Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. В ходе выполнения Проекта была создана виртуальная комбинаторная библиотека пептидов на основе вирусов – потенциальных триггеров аутоиммунных заболеваний. При выборе наиболее перспективных инфекционных агентов учитывались следующие параметры: (1) ассоциация вируса с аутоиммунными заболеваниями; (2) данные по молекулярной мимикрии для В- и Т-клеток между вирусными белками и аутоантигенами (3) распространенность вируса как на территории России, так и в мире в целом; (4) способность вируса проникать в центральную нервную систему, разрушать гематоэнцефалический барьер и участвовать в развитии воспаления ЦНС. В результате было отобрано 17 вирусов – потенциальных индукторов аутоиммунных заболеваний. Нуклеотидные последовательности были разбиты на 150-членные фрагменты с перекрытием в 60 нуклеотидов и оптимизированы для генно-инженерных работ и прокариотической экспрессии в E.coli, В итоге размер виртуальной комбинаторной библиотеки составил 12489 пептидов, соответствующих 857 вирусным белкам. За основу создания комбинаторных библиотек была взята схема «моновалентных» фаговых библиотек, где каждый ауто- или вирусный пептид представлен в среднем одной копией на поверхности отдельного нитчатого бактериофага М13К07 в составе белка оболочки p3 фаговой частицы. Таким образом, к его N-концу был добавлен анализируемый пептид, с которым смогут связаться В-клеточные рецепторы. Для создания описанной библиотеки был создан ряд генетических конструкций, несущих сайты эндонуклеаз рестрикции для вставки олигонуклеотидов, кодирующих пептиды, и эпитопы для детекции, которые разделены гибкими серин-глициновыми линкерами и находятся в одной рамке считывания с белком р3 оболочки бактериофага. Для одновременной детекции пептидов различного происхождения было проанализировано четыре типа эпитопов – FLAG-эпитоп, HA-эпитоп, c-myc-эпитоп и Avi-Tag. Последний представляет собой короткий пептид, с высокой специфичностью узнаваемый биотин-лигазой (BirA), что позволяет ковалентно конъюгировать биотин к этому эпитопу, а далее детектировать с помощью стрептавидина. Для повышения эффективности и упрощения процедуры создания библиотеки биотинилированных пептидов в составе бактериофагов была разработана система биотинилирования in vivo. Для проверки корректного экспонирования пептидных детерминант были так же созданы структурные каркасы фаговых библиотек, содержащие презентируемые пептиды в линейной форме или в составе структуры, модулирующей образование альфа-спирали. Была отработана система селекции кроссреактивных В-лимфоцитов с применением фаговых пептидных библиотек на основе метода проточной цитофлуорометрии на примере модельной пары пептид – антитело, полученной ранее в нашей лаборатории. Для наиболее достоверной имитации будущего отбора В-клеток, специфически связывающих вирусные пептиды, использовалась клеточная линия Raji, стабильно экспрессирующая заякоренное за мембрану рекомбинантное антитело к контрольному пептиду CILDLPKFC, который в свою очередь был интегрирован в созданные в ходе выполнения Проекта генетические конструкции для наработки в составе бактериофагов с FLAG-эпитопом, HA-эпитопом, c-myc-эпитопом или Avi-Tag. Далее были подобраны условия инкубации анализируемых клеток с бактериофагами и флуоресцентными антителами для последующего анализа методом проточной цитофлуорометрии. На основании экспериментов, проделанных в первый год выполнения Проекта, следует, что для независимой детекции множественного связывания методом проточной цитофлуорометрии и визуализации кроссреактивного узнавания В-клетками оптимально одновременное использование трех следующих флуоресцентных меток и кластеров в составе бактериофагов (по одному для библиотеки аутоантигенов, для вирусной библиотеки и для бактериофагов дикого типа, используемых в качестве отрицательного контроля): (I)a-c-myc-FITC, (II) a-FLAG-PE, (III) a-HA-Alexa 647. В рамках выполнения проекта нами был установлен молекулярный механизм действия препарата нового поколения для лечения РС "Ксемус". Показано, что действие препарата двухфазное, при этом на первой фазе происходит Th1-Th2 сдвиг с выбросом противовоспалительного цитокина IL-10, в то время как последующий эффект связан с "перезагрузкой" иммунной системы провоспалительными цитокинами и индукцией регуляторных Т-клеток (Treg). 2. Под руководством Кулаковой О.