Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Целью проекта является выявление и характеристика микробных процессов, приводящих к образованию энергоносителей (углеводородов, водорода) и получению электричества в топливных элементах. Поэтому основными целевыми группами исследуемых микроорганизмов являются (1) метаногенные археи; (2) микроорганизмы, образующие водород из биополимеров (сельскохозяйственные отходы) или СО (газообразные отходы или сингаз); микроорганизмы, восстанавливающие или окисляющие в анаэробных условиях металлы с переменной валентностью, в первую очередь, железо и его минералы. Последняя группа микроорганизмов прямо связана с получением электричества в микробных топливных элементах, так как способность передавать электроны на внеклеточные акцепторы обуславливает и возможность их переноса на катод. Одной из задач нашего проекта является также исследование процессов современного образования углеводородов. В первый год выполнения проекта мы исследовали разнообразие микроорганизмов, относящихся к нашим целевым группам, с помощью нескольких методов: исследуя филогенетический состав микробных сообществ в анаэробных местообитаниях; изучая разнообразие соответствующих функциональных генов; получая накопительные культуры, осуществляющие искомые процессы и давая им первичную характеристику. Установлено, что во впервые исследованных нами микробных сообществах грязевых вулканов Таманского полуострова основными группами микроорганизмов являются сульфатредуцирующие бактерии и археи, осуществляющие анаэробное окисление метана, причем обнаруженная нами группа ANME-3 в наземных местообитаниях в качестве основного члена сообщества встречается впервые. Метаногенные археи присутствовали в исследованных образцах лишь как минорный компонент. Анализ полученных ранее метагеномов микробных сообществ горячих источников Тувы и Камчатки выявил большое разнообразие бактерий, в том числе целевых групп, детектированных по ключевым функциональным генам искомых процессов. Численность метаногенов в горячих источниках Камчатки была определена с помощью ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными к гену mcrA, кодирующему ключевой фермент метаногенеза - метилкоэнзим М редуктазу. На основании результатов, полученных с помощью молекулярно-биологических методов, были поставлены накопительные культуры с целевыми субстратами и получено 17 устойчиво пересевающихся микробных сообществ, обогащенных метаногенами, СО-трофами, образующими водород или этанол, а также микроорганизмами, в анаэробных условиях использующими энергию восстановленного железа, входящего в состав минерала сидерита (FeCO3). Было также продолжено исследование термофильных электрогенных микробных сообществ, полученных на электродах, помещенных непосредственно в горячие источники Камчатки. Для ряда накопительных культур путем высокопроизводительного секвенирования генов 16S рРНК были получены данные о их филогенетическом составе. Так, было установлено, что в двух термофильных накопительных культурах, образующих метан за счет восстановления метанола водородом, отсутствуют известные метаногены, а вместо них доминируют некультивируемые археи филума Crenacarchaeota. В электрогенных накопительных культурах из источников Камчатки присутствовали в основном железоредуцирующие представители филума Firmicutes, а также бактерии рода Sulfurhydrogenibium (филум Aquificeae). В накопительных культурах, полученных из трех разных горячих источников Чукотки и анаэробно растущих на минеральной среде с сидеритом, были обнаружены бактерии рода Thermus, составлявшие от 94 до 98% всего микробного сообщества. Структура сидерита подвергалась изменениям, что свидетельствовало об окислении входящих в нее атомов двухвалентного железа. Тот же процесс был отмечен в накопительной культуре из источника Солнечного (Камчатка), также анаэробно использующей сидерит, однако доминирующим микроорганизмом, составлявшим 80% микробной популяции, являлась бактерия рода Thermoanaerothrix. Для того, чтобы определить, что является акцептором электронов и конечным продуктом в этом