КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-74-10197

НазваниеПоиск перспективных комбинаций противоопухолевых таргетных препаратов

РуководительСорокин Максим Игоревич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2017 - 06.2019

Конкурс№23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-207 - Системная биология; биоинформатика

Ключевые словаОнкология, таргетная терапия, комбинированная терапия, биоинформатика, клеточная биология, молекулярная биология, сигнальные пути

Код ГРНТИ34.03.23

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Появление таргетных противоопухолевых препаратов позволило серьезно увеличить вероятность успеха терапии ряда онкологических заболеваний. К таким заболеваниям относится, например, почечно-клеточный рак, который слабо чувствителен к облучению и традиционной химиотерапии. Внедрение в клиническую практику нового класса таргетных препаратов – тирозинкиназных ингибиторов (сорафениб, сунитиниб и др.) позволило увеличить долю пациентов с раком почки, отвечающих на терапию до 70% [PMID: 21789121]. Другим примером успешного применения таргетных препаратов является использование пазопаниба при раке яичников у пациентов без прогрессии после первой линии химиотерапии [PMID: 25225436]. Помимо этого ряд перспективных таргетных препаратов находится на стадии клинических испытаний. Например, многообещающие результаты на пациентах с нейробластомой показал ингибитор ALK – кризотиниб [PMID: 24166094]. Однако, несмотря на значительные успехи в лечении онкологических заболеваний многие пациенты после прохождения нескольких курсов лечения перестают отвечать не терапию, что может привести к рецидиву заболевания [PMID: 25198391]. По всей видимости, это связано с тем, что опухоль со временем адаптируется к препарату за счёт эволюционного отбора [PMID: 27270107]. Например, во время терапии могут выживать клетки, активирующие пролиферативные механизмы, отличные от тех, на которые действуют таргетные препараты [PMID: 26828195]. Исходя из этого, представляется важным найти молекулярные механизмы возникновения лекарственной устойчивости опухоли и воздействовать на них, тем самым предотвратив этот процесс. Выполнение данной работы предполагается в сотрудничестве с Институтом биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, в распоряжении которого имеются клеточные линии SKOV-3 (аденокарцинома яичников) и NGP-127 (нейробластома), которые вели на таргетных препаратах сорафениб, сунитиниб, пазопаниб, эверолимус, темсиролимус, в течение 4 (SKOV-3) или 4,5 (NGP-127) месяцев. Раз в месяц из культуры клеток выделяли РНК. Такие временные рамки выбраны в связи с тем, что это приблизительно соответствует стандартному курсу терапии, после которого может развиться лекарственная устойчивость. Данный способ культивирования привел к тому, что IC-50 (концентрация полумаксимального ингибирования роста клеток) для некоторых препаратов увеличилась более чем втрое. Таким образом, была создана модель для изучения динамики появления лекарственной устойчивости опухоли. В ходе выполнения работ по проекту предполагается профилировать транскриптомы вышеуказанных образцов. Затем на основе данных генной экспрессии будут найдены сигнальные пути [PMID: 24723936], изменения в которых привели к приобретению лекарственной устойчивости. Метод OncoFinder, который предполагается использовать для анализа сигнальных путей, уже показал свою эффективность в решении задач, связанных с онкологией, в т.ч. поиске биомаркеров [PMID: 25296972; 25337906; 27081524; 27870639; 26624979]. После этого будут подобраны такие таргетные препараты, мишени которых будут в большей части затронутых сигнальных путей. Данный способ анализа данных показал свою эффективность при поиске перспективных мишеней для комбинированной терапии при остром миелобластном лейкозе с t(8;21) [PMID: 24727677]. Описанный выше подход позволит выявить механизмы возникновения лекарственной устойчивости опухоли. Зная эти механизмы, мы сможем подобрать таргетные препараты или, возможно, мишени для новых препаратов, использование которых поможет предотвратить адаптацию опухоли к первой линии терапии. Наиболее перспективные пары препаратов будут проверены экспериментально. Для этого могут быть использованы как нативные культуры клеток, так и уже адаптированные к препаратам, которые хранятся в замороженном виде. Новизна предложенного метода заключается, в дизайне исследования: схожие эксперименты были проведены Di Nicolantonio et al. [PMID: 16026610], однако авторы инкубировали клеточные линии с химиотерапевтическими препаратами всего 6 дней, что слабо соотносится с продолжительностью курса химиотерапии в клинической практике. Также новизна предлагаемого нами подхода заключается в том, что изначально мы будем исследовать 5 препаратов на двух разных объектах. В литературе встречаются схожие подходы, однако они ограничены либо по количеству анализируемых клеточных линий [PMID: 27020857], либо по количеству тестируемых препаратов [PMID: 19723757], либо по двум этим параметрам одновременно [PMID: 21166958]. Возможно, при сравнении двух различных клеточных линий нам удастся найти общие закономерности в возникновении лекарственной устойчивости, что будет иметь важное фундаментальное и прикладное значение. В результате исследования будет впервые разработан и верифицирован метод подбора комбинированной таргетной терапии, который в дальнейшем можно будет опробовать на более широком спектре клеточных линий и препаратов. Более того, результатом работы может стать новая комбинация таргетных препаратов для лечения нейробластомы или рака яичников.