Г. были собраны статистические данные 565 больных рассеянным склерозом (РС) (средний возраст 38,8 ± 10,6 лет) и 471 здоровых (средний возраст 48,2 ± 20,9 лет) доноров русской этнической принадлежности по 13 группам аллелей HLA-DRB1. Исходя из проведенного статистического анализа высокую предрасположенность к РС показывают группы аллелей 15 (OR 2.84) и 03 (OR 1.77), а протективными являются группы аллелей с одинаковыми показателями 01 (OR 0.55) и 11 (OR 0.56). В соответствии с обзором литературных данных существуют гаплотипы различных аллелей HLA-DR и HLA-DQ, обладающие как высокой, так и низкой предрасположенностью к разным аутоиммунным заболеваниям. Исходя из этих данных литературы и статистики по РС были выбраны следующие аллели для дальнейшего получения в растворимой форме с целью проведения отбора аутоантигенных пептидов из фаг-дисплейной библиотеки: DRB1 0101, 0103 (гр. 01); 0301 (гр. 03); 0401, 0402, 0405 (гр. 04); 1101 (гр. 11); 1302 (гр. 13) (H. Furukawa et al., 2017); 1401 (гр. 14); 1501 (гр. 15); DQ1, DQ2.5, DQ6.1 (E.Y. Jones et al., 2006), DQ6.2, DQ8.1. В связи с низкой частотой встречаемости некоторых групп аллелей в русской популяции и отсутствии литературных данных по ним, было принято решение не рассматривать в дальнейшем группы аллелей 09, 10, 12 и 16. В случае оставшихся групп 07 и 08 были выбраны аллели DRB1 0701 и 0801. Со всеми выбранными аллелями были получены генетические конструкции pMT-V5/His_DRα/DQα_Fos и pRmHa_DRβ/DQβ_Jun, кодирующие вариабельные и константные домены α и β цепей HLA-DR/DQ с собственными сигнальными последовательностями, сайт тромбина, серин-глициновый линкер, лейциновые домены факторов транскрипции fos с Avitag и jun c 6xHis. С помощью полученных плазмид были отобраны по устойчивости к бластицидину стабильные линии клеток S2 Drosophila melanogaster, экспрессирующие соответствующие аллели. Следующим этапом все аллели HLA-DR были экспрессированы в бессывороточной среде Sf900 III с содержанием 1 mM Cu2+ в течение 9 дней при 27ºС. Препараты HLA-DR были очищены с помощью аффинного носителя с антителами L243 и анион-обменной хроматографии на MonoQ. Выход препаратов разных аллелей HLA-DR составил 0,5-1 мг с литра среды с чистотой не менее 90%. 3. Для поиска специфических лигандов опухолевых лимфоцитов была создана аутокринная репортерная линия клеток. Репортерная линия позволяет детектировать взаимодействие трансмембранно-заякоренных белков библиотеки с мутантной формой CD19ex2. В ответ на взаимодействие лиганда и CD19 клетка начинает продуцировать флуоресцентный белок tdTomato. С помощью известного анти-CD19 антитела (FMC63) и полноразмерного CD19 была произведена валидация системы отбора. Данная репортерная система будет использована в качестве эффективного метода отбора лигандов распознающих CD19ex2. Для проведения раундов отбора были созданы лентивирусные библиотеки трансмембранно-заякоренных антител, а также линейных и цикло- пептидов. Созданные библиотеки были переведены в формат лентивирусных частиц и использованы для трансдукции клеток линии HEK293. Для подтверждения мембранной экспрессии белков библиотеки трансдуцированные клетки окрашивали флуоресцентно-мечеными антителами. В качестве альтернативного подхода к получению лигандов мутантной формы CD19 нами были получены рекомбинантные белкиCD19ex2 и CD19ex2-Fc, которые были использованы для иммунизации животных и получения гибридом, а также будут использованы для проведения раундов фагового отбора. Для изучения кинетических параметров степени и скорости активации Т-клеток в зависимости от антигенной стимуляции была создана панель химерных белков на основе основе фотоактивного белка Orange Carotenoid Protein (OCP), которые потенциально могут быть использованы для детекции изменения температуры на мембране митохондрий.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. В ходе выполнения проекта была существенно улучшена разработанная платформа для высокопроизводительной селекции кроссреактивных антиген-специфичных В-лимфоцитов с применением флуоресцентных зондов на основе лигандов В-клеточных рецепторов. Была подтверждена функциональность системы при использовании гиперфага-помощника и фагового вектора fADL-1e. Были оптимизированы условия детекции, позволяющие визуализировать до 97% антиген-специфичных клеток. При этом использование химически синтезированного биотинилированного пептида позволяет детектировать только около 65% антиген-специфичных В-клеток. 