции высоко и низковирулентные штамма ВЯП НШ, которые ранее были охарактеризованы биологически, генетически (Martemyanov et al., 2017) и экологически (Akhanaev et al., 2017), мы провели пассажи этих штаммов через организм хозяина, в результате чего было обнаружено линейное увеличение вирулентности низковирулентного штамма (Ilynykh et al., 2018). Дальнейший геномный анализ полученных пассажей, в совокупности с уже имеющимися данными по генетической характеристике геновариантов типового штамма препарата Джипчек, позволят выявить основные генетические детерминанты вирулентности вируса. Решение этой задачи упростит выбор слабовирулентных штаммов для реализации предполагаемой грантом стратегии лесозащитных мероприятий – насыщение популяции филлофага скрытой формой слабовирулентного вируса. Работая на популяции непарного шелкопряда, обладающей высоким процентом инфицирования скрытой формой ВЯП НШ, мы изучили возможность его активации при заражении двумя видами микроспоридий: Paranosema locustae из прямокрылых и Nosema pyrausta из чешуекрылых насекомых. Скармливание спор P. locustae в дозировке 3×10^6 спор/особь гусеницам II возраста не привело к успешному заражению насекомых. В случае с N. pyrausta, через 30 дней после инфицирования в той же дозировке в некоторых особях на фазе предкуколки или куколки наблюдались массы спор паразита. Заражённость насекомых, однако, была невысокой, не превышая 10 % во всех вариантах опыта. Факт заражения непарного шелкопряда спорами N. pyrausta сам по себе весьма интересен, так как данных о гостальной специфичности этого вида паразита, типовой хозяин которой - кукурузный мотылёк Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae), крайне мало (Tokarev et al., 2018). Важно отметить, что несмотря на успешное инфицирование микроспоридиями нашего целевого объекта, и их способность к вертикальной передаче от родителей к потомкам, мы не наблюдали случаев активации скрытой вирусной инфекции, что свидетельствует о том, что микроспоридии не подавляют антивиральный иммунитет насекомых. Следовательно, для разрабатываемой нами технологии внесения слабовирулентных штаммов микросопридии не могут выступать в качестве эффективных синергистов. Была проведена оценка ультрафиолетового излучения в разных локалитетах непарного шелкопряда, как наиболее лимитирующего фактора выживания вируса вне хозяина. Наибольшее значение мощности УФ отмечалось для краснодарской популяции: в начале июня, в обеденные часы, в ясную погоду: 2,4-2,7мВт/см2 на открытом пространстве и 0,5-1 мВт/см2 – при частичном затенении в кроне дерева. В Сибири (Юго-запад Новосибирской области) значения были меньше: 1,8-2,2 мВт/см2 на открытой местности и 0,72-1,24 мВт/см2 при затенении кроной дерева. На Дальнем Востоке, в частности в Хабаровском крае, значения УФ не сильно отличались от Сибири. Однако, нужно отметить, что количество пасмурных дней в период с мая по сентябрь в данном регионе было 1,5 раза больше, чем в других сравниваемых регионах. Таким образом преимущественно пасмурная погода в данном регионе снижает общую нагрузку УФ излучения, что будет на руку разрабатываемому методу т.к. после активации вируса будет более эффективно работать горизонтальная передача вируса в популяциях хозяина. https://chrdk.ru/sci/vazhno_izuchit_mehanizmy_zashchity_kotorye_ispolzuyut_sami_rasteniya

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Была выполнена работа по тестированию штаммов бакуловируса на разные географические популяции непарного шелкопряда. Для биотестов были выбраны сибирская и краснодарская популяции непарного шелкопряда, питающихся на разных кормовых растениях (береза и дуб соответственно). Были протестированы сибирский, японский, кубанский и киргизские штаммы бакуловируса. За исключением киргизского штамма, все остальные показали высокую эффективность на обеих популяциях насекомого. Таким образом, мы показали, что вирулентность штаммов зачастую не зависит от географического распространения хозяина на территории Евразии. Обращает на себя внимание штамм бакуловируса, выделенный в Киргизии, продемонстрировавший экстремально низкую вирулентность на всех популяциях непарного шелкопряда. Геномное секвенирование показало, что данный штамм имел существенные отличия от остальных. В настоящее время, проводится аннотация для вирусных геномов, чтобы установить причины его низкой вирулентности. Мы закончили работу по оценке вертикальной передаче вируса в первом поколении непарного шелкопряда. Заражение родительского поколения разными штаммами не отразилось на его плодовитости и отрождаемости дочернего поколения. Дочернее поколение было намеренно стрессировано нами для активации вируса, передавшегося от родителей. В результате, мы наблюдали активацию вируса у дочернего поколения, но на довольно низком уровне (менее 4%). Кроме того, заражение родительского поколения происходило низковирулентным и высоковирулентым геновариантами патогена. Однако, существенных различий по их активации в дочернем поколении не обнаружилось. Таким образом, несмотря на факт передачи вируса потомству, его дальнейшая активация не зависит от исходной вирулентности. Учитывая наши предыдущие результаты по оценке способности разных штаммов бакуловируса передаваться дочернему поколению, мы предполагаем, что для вертикальной передачи вируса решающее значение имеет конкретный геновариант (Akhanaev et al., Journal of invertebrate pathology, на рассмотрении). Мы провели РНК секвенирование и показали, что кубический штамм вируса ядерного полиэдроза фактически представляет собой смешанную инфекцию ДНК и РНК вирусов. Было обнаружено 3 РНКовых вируса, при этом один из них – “Hubei lepidoptera virus 3” – был выделен из непарного шелкопряда впервые. Он был охарактеризован как новый тип цитоплазматического полиэдроза непарного шелкопряда. Был обнаружен РНКовый вирус из семейства ифлавирусов. Данная группа патогенов еще слабо изучена и насчитывает всего около 15 видов. Лишь с разработкой новых методов секвенирования становится возможным более детальное их изучение. Для ифлавирусов характерен высокий процент передачи следующему поколению и персистенция внутри хозяина без внешних симптомов заражения. Поэтому, некоторые исследователи предлагают их в качестве модели для изучения механизмов латентной инфекции. Вирусы цитоплазматического полиэдроза и ифлавирусы рассматриваются на роль синергистов для биопрепаратов. Создание такого комплексного препарата позволило бы использовать разные пути инфекций – острую форму заражения с одной стороны и постоянно персистирующую с другой.