Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках выполнения работ по проекту в первый год получены протоколы синтеза субмикронных и микроразмерных частиц карбоната кальция в кристаллографической модификации ватерита, в том числе содержащих антимикотики «Гризеофульвин» и «Нафтифин», а также флуоресцентный краситель Цианин-7 (Cy7). Сформированы частицы ватерита размером 4.5±0.5, 1.0±0.1, 0.7±0.2, 0.6±0.1 и 0.4±0.1 мкм. В ходе выполнения данных работ, был также опробован новый подход к синтезу частиц ватерита, предполагающий осаждение частиц из насыщенного раствора при добавлении реагентов по каплям в присутствии этиленгликоля, что позволяет варьировать концентрацию ионов [Ca2+] в реакционном растворе в каждый момент времени, влияя на процесс кристаллизации (результаты опубликованы в работе Svenskaya Yu. I. et al. Crystal Growth & Design, 2018, 18, 1, 331–337). Успешность загрузки ватеритных контейнеров флуоресцентным красителем и антимикотиками доказана методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, спектрофлуориметрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Оценена эффективность загрузки частиц ватерита флуоресцентным красителем и антимикотиками. Получены данные о процессах растворения и перекристаллизации ненагруженных частиц ватерита, а также частиц, содержащих флуоресцентный краситель Cy7 и препараты «Гризеофульвин» и «Нафтифин», в модельных растворах: воде, физиологическом растворе и питательной среде для роста клеток. Будучи наименее стабильной фазой карбоната кальция, ватерит медленно растворяется и перекристаллизуется при контакте с водными растворами. В зависимости от иммерсионной среды, частицы ватерита либо полностью растворяются, либо переходят в кальцит в результате ионизации внешнего слоя их поверхности. Этот процесс сопровождается высвобождением иммобилизованного вещества из ватеритной матрицы-носителя, причем полное высвобождение происходит, когда частицы ватерита полностью переходят в кальцитную фазу. В ходе выполнения работ по гранту, было продемонстрировано, что ватеритные контейнеры размером 4.5±0.5 и 0.6±0.1 мкм, нагруженных красителем Сy7, полностью переходят в кальцитную модификацию (кубические непористые кристаллы) в воде и физиологическом растворе через 24 часа после инкубации при температуре 37 °C. При инкубации контейнеров с антимикотиком при 37 °C в воде и физиологическом растворе установлено, что наличие антимикотика замедляло процесс перекристаллизации ватеритных контейнеров до 5 дней. При инкубации всех видов контейнеров в клеточной среде отмечено замедление процесса перекристаллизации в результате адсорбции белков, содержащихся в среде, на поверхности частиц, что привело к ее стабилизации, в результате чего частицы сохраняли свою форму в течение 9 дней наблюдения. Кроме того, в рамках реализации проекта в первый год была оценена токсичность ненагруженных частиц ватерита, а также частиц, содержащих флуоресцентный краситель Cy7 и антимикотики «Гризеофульвин» и «Нафтифин», in vitro с использованием клеток дермальных фибробластов крысы и человека. Установлено, что исследуемые контейнеры в количестве 20, 50, 100, 200, 300, 500, 750, 1000 частиц на клетку не оказывали значимого цитотоксического эффекта. Также оценена эффективность оптического просветления кожи крысы под действием 40% водного раствора глюкозы ex vivo и in vivo в спектральном диапазоне 400-900 нм. Исследовано изменение оптических и механических свойств кожи крысы под действием 40% водного раствора глюкозы (результаты представлены в работе Genina E.A. et al. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, Jun-Feb 2019, принятой к печати). На основе кинетики изменения коллимированного пропускания проведена оценка эффективности оптического просветления кожи ex vivo в спектральном диапазоне 400-900 нм. Установлено, что эффективность просветления выросла в 1.4 раза. Исследована временная зависимость коэффициента диффузного отражения кожи in vivo в области подкожной инъекции раствора глюкозы. Получены значения коэффициента диффузии глюкозы в коже ex vivo и in vivo, равные (1.11±0.78)×10-6 и (1.54±0.28)×10-6 см2/с, соответственно. Описана методика внедрения сформированных структур в волосяные фолликулы крысы in vivo, состоящая в том, что внедрение достигается путем нанесения спиртовой суспензии субмикронных частиц ватерита с последующим воздействием терапевтическим ультразвуком частотой в течение 2 минут. Трансдермальная доставка ватеритных контейнеров в результате применения разработанного протокола обеспечила эффективное и обильное заполнение внутреннего пространства волосяных фолликулов, а также внедрение частиц в стенки фолликулярного мешочка. Определены оптические просветляющие агенты, состав которых позволяет добиться увеличения оптической глубины детектирования исследуемых частиц CaCO3 в волосяных фолликулах крысы методом оптической когерентной томографии в спектральном диапазоне 930±50 нм. Проведены исследования с использованием нескольких гидрофильных и липофильных оптических просветляющих агентов (различные комбинации ДМСО, ПЭГ-400, тиазона, минерального масла, глицерина и олеиновой кислоты). Установлено, что оптимальным агентом для увеличения оптической глубины детектирования исследуемых частиц CaCO3 в волосяных фолликулах является смесь олеиновой кислоты и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 в соотношении 20:80%. Ее использование обеспечило увеличение глубины детектирования 1.65-1.7 раз (до 404±37 мкм) в течение 25 минут оптического просветления. Получены данные о процессах деградации ватеритной матрицы и высвобождения иммобилизованного вещества внутри волосяных фолликулов лабораторной крысы in vivo Анализ был произведен по данным сканирующей электронной микроскопии выдернутых с корнем волос, а также конфокальной лазерной сканирующей микроскопии гистологических срезов биоптата, отобранного у лабораторных животных в различные промежутки времени после внедрения частиц. Установлено, что процесс активного растворения и перекристаллизации контейнеров происходит в течение 168 часов и завершается их полной деградацией в течение 264 часов. Флуоресцентный сигнал внутри волосяных фолликулов, обусловленный наличием красителя Cy7, сохранялся в процессе деградации ватеритной матрицы. Уменьшение сигнала флуоресценции свидетельствовало о постепенной элиминации красителя: заметный спад флуоресценции отмечался через 168 часов после внедрения частиц, когда процесс перекристаллизации ватеритной матрицы был полностью завершен для большинства внедренных контейнеров. Изучена кинетика флуоресцентного красителя Cy7 в моче крысы методом флуориметрии. Наличие флуоресцентного сигнала от красителя в моче наблюдалось в течение 264 часов, однако через 168 часов после внедрения частиц отмечалось уменьшение сигнала более, чем в 10 раз от начального. Постепенное выведение красителя из организма отражалось в дальнейшем уменьшении интенсивности флуоресцентного сигнала в моче. Оценена токсичность ватеритных матриц-носителей, содержащих флуоресцентный краситель Cy7, in vivo по данным биохимического исследования мочи лабораторных животных. Установлено, что внедрение контейнеров не оказало выраженного патологического влияния. Наблюдение за состоянием кожи лабораторных животных также позволило сделать вывод об отсутствии острых реакций на внедрение частиц: воспалительные процессы, эритема или какие-либо другие повреждения кожи не были отмечены, как в ходе эксперимента (в течение 3 недель), так и в течение месяца после. Получено разрешение Комитета по этике ФГБОУ ВО Саратовский Государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России (протокол № 8 от 10.04.2018 года) на исследования в рамках гранта РНФ № 17-73-20172 "Субмикронные мезопористые частицы ватерита для трансдермальной доставки биологически активных веществ " для всех исполнителей гранта. Разрешение распространяется на все in vivo исследования на здоровых лабораторных животных, запланированные в заявке. Результаты, полученные в ходе выполнения работ по проекту в течение первого года, представлены на конференциях Saratov Fall Meeting, Международная молодежная конференция «ФизикА.СПб», XV Всероссийский молодежный Самарский конкурс-конференция научных работ по оптике и лазерной физике, XXXV Рахмановские чтения: Перспективные направления диагностики и терапии в дерматовенерологии и косметологии, Юбилейная конференция по микологии и микробилогии и 2d Edition of Global Conference on Pharmaceutics and Drug Delivery Systems в 5 устных и 2 постерных докладах.