2. В ходе выполнение проекта была создана вирусная библиотека – fADL-viral-HA размером 12489 независимых пептидов и библиотека аутоантигенов fADL-auto-flag размером 11973 независимых пептидов. В представленных библиотеках белковые последовательности были разбиты на 44-членные аминокислотные последовательности с перекрытием в 14 аминокислот с добавлением адаптеров для лигирования. При конструировании библиотек были оптимизированы условия эмульсионной ПЦР, результаты верифицировались с помощью технологии широкомасштабного секвенирования. 3. Для поиска кроссреактивных В-клеток анализировались лимфоциты из периферической крови больных с аутоиммунными нарушениями. Для определение нуклеотидных последовательностей триад «патоген – аутоантиген – В-клеточный рецептор», характерных для кроссреактивных В-клеток, участвующих в развитии аутоиммунных патологий применялась технология широкомасштабного секвенирования Illumina MiSeq. Был проведен сравнительный анализ эффективности амплификации вариабельных фрагментов Ig с использованием двух наборов праймеров. В ходе выполнения проекта были оптимизированы условия, позволяющие эффективно секвенировать тяжелые и легкие цепи В-клеточных рецепторов кроссреактивных лимфоцитов. 4. В ходе выполнения данного проекта был создан биомаркер рассеянного склероза на основе антител-зависимой деградации нового химически синтезированного флуоресцентного субстрата с резонансным переносом энергии, содержащего флуорофор Cy5 и тушитель QXL680, разделенные пептидом ОБМ 81-99: Cy5-ОБМ81-99-QXL680. Было показано, что данный субстрат подвергается деградации при инкубации с очищенными антителами и с В-клетками пациентов с РС и мышей с ЭАЭ, но не при инкубации с антителами или В-клетками здоровых доноров и интактных мышей. Представленный маркер может не только служить для дифференциальной диагностики активного прогрессирующего РС, но и в фундаментальных исследованиях по поиску каталитических аутоантител и В-клеток. 5. Экспрессия каждой аллели HLA-DQ (DQ1, DQ2.5, DQ6.1, DQ6.2, DQ8.1) проводилась с использованием полученных в прошлом году стабильных линий клеток S2. Препараты HLA-DQ были очищены с помощью аффинного носителя Ni-NTA и MonoQ. Выход препаратов разных аллелей HLA-DQ составил 0,5-1 мг с литра среды с чистотой не менее 90%. Препарат HLA-DRB1 0101 (далее DR1) был ферментативно биотинилирован биотин-лигазой BirA в соответствии со стандартным протоколом для дальнейшего подбора условий отбора из фаг-дисплейной библиотеки. 6. В прошлом году исходя из генетического анализа больных рассеянным склерозом (РС) и здоровых доноров были определены группы аллелей риска HLA-DRB1 15, 03 и протективных аллелей 01 и 11. Рекомбинантные DR1 и DR15 были проскринированы относительно ранее созданной библиотеки перекрывающихся пептидов MBP, слитных с тиоредоксином (Belogurov el al, 2008). HLA-DRB1 0101 специфически связывается с MBP146-170. Как и предполагалось, HLA-DRB1 1501 специфически распознает энцефалитогенный пептид MBP81-104. Кроме того, было подтверждено узнавание DR1 своей классической антигенной детерминанты - иммунодоминантный пептид 306-318 гемагглютинина (HA) вируса гриппа. В результате данных исследований были определены аутоантигенные миелиновые пептиды для DR1 и DR15, а также вирусный пептид HA в случае DR1. Данные пептиды будут использованы далее в качестве положительных контролей при отборах из фаговых аутоантигенной и вирусной пептидных библиотек. 7. С использованием полученного ранее биотинилированного DR1 были проведены 3 раунда отбора из фаговой 12-членной пептидной библиотеки Ph. D. (Bio Labs) для подбора условий дальнейшего отбора из фаговых аутоантигенной и вирусной пептидных библиотек. В первый раз мы не проводили предварительно отрицательную селекцию на носитель со стрептавидином с целью, чтобы не потерять потенциальные варианты библиотеки. В результате были отобраны 10 клонов, фаговая ДНК которых была секвенирована. Все отобранные клоны несли пептиды только с двумя возможными последовательностями, причем, высоко гомологичными между собой в N-концевой части. Далее были получены генетические конструкции pET32b_CH_С7 и pET32b_CH_D7, с помощью которых были получены препараты рекомбинантных пептидов C7 и D7, слитных с тиоредоксином. Оба пептида C7 и D7 показали высокие сигналы и в случае инкубации с HLA-DR1 со стрептавидином, и в случае только стрептавидина без HLA-DR1, что свидетельствует о неспецифическом взаимодействии отобранных пептидов со стрептавидином. В результате мы сделали вывод, что невозможно проводить отбор без предварительной отрицательной селекции. Во второй раз были повторены 3 раунда отбора из фаговой 12-членной пептидной библиотеки Ph. D., но с проведением предварительной отрицательной селекции 10(E+10) фагов библиотеки на блокированные магнитные шары со стрептавидином с целью отсечь в I раунде неспецифические фаги. В результате методики, как и в первый раз, был отобран пептид Е6. Анализ взаимодействия выбранного рекомбинантного пептида E6, слитного с тиоредоксином, с HLA-DR1 подтвердил специфичность данного взаимодействия. Однако данный пептид не составляет особый интерес, будучи неприродным. В резульате отборов были подобраны условия для дальнейших отборов из фаговых аутоантигенной и вирусной пептидных библиотек. 