удивительном процессе, накопительная культура из источника Солнечный была перенесена в 3-литровый ферментер, где были воссозданы условия природного местообитания: проток среды над осадком, содержащим восстановленное железо. В результате такого культивирования в течение 55 дней численность Thermoanaerothrix в культуре составила 98%, содержание СО2 в газовой фазе снизилось с 20 до 2%; кроме того, в среде появилось 200 мкМ ацетата. Таким образом, нам удалось продемонстрировать использование микроорганизмами энергии закисного железа, сопряженное с ацетогенезом - образованием ацетата из СО2. Этот процесс был впервые обнаружен в нашем коллективе при исследовании алкалофильной железоредуцирующей бактерии рода Geoalkalibacter, однако наши последние результаты показывают, что эта способность широко распространена у микроорганизмов с различной физиологией и филогенетическим положением. Минералы, содержащие восстановленное железо, также очень широко распространены на Земле, и микроорганизмы, использующие их энергию, могут найти применение в различных областях деятельности человека. Возможно их использование в топливных элементах, а также культивирование совместно с метаногенами, которые будут использовать ацетат или непосредственно образующиеся при окислении железа электроны. Наряду с накопительными культурами, в работе были использованы чистые культуры микроорганизмов целевых групп, собранных нашим коллективом ранее или выделенных специально для целей этой работы. Так, способность к изменению структуры сидерита при анаэробном росте была обнаружена у алкалофильной бактерии Fuchsiella alkaliacetigenes. Способность к образованию водорода при анаэробном использовании разнообразных биополимеров, в том числе целлюлозы и крайне устойчивых к гидролизу кератинов птичьих перьев была выявлена у термофильных бактерий родов Dictyoglomus, Melioribacter, Thermoanaerobacterium, Thermoanaerobacter, Caldanaerobacter. Эти микроорганизмы предполагается проверить на возможность использования для разложения органических отходов непосредственно, в сочетании с водород-использующими метаногенами или в микробных топливных элементах. Повышенная температура, при которой протекает процесс, окупается его скоростью и устойчивостью к загрязнению системы посторонней микрофлорой. Еще одним потенциальным кандидатом для образования водорода из полисахарид-содержащих отходов является выделенный нами ранее первый термофильный планктомицет Thermogutta terrifontis. В отличие от мезофильных планктомицетов, являющихся строгими аэробами, наш изолят способен к анаэробному росту с образованием водорода. В то же время, как все планктомицеты, он обладает крайне высоким гидролитическим потенциалом, разлагая широкий круг полисахаридов, включая целлюлозу и ксилан. Анализ полного генома T. terrifontis показал присутствие в нем 118 генов, кодирующих гликозидазы, полисахарид-лиазы и углевод-эстеразы, а также гены трех гидрогеназ, две из которых ранее у планктомицетов не встречались. Для исследования возможных источников "молодой нефти" на Камчатке из пробы грунта с Нефтяной площадки (кальдера Узон) была выделена термофильная архея Thermoplasma sp. Путем экстракции гексаном, а также в результате термолиза нерастворимой фракции при 330оС из биомассы этого микроорганизма получены н-алканы состава С10–С41 и изопренаны состава С11–С20, причем распределение тех и других соответствует таковому в слабопреобразованных нефтях. Таким образом, все поставленные на первый год проекта задачи выполнены: получены сведения о новых микроорганизмах, образующих энергоносители, удалось добиться устойчивого роста в лабораторных условиях новых представителей целевых групп, среди имеющихся коллекционных штаммов выявлены перспективные кандидаты для дальнейших исследований.