КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-74-10224

НазваниеРазработка алгоритмов контроля состояния гемостаза и персонализированной терапии у новорожденных с применением инновационных высокочувствительных тестов лабораторной диагностики

РуководительБаландина Анна Николаевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2019 

Конкурс№23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словагемостаз, недоношенные новорожденные дети, кровотечение, тромбоз, ранняя диагностика, скрининг, глобальные тесты гемостаза, тромбоциты, проточная цитометрия, тромбодинамика, персонифицированная терапия

Код ГРНТИ76.13.23

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Система свертывания крови (гемостаз) предотвращает потерю крови при повреждении стенки сосуда путем создания локальной “затычки” – тромба, состоящего из форменных элементов крови и нерастворимой полимерной сети из фибрина. Не смотря на большое количество регулирующих работу этой системы компонентов, у людей часто возникают нарушения в виде ложного срабатывания системы (тромбозы) или недостаточного тромбообразования (кровотечения). В самых сложных ситуациях, таких как сепсис, эти нарушения быстро сменяют друг друга. Особенностью системы гемостаза новорожденных является то, что концентрации факторов свертывания и их ингибиторов существенно ниже нормы (Salonvaara et al. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2003; Cvirn et al. J Thromb Haemost 2003). При этом диапазон нормальных значений новорожденных много шире “взрослого” диапазона (Salonvaara et al. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2003). Так как важно не только и не столько количество белков в крови, сколько их соотношение (Синауридзе и др. Технологии живых систем 2008), то у новорожденных возможны ситуации, когда при флуктуации концентраций отдельных белков в пределах относительно нормального диапазона для новорожденных, баланс системы существенно сдвинут либо в область гипокоагуляции либо в область гиперкоагуляции, что может приводить к клинически значимым тромбозам и кровоточивости. Наибольшая частота таких осложнений встречается у недоношенных новорожденных (Yum et al. J Matern Fetal Neonatal Med 2015; Bhat et al. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2012). При этом, использование рутинных тестов гемостаза (таких как времена свертывания) у новорожденных мало информативно, что обуславливается высокой чувствительностью таких тестов к отдельным факторам свертывания, а не к балансу в целом. Так как у новорожденных наблюдаются масштабные изменения в составе системы свертывания, то для оценки итогового состояния гемостаза возможно применение двух подходов: 1) измерение по-отдельности всех компонентов системы или 2) применение глобальных тестов. Первый подход имеет существенный недостаток: он требует значительно больший объем крови, что в условиях работы с недоношенными новорожденными зачастую недоступно. Глобальные тесты гемостаза отражают итог работы всей системы как целого и тем самым с большей точностью позволяют судить о рисках развития тромбозов и кровотечений (Panteleev et al. Thromb J. 2015). К глобальным тестам оценки состояния плазменного звена относят тромбоэластографию, тест генерации тромбина и тромбодинамику. На сегодняшний день существует ряд работ, посвященных исследованию гемостаза новорожденных, в том числе недоношенных, с помощью глобальных тестов, однако количество таких исследований невелико. Параметры тромбоэластографии у новорожденных коррелируют со сроком гестации, но не предсказывают осложнения со стороны гемостаза (Strauss et al. Thromb Haemost 2010). Эндогенный тромбиновый потенциал в тесте генерации тромбина ниже у новорожденных по сравнению с показателями взрослых в стандартной постановке (в первую очередь за счет снижения концентрации протромбина) и лежит в пределах нормального диапазона при активации пути протеина С (Tripodi et al. Haematologica 2008). Предиктивная способность теста генерации тромбина по отношению к осложнениям гемостаза у новорожденных не оценивалась. Корреляции между концентрацией тромбоцитов у новорожденных и частотой кровотечений не обнаружено (Roberts et al. Semin Fetal Neonatal Med 2008; Deschmann et al. J Pediatr 2014; Christensen et al. J Matern Neonatal Med 2012). Наличие пациентов с кровотечениями при значениях концентрации тромбоцитов в пределах 50-100*109/л при нормальной коагулограмме и, наоборот, наличие пациентов с тромбоцитопенией менее 50*109/л (Roberts et al. Semin Fetal Neonatal Med 2008), протекающей без клинических проявлений, обуславливает необходимость разработки более совершенной тактики лабораторного сопровождения новорожденных с тромбоцитопениями. Перспективным дополнением к подсчету количества тромбоцитов являются тесты функциональной активности тромбоцитов. Наши предварительные данные по применению теста тромбодинамики для оценки плазменного гемостаза и проточной цитометрии для оценки тромбоцитарного гемостаза у доношенных и недоношенных новорожденных показали, что для всех новорожденных характерен гиперкоагуляционный сдвиг плазменного гемостаза и снижение активности тромбоцитов, причем у недоношенных новорожденных это снижение выражено значительнее. Тем самым выявляется еще один дисбаланс системы – между тромбоцитарным и плазменным звеньями. Мы полагаем, что применение комбинации тромбодинамики и оценки функциональной активности тромбоцитов будет отражать состояние гемостаза пациентов, так как эти тесты во многом моделируют процесс свертывания in vivo (Panteleev et al. Thromb Res. 2015). Все это явно демонстрирует необходимость реорганизации подхода к лабораторной диагностике нарушений гемостаза у новорожденных. Наша работа направлена на разработку алгоритмов контроля состояния гемостаза у новорожденных, в том числе недоношенных и глубоко недоношенных. В работе будут использованы инновационные высокочувствительные тесты лабораторной диагностики: глобальные тесты гемостаза, определение функциональной активности тромбоцитов и маркеры патологии сосудистой стенки.