8. Для аллелей DRB1 0101 и DRB1 1501 был создан контрольный фаг, несущий высоко аффинный вирусный пептид (пептид гриппа HA в случае DR1 и фрагмент вирусного белка pp65 для аллели DR15), а также для обоих аллелей были созданы контрольные фаги с хорошо связывающимися фрагментами аутоантигена MBP: фаг с пептидом MBP81-104 для DR15 и фаг с пептидом MBP146-170 для DR1. Данные конструкции создавались на базе вектора pHen2 и имели сходное с конструкциями фаговой библиотеки строение. Для определения эффективности отбора из библиотеки данные положительные контроли были смешаны с фагами библиотеки в соотношении контроль/библиотека 1/10 для каждого контрольного фага индивидуально. Далее проводили связывание фагов с биотинилированными молекулами MHC II в растворе с последующей иммобилизацией связанных c MHC фагов на магнитные шары со стрептавидином. На момент написания отчета проводился лишь I раунд отбора контрольных фагов с предварительной отрицательной селекцией по методике, подобранной выше. 9. В ходе выполнения проекта получены моноклональные антитела специфичные к мутантному антигену CD19ex2 – клоны B2, B7 и C9. На основе генов полученных МонАт были созданы химерные антигенные рецепторы Т клеток. Т лимфоциты, модифицированные полученными CAR, лизируют клетки HEK293T экспрессирующие CD19ex2. Была собрана коллекция биопсического материала, отобранного у педиатрических пациентов с диагнозом В-ОЛЛ с рецидивами или не отвечающих на лечение. С помощью флуоресцентно меченных МонАт B2 и B7 был проведен цитофлуориметрический анализ отобранных образцов. 10. В ходе выполнения проекта произведен поиск антител специфичных к мутантной форме CD19ex2 методом фагового дисплея полусинтетической библиотеки scFv Griffin.1. Отобрать scFv специфический к CD19ex2 не удалось. 11. В ходе выполнения проекта получены рекомбинантные белки CD19 и CD22, которые будут использованы для иммунизации животных и создания би-специфических химерных антигенных рецепторов. 12. В ходе выполнения проекта был разработан подход получения CART клеток направленно элиминирующих только опухолевые В-лимфоциты. Работоспособность предложенной концепции была валидирована для трех пациентов с диагнозом фолликулярная лимфома. Полученные персонифицированные CART клетки специфически элиминировали лимфомные клетки in vitro, ex vivo и in vivo. По результатам выполненной работы опубликована статья в журнале Science Advances. 13. В ходе выполнения проекта была разработана технология направленной элиминации опухолевых клеток CART клетками при терапии Т клеточной лимфомы и лейкемии. Методом NGS были идентифицированы уникальные последовательности участка CDR3 Т клеточного рецептора раковых клеток 9 пациентов с диагнозом Т клеточная лимфома и лейкемия, а также клеток Jurkat и MOLT-4. Обнаруженные пептидные последовательности CDR3 были синтезированы и использованы для поиска scFv специфичных к данным последовательностям методом фагового дисплея. После трех раундов селекции были получены scFv, специфичные к CDR3 TCR пациентов #1, #6 и #8. Нуклеотидные последовательности данных scFv были интегрированы в состав химерных антигенных рецепторов и будут использованы для модификации Т лимфоцитов и дальнейших экспериментов in vitro и in vivo. 14. В ходе выполнения проекта были созданы химерные антигенные рецепторы Т-клеток с возможностью регуляции активности модифицированных лимфоцитов in vivo. Был получен химерный антигенный рецептор содержащий вариабельные домены каталитического антитела 38C2 в формате scFv. Был синтезирован конъюгат 1,3-дикетона и фолата. Было показано, что Т клетки модифицированные 38C2-Fc-CAR экспрессируют CAR обладающий каталитической активностью антитела 38C2. Было показано, что 38C2-Fc-CART дозозависимо от концентрации 1,3-дикетона-фолата лизирует линию опухолевых клеток KB и не обладает неспецифической цитотоксичностью. Была отработана животная модель на основе опухолевых клеток KB несущих ген люциферазы и иммунокомпетентных мышей линии NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJl).