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году работа велась в нескольких направлениях, обусловленных задачами проекта, как чисто фундаментальными, так и непосредственно связанными с получением высокоэнергизованных продуктов или электроэнергии с помощью микроорганизмов. С помощью метагеномного и филогенетического анализа исследованы микробные сообщества анаэробных местообитаний, в том числе новых, и получены устойчивые накопительные культуры новых групп микроорганизмов, осуществляющих продукцию энергоносителей . Одними из объектов исследования были грязевые вулканы, обеспечивающие наиболее простой доступ к анаэробным микробным сообществам подземной биосферы. Был проведен анализ метагенома грязевого вулкана Карабетова гора (Таманский полуостров), что позволило дать количественную характеристику существующего там анаэробного сообщества микроорганизмов и выявить доминирующие группы прокариот. Из метагенома было собрано 14 геномов, в том числе 8 со степенью полноты сборки выше 90%, что дает возможность охарактеризовать метаболизм присутствующих там новых, не известных в лабораторных культурах микроорганизмов. Наибольший интерес представляют археи групп ANME-2 и ANME-3, анаэробно окисляющие метан и ранее обнаруживаемые лишь в морских местообитаниях. В геномах этих организмов обнаружены все ключевые ферменты обратного процесса - метаногенеза, что дает основание предположить, что они способны не только окислять, но в определенных условиях и образовывать метан. Исследованы микробные сообщества новых анаэробных местообитаний - грязевых вулканов острова Сахалин и получена предварительная информация о присутствующих там микроорганизмах, в том числе метаногенах. Из ряда природных образцов получены устойчивые накопительные культуры, образующие метан из метоксилированных ароматических соединений - компонентов бурого угля. Оказалось, что в одной из них происходит накопление архей филума Bathyarchaeota, до сих пор считавщихся некультивируемыми и, предположительно, способными к метаногенезу (все до сих пор известные метагногены относятся к филуму Euryarchaeota). Еще одной ценной накопительной культурой является ассоциация бактерий, образующая этанол из СО (входит в состав сингаза или газообразных промышленных отходов), основным компонентом которой, согласно данным филогенетического анализа, являются микроорганизмы рода Acetobacterium. Изучен состав углеводородов, образующихся в термальных местообитаниях и ассоциированных с этим процессом термофильных микробных сообществ. Проведен анализ углеводородов, образующихся в горячих источниках кальдеры Узон, Камчатка (так называемая "молодая нефть" Узона). Получены профили генов 16S рРНК в этих же местообитаниях, что в дальнейшем послужит основой для лабораторного воспроизведения образования углеводородов из биомассы термофильных бактерий и архей. Продолжено исследование способности прокариот к анаэробному окислению неорганических соединений, сопряженному с образованием высокоэнергизованных продуктов. Установлено, что при инкубации алкалофильной бактерии Geoalkalibacter ferriacetica в присутствии металлического железа в анаэробных условиях и при рН 9.5 происходит коррозия железа, сопровождающаяся образованием значительных количеств водорода. На примере комбинированной культуры облигатно синтрофной бактерии Candidatus ‘Contubernalis alkalaceticum’ и Geoalkalibacter ferrihydriticus показано, что в процессе роста микроорганизмы могут переходить от конкурентных отношений (использование одного субстрата) к синтрофным (использование этого же субстрата с помощью двух взаимозависимых реакций). Присутствие магнетита стимулирует синтрофный рост, так как, по-видимому, магнетит служит интермедиатом при межвидовом переносе электронов; одновременно происходит окисление минералов восстановленного железа G. ferrihydriticus, приводящее к образованию ацетата из СО2. Таким образом, подтвержден новый энергетический процесс - ацетогенез с восстановленным железом как источником энергии; ацетат может быть в дальнейшем преобразован в метан или служить для продукции электричества. Показано, что разложение отходов птицеводства ассоциацией термофильных прокариот может идти с образованием метана. Комбинированная культура составленная из двух анаэробных штаммов - Thermoanaerobacter sp. и и Methanothermobacter marburgensis, осуществляет полное разложение крайне устойчивого белка кератина (измельченных птичьих перьев) с