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках выполнения работ по проекту во второй год получены протоколы модификации поверхности частиц карбоната кальция биосовместимыми биодеградируемыми полиэлектролитами: полиаргинин (Pa) и декстран сульфата натриевая соль (Ds), а также белковыми молекулами: гепарин (Hp), для формирования мультислойных оболочек с различным числом слоев и различной композицией. Целью являлась стабилизация поверхности ватеритных контейнеров, контроль процесса их перекристаллизации в кальцит и пролонгация кинетики высвобождения вещества, иммобилизованного в них. Таким образом, были сформированы частицы ватерита, содержащие флуоресцентный краситель родамин Б (RdB), размером 1.1±0.4 мкм; ватеритные носители фотосенсибилизатора «Фотодитазин» (Fd) размером 1.2±0.4 мкм; контейнеры, нагруженные антимикотиками «Гризеофульвин» (Gf) и «Нафтифин» (Nf), размером 1.1±0.4 мкм и 0.8±0.2 мкм, соответственно. Проведена модификация их поверхности оболочкой Hp; одним бислоем полиэлектролитов (Pa/Ds)1; двумя бислоями полиэлектролитов (Pa/Ds)2; двумя бислоями полиэлектролитов и слоем гепарина (Pa/Ds)2/Hp. Исследован процесс деградации модифицированных контейнеров и кинетики высвобождения иммобилизованного флуоресцентного красителя в модельных средах: деионизированная вода (H2O), физиологический раствор (NaCl) и среда для культивирования клеток (MEM). Установлено, что наименее устойчивыми к перекристаллизации в H2O и NaCl являются не модифицированные оболочкой контейнеры. Оболочка (Рa/Ds)1 не оказала заметного стабилизирующего эффекта на поверхность ватеритных носителей, в то время, как модификация оболочкой (Рa/Ds)2 обеспечила существенное замедление процесса перехода ватеритных контейнеров в кальцит в H2O и NaCl. Показано, что наилучшую стабилизацию поверхности контейнеров обеспечивает оболочка (Рa/Ds)2/Hp. Кроме того, контейнеры, имеющие Hp в составе оболочек, были наиболее устойчивы к агрегации и хорошо диспергировались. В среде MEM все типы частиц сохраняли сферическую форму в течение всего периода наблюдения (7 дней), что объясняется дополнительной стабилизацией поверхности частиц белковыми молекулами, адсорбированными из клеточной среды. Также продемонстрирована возможность пролонгации процесса высвобождения модельных веществ из частиц ватерита путем покрытия их поверхности полиэлектролитной оболочкой. Установлено, что наибольший эффект пролонгации высвобождения иммобилизованного RdB и Fd обеспечивают оболочки (Pa/Ds)1 и (Pa/Ds)2. Исследован процесс деградации ватеритных носителей и кинетика высвобождения иммобилизованного антимикотика в модельных средах: H2O, NaCl и MEM. При сопоставлении скорости перекристаллизации ненагруженных контейнеров и контейнеров с антимикотиком Nf, в том числе покрытых оболочкой различной композиции, установлено, что наличие Nf в структуре частиц оказывает стабилизирующий эффект. Начало процесса (для образцов с оболочками (Pa/Ds)1 и (Pa/Ds)2) и полный переход в фазу кальцита (для всех образцов) в H2O отодвигаются во времени. Наибольшее эффективное замедление процесса перекристаллизации контейнеров в H2O и NaCl обеспечивает модификация их поверхности оболочками (Pa/Ds)2 и (Pa/Ds)2/Hp. При инкубации исследуемых ватеритных носителей Nf в MEM не было отмечено их трансформации в кальцит, что объясняется стабилизацией за счет эффекта «короны», формируемой белковыми молекулами среды. Установлено, что наибольший эффект пролонгации высвобождения иммобилизованного Nf обеспечивает оболочка (Pa/Ds)2/Hp. Проведена оптимизация протокола иммобилизации противогрибкового средства Gf. Использование данного протокола позволяет добиться увеличения содержания антимикотика в ватеритной матрице. Таким образом, были получены частицы карбоната кальция со средним диаметром 1.1±0.4 мкм, эффективность загрузки Gf которых составила 1.5%. Проведена оптимизация протокола инкубации субмикронных частиц ватерита с клетками фибробластов мыши L929, с целью определения длительности инкубации, в