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Для отборов использовали рекомбинантный HLA-DRB1*0101 (DR1), полученный ранее в результате экспрессии линии S2, и смесь двух типов рекомбинантных фаговых частиц, полученных ранее на основе вектора FADL, несущих на своей поверхности либо пептид HA, фрагмент гемагглютинина вируса гриппа (PKYVKQNTLKLAT), либо иррелевантный пептид P1 (CILDLPKFC), являющиеся положительным и отрицательным контролями для связывания с DR1 соответственно. Для взаимодействия с MHCII использовали либо индивидуальный фаг HA (DR1+HA), либо индивидуальный фаг P1 (DR1+Р1), либо смесь двух фагов в соотношении фаг HA/фаг P1 = 1/100 (DR1+HA/P1). Далее проводили определение CFU после последнего отмывания и в элюате для каждой реакции фаг-MHCII с помощью заражения культуры E. coli штамма TG. Процент положительно контрольного фага в смеси с отрицательно контрольным фагом определяли с помощью реакции ПЦР. Результатом такого контрольного отбора является, во-первых, значительное превышение CFU в элюатах по сравнению с последним отмыванием в случае отборов DR1+HA и DR1+HA/P1; а также отсутствие отобранных клонов и в случае последнего отмывания, и в случае элюата для отбора отрицательно контрольного фага DR1+P1; во-вторых, путем ПЦР было показано наличие последовательности HA в 100% клонов после первого раунда отбора. Эти данные свидетельствуют о высокоэффективном отборе положительно контрольного фага HA. 2. В соответствии с подобранными выше условиями по данной методике были проведены отборы пептидов для двух аллелей MHCII DR1 и DR15 (HLA-DRB1*1501) c использованием фаговых библиотек аутоиммунных и вирусных 44 членных пептидов на базе векторов FADL и pHEN2 соответственно, созданных в нашей лаборатории на предыдущем этапе проекта. Были проведены два раунда отбора для каждой аллели из аутоиммунной и вирусной библиотек: DR1/ауто и DR15/ауто, DR1/вирус и DR15/вирус. Параллельно проводили раунды отрицательно контрольного отбора DR-/ауто и DR-/вирус, где в смеси не содержался рекомбинантный белок DR. В результате секвенирования некоторых отобранных клонов во всех отборах не выявлен мажорный пептид, все клоны обладают индивидуальной последовательностью. Однако в случае отбора из вирусной библиотеки на DR15 были найдены два перекрывающих пептида из ORF17 вируса гаммагерпеса 8. Кроме того, в случае отрицательно контрольных отборов их обеих библиотек без DR выявлены часто встречающиеся пептиды, которые в свою очередь не встречаются в положительных отборах, что говорит о специфичном взаимодействии фагов с DR. 3. В ходе выполнения проекта были определены оптимальные условия работы с созданными комбинаторными библиотеками на основе бактериофага M13K07, экспонирующего на своей поверхности пептид вирусной или аутоантигенной природы. Определено, что максимальный размер библиотеки, с которой возможен наиболее эффективный отбор антиген-специфичных В-клеток, составляет 10-20 тысяч независимых клонов. Определено, что отбор специфичного лиганда из библиотеки бактериофагов с использованием технологии проточной цитофлуорометрии возможен только при концентрации данного клона выше Е(10) КОЕ/мл. 4. Для предварительного определения вирусных и аутоантигенных белков, ассоциированных с аутоиммунными нарушениями, проанализированы лимфоциты из периферической крови двух пациентов с рассеянным склерозом и трех здоровых доноров. Определен ряд последовательностей вирусных и аутоантигенных лигандов, связавшихся с отобранными антиген-специфичными В-клетками. На основании полученных последовательностей найдены общие аминокислотные мотивы и общие эпитопы среди вирусных и аутоантигенных пептидов. При этом для аутоантигенных пептидов найдено большее количество общих мотивов, чем для вирусных, и они в целом длиннее. 5. В ходе выполнение проекта была создана система бар-кодирования с использованием «пересхлопывающейся» полимеразной цепной реакции для сопоставления кросс-реактивных вирусных и аутоантигенных пептидов, отобранных при взаимодействии с В-клеточными рецепторами. В данной системе отобранные антиген-специфичные В-клетки и связавшиеся с ними бактериофаги с экспонированными лигандами упаковываются в эмульсии размером 20-40 мкм. Таким образом в одной капле оказывается не более одной В-клетки и только специфичные к ее В-клеточному рецептору вирусные и аутоантигенные пептиды. Далее при эмульсионной ПЦР происходит «пересхлоп» нуклеотидных последовательностей кросс-реактивных пептидов вирусной и аутоантигенной природы, отделенных специальным линкером с бар-кодом. Итоговый ампликон, содержащий кросс-реактивные вирусные и аутоантигенные нуклеотидные последовательности пептидов, связавшиеся с одним В-клеточным рецептором, состоит из 500 нуклеотидов и подходит для широкомасштабного секвенирования с использованием Illumina MiSeq. 