образованием метана как конечного продукта. Процесс, первоначально проводившийся в 100-мл флаконах, был затем масштабирован в 3.6 л ферментере. Он позволяет решать сразу две задачи - полную деградацию перьев, что является большой проблемой для птицеводческих комплексов, и получение метана, который может быть использован на месте для любых хозяйственных нужд. Методом адаптивной инженерии получен высокоэффективный штамм для переработки сингаза в водород. Процесс образования водорода из СО термофильной бактерией Thermosinus carboxidovorans был интенсифицирован с помощью адаптивной инженерии. В результате 70 последовательных пересевов культуры, находящейся в середине экспоненциальной фазы роста, скорость образования водорода из СО выросла в 4.3 раза. Полученная культура может быть использована для получения водорода из сингаза, а также послужит для выявления минимального набора генов, необходимых для гидрогеногенной карбоксидотрофии (сравнительный протеомный анализ исходной и адаптированной культур). Geobacillus thermoglucosidasius является пока единственным микроорганизмом, способным и к анаэробному, и к аэробному окислению СО, причем классические ферменты аэробной СО-трофии у него отсутствуют. С целью выявления участвующих в аэробном процессе белков был проведен сравнительный протеомный анализ белков клеток, выращенных на СО в аэробных и анаэробных условиях. Результаты анализа в настоящее время обрабатываются. Толерантность G. thermoglucosidasius к кислороду может оказаться важным фактором для его практического использования при переработке СО-содержащих отходов. Микробные топливные элементы функционируют в горячих источниках и служат для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Получены и проанализированы сообщества микроорганизмов, накапливающиеся на анодах микробных топливных элементов, инкубированных непосредственно в горячих источниках кальдеры Узон. Это позволило выявить ряд новых микроорганизмов, для которых ранее не была известна электрогенная активность. Наиболее интересным выглядит факт накопления на аноде бактерий рода Methylothermus, известных как облигатные аэробы и облигатные метанотрофы. Если удастся подтвердить этот результат в лабораторных условиях с коллекционным штаммом этого рода, это будет первый случай использования микроорганизмами метана при электрогенезе, а также первая демонстрация анаэробного окисления метана, сопряженного с переносом электронов на внешний акцептор и осуществляемого чистой культурой прокариот. При инкубации осадков загрязненной почвы с Рязанского нефтеперерабатывающего завода в микробных топливных элементах было получено электричество, причем на анодах накапливались микроорганизмы рода Delftia; при этом происходило потребление углеводородов. Таким образом, электрогенные микроорганизмы, присутствующие в почве, эффективно разлагают углеводороды, используя анод в качестве окислителя, то есть в анаэробных условиях. Впервые на примере термофильной гидрогеногенной бактерии Thermincola ferriacetica было продемонстрировано образование электричества (ток 180 мкА) в микробном топливном элементе с СО как субстратом. Выделены новые микроорганизмы, образующие энергоносители или влияющие на геохимическую обстановку в районах залегания углеводородов. Выделено 9 штаммов микроорганизмов целевых метаболических групп. Новые изоляты представляют три новых рода, один новый вид, или относятся к известным таксонам, но отличаются от представителей типовых видов важными фенотипическими свойствами. Выделенные из образцов вечномерзлого грунта Ямала штаммы Clostridium beijerinkii, образующие водород, являются психроактивными и растут при температуре 15оС. Гипертермофильная архея Thermofilum adornatum 1505 является первым представителем Crenarchaeota, способным к гидрогеногенному росту на СО, однако, в отличие от всех остальных микроорганизмов этой группы, развивается лишь при концентрации СО, не превышающей 30%. Штамм, идентифицированный как Thermus scotoductus, продемонстрировал способность к анаэробному росту в присутствии минерала восстановленного железа сидерита, вызывая его