результате которой обеспечивается наиболее эффективный захват частиц клетками. Проведена инкубация частиц карбоната кальция в количестве 10 частиц на клетку в течении 4, 8 и 15 часов. Исследование было выполнено при помощи CLSM, полученные конфокальные флуоресцентные изображения и Z-последовательности оптических срезов позволили оценить количество частиц, поглощенных за время инкубации. Установлено, что оптимальной является инкубация частиц с клетками в течение 8 часов. Изучено влияние полиэлектролитной оболочки на эффективность интернализации частиц ватерита, нагруженных антимикотиком Nf, в клетки дермальных фибробластов человека (NHDF). Проведена инкубация контейнеров в количестве 10 частиц на клетку в течение 8 часов. При инкубации контейнеров с оболочкой (Pa/Ds)2 наблюдалось наибольшее количество клеток, не захвативших ни одного контейнера, а также отсутствовали клетки, захвативших более 6 частиц. Для образца с оболочкой (Pa/Ds)2/Hp был отмечен захват в количестве от 1 до 8 частиц на клетку, однако поглощение более 6 частиц наблюдалось в меньшем количестве случаев. При инкубации контейнеров без оболочки и с оболочкой Hp отмечено наименьшее количество клеток без частиц, а также равновероятным было наличие в клетках частиц в количестве от 1 до 10, что говорило об их эффективном поглощении. Разработан протокол оценки захвата субмикронных частиц карбоната кальция методом проточной цитометрии. Поскольку методом проточной цитометрии с визуализацией можно анализировать тысячи клеток в секунду, то применение разработанного алгоритма для определения локализации частиц в клетке, в случае достоверности данных, позволяет осуществлять быструю оценку качества эндоцитоза исследуемого образца и делать выводы о том, какой из образцов линейки лучше, а какой хуже захватывается клетками. Проведено исследование захвата и локализации контейнеров с антимикотиком Gf, в том числе покрытых полиэлектролитной оболочкой, клетками фибробластов мыши L929 методами проточной цитометрии на цитофлуориметре с режимом визуализации. Чтобы убедиться в достоверности данных об эндоцитозе, полученных методом цитометрии, было проведено контрольное исследование захвата частиц клетками методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. По данным, полученным в результате анализа ортогональных проекций z-срезов последовательностей оптических срезов, было рассчитано число частиц, содержащихся в клетках, для каждого образца. Данные, полученные методом CLSM, и данные, полученные методом проточной цитометрии для исследованной линии образцов, продемонстрировали отличную корреляцию. Идентичность тенденций говорит о возможности применения проточной цитометрии для быстрого анализа захвата частиц и выбора оптимального образца контейнеров из целой серии. В результате исследования установлено, что контейнеры, покрытые оболочками (Pa/Ds)2 и (Pa/Ds)2/Hp, лучше захватываются клетками, чем немодифицированные частицы, однако оптимальными были показатели захвата для контейнеров с оболочкой (Pa/Ds)2. Наличие Hp негативно влияло на захват клетками контейнеров, как покрытых оболочкой, так и без нее. Исследована токсичность матриц-носителей противогрибковых препаратов Gf и Nf, в том числе модифицированных оболочками Hp, (Pa/Ds)1, (Pa/Ds)2 и (Pa/Ds)2/Hp, с использованием клеток дермальных фибробластов человека (NHDF) in vitro. Установлено, что все исследуемые контейнеры в количестве 10, 50, 100, 200, 300, 500, 750, 1000 частиц на клетку не оказывали значимого цитотоксического эффекта. Изучено цитотоксическое действие ватеритных частиц, нагруженных фотосенсибилизаторм Fd, без и с оболочкой, а также эквивалентных концентраций Fd, на клеточных линиях мышиной меланомы B16-F10, фибробластов мыши L929 и фибробластов эмбриона человека ФЭЧ-Т. Установлено, что с увеличением числа частиц, приходящихся на клетку, а также с увеличением концентрации Fd наблюдается повышение степени подавления метаболической активности культур клеток. Цитотоксичность частиц, покрытых полимерной оболочкой, в большинстве случаев была ниже, чем для непокрытых носителей, что обусловлено разницей скорости высвобождения вещества из контейнеров и хорошо согласуется с ранее