Ожидаемые результаты
В работе мы планируем провести комплексные исследования состояния гемостаза новорожденных на сроках гестации 22-37 недель (недоношенные) и >37 недель (доношенные). Исследование будет проходить на базах ведущих перинатальных клиник города Москвы: ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава РФ, Перинатальный Медицинский Центр «Мать и Дитя», Перинатальный центр при ГКБ №24 г. Москвы. Это обеспечит возможность быстрого сбора клинических данных, в том числе по глубоко недоношенным (масса тела менее 1500 грамм) и экстремально недоношенным новорожденным детям (масса тела менее 1000 грамм). Всего в исследование планируется включить 40 новорожденных детей. Мы будем использовать пуповинную кровь и периферическую кровь новорожденных на 1е и 3и сутки после рождения. Для недоношенных новорожденных дополнительно будут взяты анализы раз в неделю на протяжении всего периода их пребывания в стационаре. Будут проведены следующие рутинные тесты гемостаза: времена свертывания (АЧТВ, ТВ, ПВ), уровень фибриногена, антитромбина III, протеина С и D-димеров, будет определена концентрация тромбоцитов. Кроме этого, будет проведено исследование с помощью глобальных тестов гемостаза (тромбоэластография, тест генерации тромбина и тромбодинамика) и определение функциональной активности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии. Также будет проводиться оценка состояния эндотелия сосудистой стенки при помощи измерения концентрации эндотелина и тромбомодулина методом иммуноферментного анализа. Данные лабораторных тестов будут сопоставлены с клинической картиной (наличие кровотечения, тромбоза, инфекции и др.). На основании проведенного исследования и анализа результатов будут выбраны тесты гемостаза, способные предсказывать наличие геморрагических и тромботических осложнений у новорожденных. Будет предложена схема обследования: выбраны ситуации и моменты времени, при которых проведение исследования наиболее информативно. Результатом работы должен стать протокол скринингового обследования новорожденных на предмет выявления скрытых нарушений в работе системы гемостаза (как генетических, так и индуцированных основным заболеванием). На сегодняшний день сложно сказать какое место в развитии кровоточивости занимает нарушение сосудистой стенки и ее проницаемости; мы ожидаем, что наше исследование косвенно позволит судить и об этом. Внедрение протокола скринингового обследования новорожденных, разработанного в рамках настоящего проекта, по нашим ожиданиям позволит улучшить качество лечения новорожденных детей, позволит разработать персональную программу лечения и снизит смертность и инвалидизацию в результате кровотечений и тромбозов.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Исследование гемостаза новорожденных остается нетривиальной проблемой. Это связано с несколькими трудностями: 1) относительно малый объем крови в образце, 2) существенный дисбаланс компонентов свертывания и 3) сложности в заборе крови. Ограничение по объему крови обязывает исследователей использовать небольшой набор тестов, который должен быть оптимален по информативности и чувствительности к нарушениям свертывания. Наличие дисбаланса диктует потребность в интегральных тестах, отражающих работу системы как целого. Поэтому в наше исследование наравне со стандартными тестами мы включили такие инновационные тесты как тромбодинамика и функциональная активность тромбоцитов – для оценки соответственно плазменного и тромбоцитарного звена. Для определения оптимального метода забора крови мы провели сравнение взятия крови из вены и из катетера. Оказалось, что при заборе крови из катетера в ней присутствуют следовые концентрации гепарина, который в обязательном порядке поступает в катетер. Кроме этого мы изучили возможность применения ингибитора контактной активации (так как кровь у новорожденного набирается достаточно медленно, мы ожидали значительный вклад от контактной активации). Однако оказалось, что основной вклад в усиленное по сравнению со взрослыми свертывание дает тканевый фактор. Мы использовали специфический ингибитор к тканевому фактору и показали, что в крови новорожденных присутствуют высокие его концентрации, вплоть до пикомолярных. За отчетный период, согласно плану, мы определили референсные диапазоны тестов гемостаза для здоровых новорожденных, при этом для тромбодинамики и функциональной активности тромбоцитов данные референсы были определены впервые. Мы показали, что плазменное свертывание новорожденных сдвинуто в сторону усиления, тогда как активация тромбоцитов ослаблена. Полученные результаты показывают, что в действительности гемостаз новорожденных различается от гемостаза взрослых почти по всем пунктам, причем эти изменения носят разнонаправленный характер. Это может означать, что и патогенез тромботических и геморрагических осложнений у новорожденных может отличаться от взрослых.