окисление. Анализ геномов новых микроорганизмов, участвующих в продукции энергоносителей, позволил расшифровать задействованные механизмы. Значительная часть работы в этом году была посвящена исследованию полных геномов наших изолятов. Анализ полного генома Thermofilum adornatum 1505 показал уникальную организацию геномного кластера, включающего СО-дегидрогеназу и конвертирующую энергию гидрогеназу. Анализ генома нового штамма археи, относящегося к роду Thermoplasma, показал, что он представляет новый вид Thermoplasma kamchatkensis. В геноме выявлены ключевые гены пути биосинтеза терпенов, а также архейных липидов, являющихся предшественниками алканов. Исследован полные геномы двух штаммов термофильных кабоксидотрофов, относящихся к виду Carboxydocella thermautotrophica. Установлено, что этот организм имеет максимальное из известных (6) число генов, кодирующих Ni,Fe-содержащую СО-дегидрогеназу, а также 30 многогемовых цитохромов С, однако сопрягать рост на СО с восстановлением железа может лишь один из штаммов, что связано, по-видимому, с имеющимся у него дополнительным 17-гемовым цитохромом, отсутствующим у другого (типового) штамма. У термофильной железовосстанавливающей бактерии Carboxydothermus ferriredcens исследован аппарат взаимодействия клеток с нерастворимым акцептором электронов - оксидом железа и выделен участвующий в этом процессе мультигемовый цитохром QmhA. Таким образом, все поставленные задачи второго года работы выполнены. Получен ряд приоритетных данных, а также создан значительный задел на будущее

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект посвящен поиску и характеристике микроорганизмов и микробиологических процессов, связанных с образованием энергоносителей – богатых энергией продуктов метаболизма, которые могут быть в дальнейшем использованы в хозяйственной деятельности. Изначально проект включал в себя шесть разноплановых задач (три фундаментальные и три прикладные), в соответствии с которыми работа продолжалась и в 2019 году. Это: - исследование анаэробных местообитаний с целью поиска новых микроорганизмов-продуцентов энергоносителей, а также микроорганизмов, влияющих на геохимическую обстановку в местах залегания углеводородного сырья; - исследование процесса современного образования углеводородов микроорганизмами/из микроорганизмов; - изучение взаимодействия микроорганизмов с минералами как источниками энергии или окислителями; - разработка подходов к получению энергоносителей из органических отходов; - использование микроорганизмов для получения водорода или этанола из синтез-газа; - получение микробного электричества. В 2019 году были получены следующие результаты. (1) Было продолжено исследование микробных сообществ грязевых вулканов Таманского полуострова и о. Сахалин, экспедиции к которым состоялись в 2018 году. Выделено 22 чистые культуры бактерий, из которых более половины представляют собой новые таксоны различного уровня. Выделены в чистую культуру и полностью охарактеризованы представители двух новых родов Pelomicrobium methylotrophicum gen. nov., sp. nov. и ‘Calorimonas adulescens’ gen. nov., sp. nov. и двух новых видов Sulfurimonas crateris sp. nov. и ‘Alkalibaculum sporogenes’ sp. nov. Все новые изоляты являются анаэробнами с различными типами метаболизма, участвующими в циклах углерода, серы и азота. P. methylotrophicum и ‘C. adulescens’ – термофилы, что позволяет предположить их глубинное происхождение. Секвенированы и проанализированы полные геномы P. methylotrophicum и S. crateris, что позволило реконструировать их метаболизм. Ранее (2018 год) из пробы Нефтяной площадки (кальдера Узон) была выделена автотрофная сульфатредуцирующая бактерия Thermodesulfobium acidiphilum. Анализ ее полного генома показал, что эта автотрофная бактерия, представляющая глубокую филогенетическую линию уровня филума, реализует новый, не известный ранее вариант цикла Кальвина, для которого характерны участие рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Рубиско) формы III и трансальдолазы (Frolov et al., 2019). Полученные данные были подтверждены экспериментально. На