полученными данными. Наличие полимерной оболочки замедляет скорость выхода фотосенсибилизатора из частиц ватерита, и, как следствие, снижает цитотоксический эффект. Разработан протокол управления деградацией частиц карбоната кальция внутри волосяных фолликулов in vivo с помощью низкоинтенсивного терапевтического ультразвука. С целью ускорения процесса деградации контейнеров было изучено влияние ультразвукового пост-воздействия при помощи того же терапевтического ультразвука частотой 1 МГц, что применяется нами для осуществления трансдермальной доставки контейнеров. Исследование проводилось на белых лабораторных крысах и мышах линии Balb/c in vivo. По данным исследования методом СЭМ распределения и состояния частиц в волосяных фолликулах экстрагированных волос, а также in vivo мониторинга исследуемых участков кожи с помощью оптической когерентной томографии, установлено, что применение ультразвукового пост-воздействия существенно сокращает длительность процесса резорбции внедренных контейнеров (с 12 дней вплоть до 8) и обеспечивает управление этим процессом путем варьирования длительности пост-воздействия. Изучена кинетика выведения с мочой флуоресцентного красителя цианин 7 (Cy7) из организма крысы in vivo при его внутривенном и трансдермальном внедрении в свободном виде, а также после иммобилизации в частицы карбоната кальция. Осуществлено сравнение разработанного протокола трансдермальной транспортировки (поверхностное нанесение нагруженных Cy7 ватеритных носителей с последующим УЗ-воздействием) со стандартным внутривенным введением раствора Cy7, а также с контрольными протоколами трансдермальной транспортировки: поверхностное нанесение нагруженных Cy7 носителей без обработки ультразвуком и поверхностное нанесение раствора Cy7 с последующей ультразвуковой обработкой. Профили экскреции доставленного красителя с мочой продемонстрировали, что разработанная в ходе выполнения работ по проекту методика трансдермальной доставки лекарств, обеспечивает их успешный системный захват. Наличие выраженного флуоресцентного сигнала от красителя в моче наблюдалось в течение 192 часов, в то время, как контрольные эксперименты продемонстрировали быстрое снижение интенсивности флуоресценции. В контрольных экспериментах наблюдалось выведение основной массы красителя в течение 24 часов. Более того, интенсивность флуоресценции даже в пиковой точке была, по меньшей мере, в 5 раз ниже, чем при доставке с использованием разработанной методики, что подчеркивает важность внутрифолликулярной доставки лекарств по сравнению с другими видами трансдермального транспорта. Проведена оценка местно-раздражающего действия частиц карбоната кальция, нагруженных антимикотиком Gf, в совокупности с ультразвуковым воздействием на кроликах калифорнийской породы in vivo. Были исследованы группы без воздействия, с аппликацией спиртового раствора при УЗ- воздействии, с аппликацией ненагруженных частиц ватерита при УЗ-воздействии, с аппликацией раствора Gf при УЗ-воздействии, а также с аппликацией ватеритных контейнеров, нагруженных Gf, при УЗ-воздействии. При аппликации на кожу кроликов испытуемых препаратов симптомов интоксикации не отмечено. При исследовании раздражающего действия препаратов установлено, что при однократном воздействии препаратов на кожу, проявлялось кратковременное легкое покраснение, так как препараты были приготовлены на спирте. При дальнейшем обследовании обработанного участка кожи в сравнении с исходным периодом и контрольными животными не наблюдали признаков, которые свидетельствовали бы о выраженном раздражающем действии испытуемых препаратов. Ватеритные носители Gf не вызывали видимых функциональных нарушений кожи, таких как выраженная эритема, отеки, трещины, изъязвления, изменения локальной температуры кожи. Результаты, полученные в ходе выполнения работ по проекту в течение второго года опубликованы в виде 3 научных статей в журналах [Svenskaya Yu.I. et al. A simple non-invasive approach toward efficient transdermal drug delivery based on biodegradable particulate system//ACS applied materials & interfaces, 2019], [Lengert E. et al. Mesoporous carriers for transdermal delivery of antifungal drug//Materials Letters, 2019, V. 248, p.211-213], [Гуслякова О.