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Недоношенные новорожденные относятся к группе высокого риска кровотечений и тромбозов в раннем неонатальном периоде. Наиболее распространенные осложнения, такие как внутрижелудочковые кровоизлияния, обнаруживаются у 20% недоношенных детей и связаны с повышенной смертностью и неблагоприятными последствиями для развития нервной системы. Другие виды кровотечений встречаются реже, но могут иметь и смертельные последствия. Тромбоз регистрируется у 2,4–7% новорожденных в отделениях интенсивной терапии, более половины из которых являются недоношенными детьми. Эти геморрагические и тромботические проявления возникают в основном в течение первой недели после рождения. Несмотря на известные изменения как в плазме, так и в тромбоцитах новорожденных, тромботические и геморрагические осложнения у здоровых доношенных новорожденных встречаются редко. Похоже, что у новорожденных существует альтернативный баланс между прокоагулянтными и антикоагулянтными компонентами, который, по-видимому, легко сдвигается при осложнениях, включая недоношенность. Лабораторные диагностические инструменты, имеющиеся в распоряжении врача, недостаточно чувствительны к проявлению нарушений в этом балансе из-за высокой чувствительности к отдельным компонентам системы, а не к балансу в целом. Измерение индивидуальных концентраций белка коагуляции не может служить точным инструментом для оценки гемостатического баланса из-за сложности и нелинейности системы. Более того, такое измерение невозможно у новорожденных, так как требует большого количества крови, которую нельзя взять у этих пациентов. Наконец, не существует обычного теста на коагуляцию, который мог бы надежно отражать состояние гиперкоагуляции. Ситуация с тромбоцитами также неясна, возможно, потому, что количество тромбоцитов в периферической крови в настоящее время является единственным лабораторным критерием, на котором лечащий врач полагается при оценке гемостаза тромбоцитов. Таким образом, проблема оценки баланса гемостаза у новорожденных до сих пор не имеет оптимального решения в клинической практике. Подходящим решением этой проблемы, по-видимому, является использование глобальных анализов коагуляции, которые, с одной стороны, отражают общую производительность системы и, с другой стороны, требуют приемлемого количества крови для анализа. На первом этапе исследования мы определили референсные диапазоны тестов гемостаза для здоровых новорожденных, при этом для тромбодинамики и функциональной активности тромбоцитов данные референсы были определены впервые. Мы показали, что плазменное свертывание новорожденных сдвинуто в сторону усиления, тогда как активация тромбоцитов ослаблена. За отчетный период, согласно плану, мы охарактеризовали состояние системы гемостаза у недоношенных новорожденных детей в динамике в течение первого месяца со дня рождения, провели сравнительный анализ состояния системы гемостаза у недоношенных новорожденных по отношению к гемостазу взрослых и условно здоровых доношенных новорожденных, провели сравнительный анализ показателей гемостаза в зависимости от наличия клинических осложнений (тромбозов, кровотечений, инфекций) и разработали схему скринингового обследования гемостаза новорожденных. Полученные результаты показывают, что в действительности гемостаз здоровых новорожденных различается от гемостаза взрослых по характеристикам плазменного, тромбоцитарного и сосудистого звеньев. Обнаруженные изменения носят разнонаправленный характер, что, с учетом отсутствия тромботических и геморрагических проявлений у здоровых доношенных новорожденных, говорит о существовании иного баланса системы гемостаза, отличающегося от баланса у взрослых. Это означает, что патогенез тромботических и геморрагических осложнений у новорожденных может отличаться от взрослых.