Ожидаемые результаты
В результате проведения работ по данному проекту предполагается получить транскриптомы клеток SKOV-3 и NGP-127 адаптированных к следующим таргетным препаратам: сорафениб, сунитиниб, пазопаниб, эверолимус, темсиролимус. Для каждой пары препарат - клеточная линия будет измерен уровень экспрессии генов на четырех разных временных точках (с периодичностью около 1 месяца), а также будут проанализированы интактные клетки. Это позволит оценить динамику изменений транскриптома при адаптации к препаратам со временем. Всего будет измерен уровень экспрессии не менее 2000 генов. На основе данных по генной экспрессии методом OncoFinder [PMID: 24723936] будут рассчитаны уровни активации не менее 350 сигнальных путей. Используя данные по активации сигнальных путей, будут подобраны перспективные мишени для препаратов – гены, продукты которых встречаются в наибольшем количестве затронутых путей. Это будет сделано для всех временных точек и для каждой пары клеточная линия – препарат. Таким образом, мы сможем, во-первых, понять какие клеточные механизмы активируются в первый месяц проведения терапии. Мы предполагаем, что препараты, которые воздействуют на мишени, найденные на этой временной точке, могут быть использованы дополнительно к базовой терапии. Во-вторых, мы сможем понять, какие клеточные механизмы меняются с течением времени и при этом приводят к возникновению устойчивости опухоли после четырех месяцев терапии. Наша гипотеза заключается в том, что препараты, которые воздействуют на мишени, найденные на этой временной точке, могут быть рекомендованы в случае рецидива заболевания. В связи с тем, что число препаратов, для которых известна молекулярная мишень, в последние годы значительно выросло, мы предполагаем, что для части перспективных белков-мишеней найдутся коммерчески доступные низкомолекулярные ингибиторы. В таких случаях будут закуплены эти ингибиторы, и будет проверено какой эффект они оказывают на выживаемость клеток в комбинации с базовым препаратом или при воздействии на адаптированные клетки. Наиболее интересным результатом будет синергичное действие препаратов, хотя и те комбинации, в которых будет наблюдаться аддитивный эффект, могут оказаться клинически перспективными, т.к. это позволит снизить концентрацию базового препарата, и как возможное последствие – уменьшить побочные эффекты. Таким образом, результатом выполнения работ по проекту может стать новая комбинация таргетных препаратов для лечения нейробластомы или рака яичников. Более того, метод для подбора перспективных комбинаций таргетных препаратов, который будет разработан в случае поддержки проекта, можно будет применять к широкому спектру других препаратов и клеточных линий, чтобы таким образом охватить другие онкологические заболевания. В результате будут найдены такие комбинации препаратов, которые позволят снизить риск рецидива онкологических заболеваний, что приведет к повышению выживаемости и улучшению качества жизни пациентов с онкологией. Помимо этого, внедрение таких схем лечения в клиническую практику позволит более эффективно использовать закупаемые противоопухолевые препараты, многие из которых достаточно дорогие. Это положительно скажется и на экономике, ведь большая часть таргетных препаратов в Российской Федерации закупается государством.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Последовательные курсы противораковой таргетной терапии приводят к отбору лекарственно-устойчивых клеток, что приводит к снижению клинического ответа. В данном проекте мы представляем новый подход для прогнозирования эффективных комбинаций целевых лекарств, которые действуют синергично. Такие комбинации препаратов могут предотвращать или откладывать приобретенную резистентность опухолевых клеток, тем самым повышая эффективность лечения. Ранее, в течение четырех месяцев мы культивировали клеточные линии рака яичников SKOV-3 и нейробластомы NGP-127 в присутствии ингибиторов тирозинкиназ (Пазопаниб, Сорафениб или Сунитиниб) и mTOR ингибиторов (Темсиролимус и Эверолимус) в течение четырех месяцев и получили линии клеток с повышенной резистентностью к данным препаратам. Мы исследовали профили экспрессии генов интактных и резистентных клеток методом микрочиповой гибридизации и проанализировали изменения 378 связанных с раком сигнальных путей с использованием биоинформатической платформы Oncofinder. Этот анализ выявил многочисленные пути, связанные с развитием лекарственной устойчивости. Кроме того, мы обнаружили, что сигнализация Notch участвует в приобретении лекарственной устойчивости в клетках карциномы яичников, но не в клетках нейробластомы. Наш подход к выбору комбинаций таргетных препаратов и низкомолекулярных ингибиторов основан на использовании в качестве мишеней белков, участвующих в максимально возможном количестве сигнальных путей, активированных в резистентных клетках. На данный момент мы протестировали 10 предсказанных комбинаций лекарств и / или селективных ингибиторов в клетках SKOV3. В общей сложности три комбинации действовали синергично, 5 - аддитивно, а 2 - антогонистично. Таким образом, предлагаемый подход может быть использован для более эффективного поиска новых синергичных комбинаций противораковых таргетных препаратов.