И. и др. Спектральный мониторинг процесса Иммобилизации препарата Нафтифин в субмикронные частицы ватерита//Оптика и спектроскопия, 2019, Т. 126 (5), с. 620-626], индексируемых базами WOS и Scopus. А также представлены на конференциях Saratov Fall Meeting (SFM-2018); Symposium on Lasers in Medicine and Biophotonics (ICLO-2018); 13th International Conference on Surfaces, Coatings and Nanostructured Material (NANOSMAT-2018); International Conference On Nanomedicine And Nanobiotechnology (ICONAN-2018) в виде 3 устных и 4 постерных докладов.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
При реализации исследований в третий год выполнения проекта, проведено сравнительное исследование глубины проникновения флуоресцентного красителя цианина 7 (Cy7) в волосяные фолликулы, а также скорости его выведения из прилегающих к фолликулу тканей, при трансдермальном внедрении in vivo в свободном виде и после иммобилизации в частицы карбоната кальция. Исследование было выполнено на самцах белой лабораторной крысы. Целью являлось изучение влияния разработанных нами носителей в совокупности с оптимизированным протоколом их внедрения на эффективность трансдермальной транспортировки веществ. В результате анализа методом конфокальной лазерной микроскопии (КЛСМ) гистологических срезов кожи животных после внедрения препаратов установлено, что использование частиц карбоната кальция обеспечивает распределение иммобилизованного в них Cy7 в эпидермисе и различных областях волосяного фолликула по всей его длине, вплоть до самой луковицы, таким образом увеличивая глубину проникновения красителя в 4 раза, по сравнению с его доставкой в свободной форме. Кроме того, внедрение Cy7 с использованием частиц обеспечивает в 3 раза более длительное его хранение в придатках кожи (264 часа), по сравнению с внедрением раствора Cy7 (96 часов). Продемонстрирована возможность неинвазивной in vivo визуализации с помощью растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии (РСОМ) проникновения фотосенсибилизатора фотодитазин (Fd) в волосяные фолликулы и приповерхностные кровеносные сосуды при его трансдермальном внедрении в свободном виде и после иммобилизации в частицы карбоната кальция. Исследование было выполнено на мышах линии Balb/c. Показано, что при применении раствора Fd оптоакустический сигнал в волосяных фолликулах проявляется сразу после его применения и спадает через 8 часов. Внедрение иммобилизованного в частицы ватерита Fd обеспечивало нарастание сигнала в течение 8 часов, сменяющегося прологированным спадом в течение нескольких дней (сигнал исчезал через 96 часов после внедрения). С помощью РСОМ исследовано также влияние оболочки, сформированной на поверхности ватеритных контейнеров биосовместимыми полиэлектролитами, а также ультразвукового (УЗ) пост-воздействия на область внедрения носителей, на длительность выведения Fd из придатков кожи. Установлено, что такая модификация поверхности частиц полиэлектролитной оболочкой, обеспечивая пролонгацию высвобождения Fd из контейнеров, увеличивает продолжительность обнаружения оптоакустического сигнала в волосяных фолликулах (120 часов). УЗ-пост-воздействие на область внедрения частиц ватерита с Fd с помощью терапевтического ультразвука, обеспечивая ускорение высвобождения Fd из контейнеров и его элиминации из фолликулов, приводило к спаду оптоакустического сигнала в течение более короткого промежутка времени (72 часа). Оптимизированы протоколы иммобилизации антимикотиков «Нафтифин» (Nf) и «Гризеофульвин» (Gf) в частицы карбоната кальция с целью повышения эффективности их загрузки. Применение методики индуцированной кристаллизацией адсорбции из раствора для иммобилизации Nf обеспечило повышение эффективности его загрузки в контейнеры в 1.7 раз, по сравнению с ранее использованными протоколами. Для оптимизации загрузки Gf в частицы карбоната кальция, их синтез был проведен путем совместного осаждения антимикотика с частицами в процессе их формирования при нагреве до 60°С. Удалось добиться повышения эффективности загрузки ватеритных носителей Gf в 10 раз. Осуществлена визуализация Gf методом КЛСМ в тканях