6. В ходе выполнения данного проекта у одного из пациентов с В-клеточной лимфомой было обнаружено антитело, специфически связывающее циклопептид CILDLPKFC. С использованием биоинформатического анализа была обнаружена высокая гомология данного пептида не только с аутоантигеном человека - миоферлином (KLDLPNR), но и с бактериями Streptococcus mitis и Pheumocystis jirovecii (ILDLPKF). Для проверки кроссреактивности, данное антитело было проэскпрессированно в формате полноразмерного IgG и почищено на смоле protein G. Его аутоантигенная специфичность была подтверждена путем связывания с клетками HEK293T, экспрессирующими миоферлин, и с клетками Hep-2. 7. Создание би-специфических CD19/CD22 химерных антигенных рецепторов. Из В-клеток альпак, иммунизированных рекомбинатными белками CD19 и CD22, была создана фаговая библиотека одноцепочечных антитела (VHH). После трех раундов отбора было показано обогащение VHH специфичных к CD19 и CD22. Моноклональная ELISA позволила отобрать клоны VHH специфичных к CD19 и CD22. Для анализа цитотоксического действия создаваемых би-/моно-специфических CAR были созданы линии клеток HeLa CD19+, а также линия клеток JeKo-1 CD19+/CD22+ RFP. 8. Разработка CART для персонифицированной адоптивной иммунотерапии лимфомы и лейкемии. Окрашивание биоптатов пациентов и клеточных линий отобранными scFv, специфичных к участку CDR3 Т клеточного рецептора раковых клеток, подтвердили взаимодействие scFv только с опухолевыми клетками. Гистологический анализ окрашивания срезов тканей здоровых доноров доказал безопасность отобранных scFv. Т лимфоциты, модифицированные CDR3-CAR, эффективно элиминировали опухолевые клетки in vitro и in vivo. По результатам выполненной работы была опубликована статья в журнале Leukemia. 9. Создание контролируемых химерных антигенных рецепторов на основе каталитических антител. Было показано, что 38C2-CART клетки секретируют провоспалительные цитокины ИЛ-2 и ФНО в прямой зависимости от концентрации 1,3-дикетон-фолата. Терапия иммунодефицитных мышей линии NSG с подкожно введенными клетками KB 38С2-CART клетками и 1,3-дикетон-фолатом подтвердила высокую терапевтическую эффективность 38С2-CAR. 10. In situ моделирование иммуноглобулинов с заданной специфичностью. На основе разработанного ранее QM/MM алгорита для виртуального созревания иммуноглобулинов, был предложен новый комбинированный метод QM/MM и моделирования метадинамики. 11. Создание регулируемых химерных антигенных рецепторов на основе специфического взаимодействия РНКазы барназы и ее природного ингибитора барстара. Была создана панель химерных антигенных рецепторов несущих в своем составе Барстар. Для выбора оптимального дизайна Bs-CAR было создано 32 генетических конструкции наилучший вариант из которых будет использован для дальнейшей разработки регулируемого CAR. 12. Создание внутриклеточного сенсора температуры для изучения динамических изменений состояния Т клеток. На основе светочувствительного каротиноидного белка, содержащего в своем составе флуоресцентные белки TagGFP и TagRFP, был создан химерный белок для регистрации температур в диапазоне 30-40 °C с точностью не менее 0,1 °C. Результаты работы опубликованы в журнале Scientific Reports.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Было проведено широкомасштабное секвенирование вирусных и аутоантигенных последовательностей, связавшихся в составе бактериофагов с В-клетками пациентов с РС и здоровых доноров, с использованием платформы Illumina MiSeq. После биоинформатической фильтрации и выравнивания отсеквенированных последовательностей было получено более 20 тысяч прочтений для каждого пациента и здорового донора по отдельности для вирусной и аутоантигенной библиотек. Нам удалось идентифицировать связывание двух пептидов, принадлежащих вирусу герпеса человека 7 типа и аденовирусу человека 7 типа с В-клетками пациентов с РС. Для аутоантигенных пептидов было идентифицировано 2 белка для пациентов с РС и 6 белков для здоровых контролей. 