 

Публикации

1. А.В. Полетаев, Е.М. Кольцова, А.А. Игнатова, А.Д. Купраш, П.Г. Гительзон, А.М. Сепоян, А.Н. Баландина, Г.А. Новичкова, М.А. Пантелеев Alterations in the parameters of classic, global, and innovative assays of hemostasis caused by sample transporta-tion via pneumatic tube system Thromb Res., 170:156-164 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.thromres.2018.08.024

2. А.Н. Баландина, И.И. Серебрийский, А.В. Полетаев, Д.М. Полохов, М.А. Грачева, Е.М. Кольцова, Д.М. Варданян, И.А. Тараненко, А.Ю. Крылов, Е.С. Урнова, К.В. Лобастов, А.В. Черняков, Е.М. Шулутко, А.П. Момот, Ф.И. Атауллаханов Thrombodynamics – a New Global Hemostasis Assay for Heparin Monitoring in Patients under the Anticoagulant Treatment. PLoS One, 13(6):e0199900 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199900

3. Е.М. Кольцова, А.Н. Баландина, Е.А. Серегина, А.В. Полетаев, Т.А. Вуймо, М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов. Современные аспекты патогенеза, диагностики и терапии нарушений гемостаза у детей с острыми лей-козами. Российский журнал детской гематологии и онкологии., Т5 №4; стр.74-85. (год публикации - 2018) https://doi.org/10.17650/2311-1267-2018-5-4-74-85

4. Кольцова Е.М., Балашова Е.Н., Игнатова А.А., Полетаев А.В., Полохов Д.М., Купраш А.Д., Ионов О.В., Киртбая А.Р., Ленюшкина А.А., Тимофеева Л.А., Зубков В.В., Дегтярев Д.Н., Сухих Г.Т., Атауллаханов Ф.И., Пантелеев М.А., Баландина А.Н. Impaired platelet activity and hypercoagulation in healthy term and moderately preterm newborns during the ear-ly neonatal period Pediatr Res, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1038/s41390-018-0184-8

5. Е.М. Кольцова, А.Н. Баландина, Е.А. Серегина, А.В. Полетаев, Т.А. Вуймо, М.А. Пантелеев, Ф.И. Атауллаханов. Аспекты методологии лабораторных исследований гемостаза в детской гематологии-онкологии и общие подходы в патологии гемостаза при лейкозах. Российский журнал детской гематологии и онкологии., Т5 №3; стр.74-88. (год публикации - 2018) https://doi.org/10.17650/2311-1267-2018-5-3-74-88

6. - Ученые: у новорожденных повышен риск возникновения тромбоз Газета.Ru, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Внедрение протокола скринингового обследования новорожденных, разработанного в рамках настоящего проекта, по нашим ожиданиям, позволит улучшить качество лечения новорожденных детей, позволит разработать персональную программу лечения и снизит смертность и инвалидизацию в результате кровотечений и тромбозов.