волосяного фолликула белой лабораторной крысы в результате применения разработанного в ходе выполнения работ по проекту протокола его трансдермальной доставки. Исследование было выполнено на самцах белой лабораторной крысы с целью подтверждения транспортировки Gf в волосяные фолликулы и прилегающие к ним ткани с помощью частиц карбоната кальция. С использованием программного обеспечения Gwyddion был проведен анализ КЛСМ-изображений криосрезов кожи, забранной из контрольной (интактной) области и из области с внедрением нагруженных Gf контейнеров. Установлено, что интенсивность флуоресцентного сигнала в приповерхностной области после внедрения контейнеров увеличилась в 2.6 раз по сравнению с интактной областью, а толщина флуоресцирующей приповерхностной области – в 1.6, что свидетельствует об успешной аккумуляции антимикотика в придатках кожи. С целью подтверждения системной транспортировки Gf через волосяные фолликулы при его трансдермальном внедрении, методом флуориметрии проведено исследование кинетики выведения Gf из организма крысы с мочой. Исследование было выполнено на самцах белой лабораторной крысы. Обработка спектров мочи животных проведена при помощи программы, разработанной с использованием языка программирования python. Установлено, что при внедрении ватеритных контейнеров, нагруженных Gf, концентрация антимикотика в моче достигает максимального значения через 24 часа. Затем флуоресцентный сигнал от Gf спадает, и через 144 часа наблюдается второй пик. Продемонстрирована возможность пролонгации выведения Gf из организма крысы путем формирования полиэлектролитной оболочки на поверхности внедряемых ватеритных контейнеров. Установлено, что применении покрытых контейнеров приводит к сдвигу пиков Gf в моче во времени. Так, первый пик Gf в моче наблюдался через 48 часов после внедрения контейнеров, а второй – через 264 часа. C помощью тест-полосок для анализа мочи измерены 11 основных физиологических показателей животных, и сделан вывод об отсутствии патологических процессов, связанных с состоянием углеводного обмена, функции почек и печени, кислотно-щелочного баланса и инфекции мочевыводящих путей. Оценена противогрибковая эффективность частиц карбоната кальция, нагруженных Nf, в отношении культуры грибов Candida albicans АТСС 885-653 in vitro. Методом последовательных микроразведений исследована динамика роста грибка при инкубировании с раствором Nf и частицами ватерита, нагруженными Nf. Обнаружен эффект пролонгации терапевтического воздействия при применении контейнеров с антимикотиком, связанный с постепенным высвобождением Nf из ватеритной матрицы в питательную среду. Несмотря на то, что через 12 часов инкубации более заметный антимикотический эффект оказывал свободный Nf, через 36 часов для концентраций, начиная с 31.25 мкг/мл, угнетающее действие на грибок, оказываемое контейнерами с Nf, превзошло действие раствора Nf. Продемонстрировано повышение антигрибковой эффективности при инкубации с ватеритными контейнерами вплоть до 4.4 раз. Такой результат создает предпосылки для уменьшения кратности процедур нанесения Nf. Изучен эффект применения разработанной методики трансдермальной доставки Nf и Gf, иммобилизованных в ватеритную матрицу-носитель, для лечения дерматомикоза in vivo. Исследование проводилось на морских свинках с моделью трихофитии, обусловленной Trichophyton mentagrophytes. Изучение эффекта осуществлено в сравнении с лечением кремом для наружного применения "Микодерил" (препарат сравнения), а также с контролями (инфицированные животные без лечения и с лечением ненагруженными частицами ватерита). Показано, что лечение животных с применением частиц, нагруженных Nf и Gf, а также препарата сравнения, ведет к заметному ослабеванию клинических проявлений заболевания (уменьшение размера очага, степени эритемы, коркообразования и шелушения) уже через неделю после начала лечения. Наибольший терапевтический эффект был достигнут по завершении курса противогрибковой терапии с применением нагруженных Nf контейнеров. Микроскопическое исследование патологического материала из очага поражения подтвердило отсутствие грибка как в кожных чешуйках, так и в волосах животных, после