средах с 2-метоксибензоатом и лигнином из образцов осадков грязевых вулканов Тамани удалось получить накопительные культуры представителей Bathyarchaeota – широко распространенного архейного филума с разнообразным метаболизмом, для которого, однако до сих пор не было известно культивируемых представителей. Параллельно с увеличением численности Bathyarchaeota, в газовой фазе возрастает концентрация метана (до 18%). Анализ накопительный культуры показал, что на Bathyarchaeota приходится 35% всей популяции. Инкубирование образцов из грязевых вулканов Тамани с метаном и ферригидритом позволило получить значительное увеличение содержания архей группы ANME-2a-2b, анаэробно окисляющих метан. Их относительная численность через 12 месяцев культивирования составила 14,5% (увеличение в 17 раз по сравнению с контролем без ферригидрита). Таким образом, можно предположить, что метанотрофные анаэробные археи группы ANME-2a-2b, восстанавливают соединения трёхвалентного железа. О способности этой широко распространенной группы архей использовать минералы железа в качестве акцептора электронов при окислении метана ранее не сообщалось. Из полученного ранее метагенома грязевого вулкана Таманского полуострова были собраны и проанализированы два генома, принадлежащие некультивируемым метанотрофным археям групп ANME-2 и ANME-3. И в том, и в другом геноме обнаружены все необходимые генетические детерминанты для осуществления "обратного метаногенеза", но также и полный комплекс генов гидрогенотрофного метаногенеза. Кроме того, в обоих геномах есть ряд генов биосинтеза цитохромов С типа, в том числе, мультигемовых. Такая конфигурация генетических детерминант позволяет нам предположить осуществление этими микроорганизмами Fe(III)-зависимой анаэробной метанотрофии или окисления метана в синтрофии с сульфатредуцирующим или иным партнером по механизму прямого переноса электрона. (2) В кальдере Узон (Камчатка) ранее были обнаружены углеводороды, признанные самой молодой нефтью в мире, возрастом 50-100 лет. Отобранные в экспедиции 2018 г. в кальдере Узон образцы цианобактериальных матов и биомассы фотоавтотрофных и хемолитоавтотрофных бактерий были подвергнуты термолизу в специально сконструированном сапфировом реакторе, позволяющем визуализировать превращение биомассы в нефтеподобное вещество при высоких давлениях и температурах (сотрудничество с проф. А.Ю. Бычковым, Геологический ф-т МГУ им. Ломоносова). Хроматомасспектрометрический анализ продуктов термолиза биомассы из различных горячих источников кальдеры Узон показал, что там присутствует полный спектр углеводородов, характерный для «незрелой нефти» морского происхождения. По составу к «молодой» нефти Узона наиболее близки оказались продукты термальной переработки биомассы источников Змеиный и Бурлящий. Анализ генов 16S рРНК в микробных сообществ этих источников с помощью высокопроизводительного секвенирования показал, что в них доминируют, соответственно, цианобактерии и литоавтотрофные бактерии. (3) В предыдущий год выполнения проекта нами был открыт новый катаболический процесс, свойственный алкалофильным микроорганизмам рода Geoalkalibacter: анаэробное окисление минералов двухвалентного железа, сопряженное с образованием ацетата из углекислоты. В этом году мы исследовали возможность аналогичного процесса у термофильных микроорганизмов. Устойчивое преобразование минерала сидерита (FeCO3) было зафиксировано методом Мёссбауэровской спектроскопии в случае роста штаммов Thermus scotoductus и Carboxydothermus siderophilus. В геномах типовых штаммов этих видов обнаружены гены мультигемовых цитохромов, являющихся компонентами железоредуктазного или железоокисдазного комплексов. Таким образом, способность к анаэробному окислению минералов, содержащих восстановленное железо, оказалась достаточно широко распространенной, что может свидетельствовать о важной биогеохимической роли этого процесса. (4) Ранее был получен термофильный микробный консорциум, способный образовывать метан из трудноразлагаемых белков - -кератинов (птичьи перья), являющихся серьезной проблемой для