2. Была оптимизирована система эмульсионной ПЦР с «пересхлопом» нуклеотидных последовательностей, принадлежащих вирусной и аутоантигенной библиотекам, для более точного одновременного сопоставления вирусных и аутоантигенных пептидов, отобранных при взаимодействии с кроссреактивным В-клеточным рецептором. В модифицированном протоколе получение «пересхлопнутого» ампликона разбито на три этапа: (1) амплификация нуклеотидных последовательностей, кодирующих отдельные вирусные и аутоантигенные пептиды в эмульсии с их последующим «пересхлопом»; (2) очистка образовавшегося ампликона на магнитных микросферах; (3) амплификация ампликона, кодирующего «пересхлопнутые» последовательности вирусного и аутоантигенного пептидов с использованием блокирующих фосфорилированных праймеров. 3. С помощью технологии широкомасшабного секвенирования было показано, что при эмульсионной ПЦР удается не только увеличить выход продукта при амплификации комбинаторных библиотек и увеличить однородность распределения клонов, но и уменьшить количество нуклеотидных ошибок в амплифицированных олигонуклеотидах по сравнению со стандартной ПЦР в растворе. На основания анализа результатов широкомасштабного секвенирования была построена математическая модель, позволяющая рационализировать оптимальные условия для амплификации ДНК-библиотек. Предложенный протокол позволяет избежать искусственного нарушения в представленности клонов при амплификации одноцепочечных и двуцепочечных ДНК-библиотек. Было показано, что данный подход особенно эффективен при работе со «сложными» библиотеками, в которых присутствует большое количество комплементарных повторов. 4. В ходе выполнения Проекта мы модифицировали систему отбора антиген-специфичных В-клеток с помощью сочетания фагового дисплея и проточной цитофлуорометрии для возможности отбора лигандов специфически связывающихся с MHC II непосредственно на клеточной мембране. Однако, мы можем предположить, что эффективность скрининга лигандов HLA класса II в формате биопэннинга, по-видимому, выше, чем при анализе на живых клетках. 5. По итогам терапии пациентов с диагнозом В-клеточный лимфобластный лейкоз аутологичными CAR19 T и би-специфическими CAR19/22 клетками проводимой на базе НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева показана зависимость эффективности терапии от плотности таргетируемых антигенов, которая может снижаться. Полученные данные свидетельствуют, что даже двойное таргетирование опухоли не является гарантией успешной терапии. 6. Для решения проблемы ускользания опухоли с помощью снижения плотности торпедируемого антигена начаты работы по созданию CAR с возможность регуляции чувствительности к плотности антигена при терапии в режиме реального времени. 7. Была получена панель химерных антигенных рецепторов специфичных к CD33 и CD123, активность которых было подвержена in vitro. 8. Было показано, что BstCART клетки специфически лизируют таргетные клетки и секретируют провоспалительные цитокины в зависимости от концентрации дарпин-барназы. Для определения терапевтического потенциала BstCART была проведена терапия иммунодефицитных мышей линии Nude с подкожно введенными клетками гиперэкспрессирующими HER2 рецептор. Прижизненная визуализация опухолевых клеток и измерение объема опухоли при подкожном введении не показало различий в динамике роста опухолевых клеток. Нами была отработана животная модель на основе мышей линии SCID. На данный момент начаты эксперименты определения терапевтического потенциала BstCART уже на новой животной модели. 9. Для расширения области применения CART на основе каталитического антитела 38C2 был синтезирован ряд химических соединений на основе 1,3-дикетон связывающихся с глутаматкарбоксипептидазой II (PSMA). В ходе командировки в The Scripps Research Institute (TSRI) была получена панель соединений DUPA с 1,3-дикетоном содержащие линкеры различного типа и длины. Анализ лизиса клеток рака простаты и выброса провоспалительных цитокинов IL-2 и IFN показал, что соединение DUPA-1-diketone с самым коротким линкером неактивно, DUPA-2-diketone обладает низкой эффективностью, а соединения DUPA-3-diketone, DUPA-4-diketone и DUPA-5-diketone оказались самыми эффективными как для индукции дозозависимого лизиса опухолевых клеток, так и для выброса провоспалительных цитокинов ИЛ-2 и ИФН. 10. Для определения терапевтического потенциала CART на основе каталитического антитела 38C2 была проведена терапия иммунодефицинтых мышей линии NSG с подкожно введенными клетками PC-3 PSMA. Животным вводили соединения DUPA-3-diketone, DUPA-4-diketone и DUPA-5-diketone. Полученные данные показывают, что совместное введение 38С2-CART клеток соединений DUPA-3-diketone, DUPA-4-diketone и DUPA-5-diketone эффективно подавляет рост опухоли или полностью уничтожает раковые клетки. Соединение DUPA-3-diketone оказалось самым эффективным и привело к 100% выживаемости. 