Публикации

1. Сархан Дж., Лиу Б., Мойдляйн Х., Вайндел Х., Смирнова И., Танг Э., Илюха В., Сорокин М., Буздин А., Полторак А. Constitutive Interferon Signaling Maintains Critical Threshold of MLKL Expression to License Necroptosis Cell Death and Differentiation, - (год публикации - 2018)

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Мы протестировали три предсказаных синергичных комбинации для клеточной линии NGP-127. На наивных клетках NGP-127 комбинации сорафениба + U73122 (ингибитор фосфолипазы) и пазопаниба + U73122 работали аддитивно, и то же самое наблюдалось для комбинации пазопаниба + сапитиниба на линиях клеток, устойчивых к пазопанибу. Синергичность эффекта оценивали по методу Блисса (Bliss Synergy Score). На интактных клетках мы также протестировали 10 случайных комбинаций лекарств / ингибиторов, которые не были предсказаны нашим методом (SKOV-3 (A–F) или NGP-127 (G–J)): (А) Пазопаниб в сочетании с FLI-06 (ингибитор Notch); (B) сорафениб в сочетании с FLI-06; (С) пазопаниб в сочетании с сапитинибом; (D) сорафениб в комбинации с U73122; (E) сорафениб в комбинации с темсиролимусом; (F) сорафениб в сочетании с эверолимусом; (G) пазопаниб в комбинации с эверолимусом; (H) пазопаниб в комбинации с темсиролимусом; (I) сорафениб в сочетании с эверолимусом; и (J) сорафениб в комбинации с темсиролимусом. Из них одна комбинация показала синергичный эффект, в пяти случаях этот эффект был аддитивным, а в четырех случаях он был антагонистическим. Однако, синергичный эффект наблюдался в наивных клетках SKOV-3, обработанных сорафенибом и U73122, комбинации, которая, как было предсказано, является эффективной в устойчивых к сорафенибу клетках SKOV-3. Итого, мы исследовали 13 предсказанных комбинаций лекарств / ингибиторов. В трех случаях мы наблюдали синергичный эффект препаратов, а в восьми случаях эффект комбинации был аддитивным. Антагонистический эффект был замечен только для двух комбинаций. Разница между оценками синергии BSS, рассчитанными для предсказанных комбинаций, и оценками для случайных комбинаций была значимой согласно критерию Стьюдента (p <0,05). Таким образом, наш метод определяет комбинации, которые имеют синергичный эффект выше, чем случайно выбранные комбинации. Другими словами, наш метод превосходит случайный отбор в прогнозировании потенциально эффективных комбинаций таргетных препаратов. Приобретение резистентности к лекарственным средствам опухолевыми клетками может быть связано с аномальной активацией сигнальных путей. Мы обнаружили, что сигнальный путь Ras был значительно активирован в Сорафениб-устойчивых клетках SKOV-3. Хотя Сорафениб нацелен на тирозинкиназы и белки Raf, таким образом ингибируя пролиферацию, пролиферация все же может быть индуцирована через альтернативную ветвь того же сигнального пути, по оси Ras-PI3K, на которую не нацелен Сорафениб. Ось Ras-PI3K активируется протеинкиназой С, которая, в свою очередь, является нижестоящей мишенью фосфолипазы С, что может объяснять синергичный эффект.

Публикации

1. Мария Сунцова, Нуршат Гайфуллин, Дарья Аллина, Алексей Решетун, Синьминь Ли, Лариса Менделеева, Вадим Сурин, Анна Сергеева, Павел Спирин, Владимир Прассолов, Александр Морган, Андрей Гаража, Максим Сорокин, Антон Буздин Atlas of RNA sequencing profiles for normal human tissues Scientific data, 6, Article number: 36 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1038/s41597-019-0043-4

2. Сорокин М., Холоденко Р., Сунцова М., Малахова Г., Гаража А., Холоденко И., Поддубская Е., Ланцов Д., Стилиди И., Архири П., Осипов А., Буздин А. Oncobox Bioinformatical Platform for Selecting Potentially Effective Combinations of Target Cancer Drugs Using High-Throughput Gene Expression Data Cancers (Basel)., 10(10). pii: E365 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3390/cancers10100365

Возможность практического использования результатов
Были найдены новые синергичные комбинации таргетных препаратов для лечения рака яичников, которые могут быть в дальнейшем протестированы в рамках доклинических и клинических испытаний. Был разработан метод для подбора перспективных комбинаций таргетных препаратов, который можно применять к широкому спектру других препаратов и клеточных линий, чтобы таким образом охватить другие онкологические заболевания. В результате будут найдены такие комбинации препаратов, которые позволят снизить риск рецидива онкологических заболеваний, что приведет к повышению выживаемости и улучшению качества жизни пациентов с онкологией. Помимо этого, внедрение таких схем лечения в клиническую практику позволит более эффективно использовать закупаемые противоопухолевые препараты, многие из которых достаточно дорогие. Это положительно скажется и на экономике, ведь большая часть таргетных препаратов в Российской Федерации закупается государством.