птицеводства. Филогенетический анализ консорциума показал, что он состоит в основном из трех представителей семейства Thermoanaerobacteraceae: Caldanaerobacter, Thermoanaerobacter и Thermovenabulum, способных сбраживать белковые субстраты. Доля метаногенного компонента Methanothermobacter 3734 не превышала 1%. При этом, такого количества метаногенов оказалось достаточно для эффективного образования метана – 6.55 моль на кг внесенной перьевой муки. После окончания ферментации видимый нерастворимый осадок в среде отсутствовал. Таким образом, удалось продемонстрировать эффективный механизм полной утилизации устойчивых к гидролизу белковых субстратов с образованием высокоэнергизованного продукта – метана. (5) Были оптимизированы условия культивирования в ферментере анаэробной термофильной карбоксидотрофной бактерии. При непрерывном культивировании в ферментере cредняя численность клеток C. thermautotrophica составляла 6,0·107 клеток/мл (Рис. 8). В ходе эксперимента содержание водорода в газовой фазе колебалось от 3 до 10 % (Рис. 9). Пересчет с учетом скорости протока газового субстрата приводит к значениям образования водорода от 1,4 до 4,4 мл/мин, что соответствует образованию от 3,75 до 12 ммоль Н2 в час. Дальнейшая интенсификация процесса возможна при задании более высокой численности клеток в культуре и понижении концентрации СО. Анализ генов 16S рРНК изолята М12, выделенного из грязевого вулкана Тамани, показал, что он является штаммом Acetobacterium carbinolicum (99.8% сходства по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК гене с типовым штаммом вида). Штамм A. carbinolicum М12 рос в строго анаэробных условиях при температуре от 15 до 32°С, оптимум 20°С, в широком диапазоне рН среды от 5.0 до 11.0 и оптимумом 8.0-9.0. Штамм М12 рос на смеси Н2 и СО2, смеси СО и Н2, а также на дрожжевом экстракте, пирувате, глюкозе и фруктозе. Роста на 100% СО не было. Максимальная продукция этанола была получена при соотношении СО:H2 как 1:1 в среде с 20 мг/л дрожжевого экстракта, pH 8.5, и составляла 17.8 мМ этанола. (6) При инкубации образцов почвы, загрязненной нефтешламами, в анаэробных условиях с анодом в качестве окислителя хроматографически было зафиксировано снижение содержания углеводородов C14-С16 в гексановой фракции обрастаний анода. В частности, убыль гексадекана после 2-х месяцев работы МТЭЛ составила 48-60% по сравнению с его содержанием в исходном образце и в контрольной системе с разомкнутой электрической цепью. Филогенетический анализ электрогенного микробного сообщества, сформировавшегося в МТЭЛ, показал присутствие ряда органотрофных микроорганизмов, некоторые из которых известны своей способностью восстанавливать нерастворимые акцепторы электронов. Таким образом, в 2019 году, используя осадочные МТЭЛ, мы смогли получить органотрофное электрогенное микробное сообщество, окисляющее сложные органические молекулы, в том числе, некоторые длинноцепочечные алканы. Впервые показан электрогенный рост чистой культуры анаэробной автотрофной СО-окисляющей бактерии. Также установлено, что такой организм (Thermincola ferrriacetica) в карбоксидотрофных условиях осуществляет непрямой перенос электронов на анод, который значительно стимулируется в присутствии растворимых переносчиков электронов, таких как антрахинондисульфонат (АХДС, химический аналог гуминовых кислот). Плотность тока при использовании АХДС в качестве медиатора и СО в качестве единственного донора электронов и источника углерода электрогенеза возрастала с 36 до 140 мА на м2 анода.