лечения контейнерами с Nf и препаратом сравнения. Посевы биоматериала от животных этих групп также дали отрицательный результат, подтвердив эффективность проведенной терапии. При применении нагруженных Gf контейнеров отмечено заметное улучшение клинической картины, по сравнению с контрольными группами, однако эффективность лечения была меньшей, чем для двух других экспериментальных групп. Стоит отметить, что лечение препаратом сравнения проводилось каждый день в течение двух недель, в то время, как лечение с применением нагруженных Nf и Gf контейнеров осуществлялось с периодичностью раз в три дня. Таким образом, применение разработанного протокола трансдермальной доставки Nf обеспечивает оптимизацию лечения поверхностных микозов за счет повышения терапевтической эффективности и сокращения числа процедур нанесения в 3 раза. Исследована обратимость местно-раздражающего воздействия частиц ватерита, нагруженных Gf, при их трансдермальном внедрении. Исследование выполнено на кроликах калифорнийской породы in vivo. При отсутствии видимого повреждения кожи, гистологическое исследование препаратов кожи выявило развитие неспецифической воспалительной реакции в дерме, а также проявление лимфоидной инфильтрации в ответ на введение контейнеров. Через 2 недели было отмечено нарастание выраженности морфологических изменений, однако через месяц строение кожи приблизилось к норме, что свидетельствовало об обратимости описанных изменений. Обнаруженный ответ лимфатической системы у здоровых животных на введение разработанных контейнеров с антимикотиком рассматривается как позитивное явление, поскольку такая неспецифическая стимуляция иммунного ответа способна сыграть особую роль в терапии дерматомикозов. В рамках выполнения работ по проекту, с целью расширения области применения разработанной системы трансдермальной доставки лекарств, проведена апробация ее применимости для неинвазивной профилактической вакцинации - трансдермальной доставки вакцин. Исследование выполнено на мышах линии Balb/c in vivo. Разработан протокол иммобилизации гриппозной вакцины Флю-М в частицы карбоната кальция. Данные пилотного эксперимента продемонстрировали, что трансдермальное внедрение полученных контейнеров обеспечивает в 1.13 раза более эффективную иммунизацию животных, чем внутримышечное введение эквивалентного количества свободной вакцины. Проведена также апробация разработанного протокола трансдермальной доставки лекарств для задач фотохимиотерапии витилиго. Проведен пилотный эксперимент по репигментации очага витилиго у добровольца методом ПУВА-терапии с использованием трансдермальной доставки фотосенсибилизатора. Установлено, что применение частиц карбоната кальция, нагруженных псораленом, в совокупности с УФА излучением обеспечило появление очагов репигментации, как по периферии, так и в центре очага, с четкой тенденцией к перифолликулярной локализации. Предлагаемый способ может позволить в будущем увеличить эффективность фотохимиотерапии, снизить риск развития побочных эффектов, упростить процедуру лечения, а также повысить приверженность к терапии со стороны пациента. Результаты, полученные в ходе третьего года выполнения работ по проекту, опубликованы в виде 3 научных статей [Svenskaya Yu. et al. Enhanced topical psoralen–ultraviolet A therapy via targeting to hair follicles// Br J Dermatol. 2020], [Zaytsev S. et al. Optimized skin optical clearing for optical coherence tomography monitoring of encapsulated drug delivery through the hair follicles// J. Biophotonics 2020, e201960020], [Верховский Р. И др. Исследование интернализации контейнеров с антимикотиком клетками фибробластов методами визуализирующей проточной цитометрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии// Оптика и спектроскопия, 2020, 128(6), 795-804] в журналах, индексируемых базами WOS и Scopus. А также представлены на конференциях Наука будущего - наука молодых, Conference on Metamaterials and Nanophotonics (METANANO 2019), Saratov Fall Meeting (SFM-2019), UK-Russia Workshop on Patient-tailored biomaterials for tissue regeneration, combating microbial contamination and drug delivery в виде 5 устных и 2 постерных докладов.