11. Для измерения динамики изменений внутриклеточной температуры внутриклеточных компартментов Т клеток в процессе активации были получены эукариотические клетки, экспрессирующие сенсоры температуры на основе оранжевого каротинойдного белка и флуоресцентных белков RFP и GFP. Был разработан высокоэффективный способ доставки каротинойдов в эукариотические клетки. Была выбрана оптимальная длина линкера для наиболее эффективного переноса энергии между OCP и флуоресцентным белком. 12. В соответствии с подобранными в прошлом году условиями были проведены отборы пептидов для двух аллелей MHCII DR1 (HLA-DRB1*0101) и DR15 (HLA-DRB1*1501) c использованием аутоиммунной фаговой библиотеки 44-членных пептидов на базе вектора FADL, созданной в нашей лаборатории на предыдущих этапах проекта. Были проведены два раунда отбора для каждой аллели из аутоиммунной библиотеки. Параллельно проводили раунды отрицательно контрольного отбора, где в смеси не содержался рекомбинантный белок DR. 13. Было проведено широкомасштабное секвенирование около 10000 клонов с определением первичной структуры отобранных фрагментов аутоантигенов для каждого раунда отбора как для DRB1*0101, так и для DRB1*1501, а также для контрольного отбора. В результате анализа секвенирования с использованием нескольких критериев были определены потенциальные антигенные пептиды для DR1 и DR15. Для каждого HLA-DR были выбраны по 3 перспективных аутоантигенных пептида: для DR15 - 2',3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase), EGR1, multidrug resistance-associated protein 1 (MRP1); для DR1 - estrogen receptor (ER), melanoma-associated antigen B2 (MAGEB2), calmodulin (Calm). 14. Для подтверждения связывания MHC II с отобранными потенциальными антигенами, были получены генетические конструкции, кодирующие последовательности выбранных пептидов, слитных с тиоредоксином, для экспрессии в системе E.coli. Пептиды были экспрессированы в E.coli BL21(DE3) и очищены в два этапа с помощью метал-хелатной хроматографии на NiNTA и катионобменной хроматографии на MonoS. К сожалению, получить пептид CNPase не удалось по причине того, что белок выпал в осадок. Чистота препаратов остальных пептидов составила не менее 90%, а выход – не менее 5 мг с литра среды. 15. Для экспрессии DR1-CLIP и DR15-CLIP в суспензионных эукариотических клетках HEK293F были получены генетические конструкции pFUSE_DRa_lhFc, pFUSE_DRB1_0101_CLIP_lhFc и pFUSE_DRB1_1501_CLIP_lhFc, кодирующие внеклеточные домены альфа и бета цепей DR1 и DR15 с CLIP, слитные с Fc фрагментом человека через удлиненный hinge. DR1-CLIP и DR15-CLIP были экспрессированы в суспензионных клетках HEK293F и очищены с помощью аффинной хроматографии на ProteinG. Чистота белковых препаратов составила не менее 90%, а выход – около 1.5 мг с литра среды. 16. Для подтверждения связывания MHC II с отобранными потенциальными антигенными пептидами, был проведен иммуноферментный анализ взаимодействия пяти полученных рекомбинантных пептидов, слитных с тиоредоксином, с рекомбинтными DR1-CLIP и DR15-CLIP. В случае DR1 наблюдалось специфическое взаимодействие с пептидом MAGEB2, отобранным на DR1. Тогда как в случае DR15 специфическое взаимодействие показали пептиды EGR1, отобранный на DR15, и ER, отобранный на DR1. В дальнейшем планируется исследовать термодинамические и кинетические свойства взаимодействия тех пептидов, которые показали специфическое связывание. 17. При выполнении проекта была доказана универсальность комбинированного метода QM/MM и моделирования метадинамики с вороночным потенциалом. Для этого на основании первичной структуры антител А21 и А46 (антител, ковалентно связывающих фосфорорганический арилфосфонат) c помощью программы Modeller были получены 3D-модели соответствующих антител. После была проведена funell-метадинамика полученных структур с (R)- и (S)-изомерами субстрата арилфосфоната. В результате были получены поверхности свободной энергии в координатах d(TyrO-P) и угол(TyrCb-O-Pxop) и было установлено, что антитело А21 предпочтительно будет взаимодействовать с (R)-изомером субстрата, в то время как А46 с (S)-изомером. Для антител А21 и А46 были получены соответствующие генетические конструкции, проведена экспрессия, выделение и очистка соответствующих антител. Очищенные препараты были использованы для оценки взаимодействия с (R)- или (S)-изомерами арилфосфоната. Полученные результаты экспериментально подтвердили расчеты.