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В прошедший (последний) год проекта работа проводилась в соответствии с поставленными в первоначальном плане задачами. Все поставленные цели были достигнуты, а поставленный план выполнен. Было продолжено изучение разнообразия микроорганизмов анаэробных местообитаний, образующих энергоносители или влияющих на геохимическую обстановку в районах их продукции и/или залегания. Из проб грязевого вулкана Гнилая Гора (Таманский полуостров, Краснодарский край, Россия) был выделен новый вид Pseudodesulfovibrio alkaliphilus - сульфатредуцирующая бактерия, оказавшася первым автотрофным и первым алкалофильным представителем этого рода. Другой новый анаэробный изолят, Anaerotalea alkaliphilus gen. nov., sp. nov., также выделенный из проб грязевого вулкана, является алкалофильным бродильщиком, разлагающим разнообразные органические вещества с образованием водорода, этанола и СО2. Геномы новых изолятов были секвенированы и проанализированы; выявлены гены, кодирующие основные метаболические пути, в частности, анализ генома A. alkaliphilus выявил гены, обуславливающие образование высокоэнергизованных продуктов брожения. Ассимиляция СО2 P. alkaliphilus предположительно происходит за счет недавно открытого механизма - обращенного цикла трикарбоновых кислот. Было продолжено лабораторное культивирование новых архей, ранее считавшихся некультивируемыми. Впервые удалось получить устойчивые лабораторные культуры представителей филума Bathyarchaeota – широко распространенной группы архей, по данным метагеномного анализа отличающейся разнообразнейшим метаболизмом, включая метаногенез. Имеющиеся в наших руках культуры анаэробно растут на 2-метокисбензоате и 3,4-дигидроксибензоате; относительная численность Bathyarchaeota, относящихся к подгруппам 6 и 8, достигает 28 и 91%, соответственно. Рост этих культур в лабораторных условиях возможен только при добавлении в среду стерильного осадка из грязевых вулканов, содержащего, по видимости, неидентифицированные факторы роста. Метагеномный анализ накопительной культуры, полученной ранее из Дагинских горячих источников (о-в Сахалин) и развивающейся на среде с 3,4-диметоксибензоатом при 50оС, показал присутствие в них Bathyarchaeota подгруппы 26. Из метагенома было собрано 6 геномов Bathyarchaeota, причем полнота сборки превышала 94%. Установлено, что в геномах присутствуют отдельные известные гены метаногенеза. Из того же метагенома были собраны геномы представителей таких таксонов и филогенетических кластеров как Methanosuratus (phylum Crenarchaeota; class Methanomethylicia, ранее обозначался как candidate phylum Verstraetearchaeota), DHVEG-1 (Thermoplasmatota), Lokiarchaeia, а также классических метаногенов - Methanothrix и Methanolinea и некультивируемых представителей порядка Methanomassiliicoccales. Также было продолжено лабораторное культивирование анаэробных метанотрофных архей группы ANME 2a-2b с различными формами трёхвалентного железа (Fe(III)) в качестве акцептора электронов. По сравнению с исходным природным образцом численность ANME-2a-2b в накопительных культурах увеличилась примерно на два порядка. При этом предпочтительными оказались нерастворимые формы Fe(III). Для определения возможности прижизненного синтеза углеводородов термофильнами микроорганизмами, обитающими в кальдере Узон – месте образования наиболее молодой нефти на Земле – было проведено метагеномное секвенирование ДНК, выделенной их микробного мата источника Бурлящий. Из метагеномов было собрано 28 геномов (MAGs metagenome-assembled genomes), которые были исследованы на присутствие в их составе генов двух основных путей биосинтеза углеводородов: мевалонового и немевалонового (MER/DOXP). В результате выполненной работы были идентифицированы возможные продуценты углеводородов, ранее обнаруженных в воде источника Бурлящий– гипертермофильные археи и бактерии, имеющие наборы генов, характерные для известных путей биосинтеза углеводородов или их предшественников. Была подтверждена впервые установленная ранее участниками нашего коллектива способность прокариот к анаэробному окислению закисного железа, сопряженному с образованием ацетата из углекислоты. Из проб содового озера было получено двухкомпонентное микробное сообщество, существующее за счет использования энергии света, оксиления закисного железа сидерита (FeCO3) и образующегося при этом ацетата. Установлено, что в процессе развития культуры происходит преобразование железосодержащих минералов разных классов, а также искусственно составленной смеси минералов, соответствующей усредненному составу земной коры. Была создана лабораторная модель получения метана из перьев птиц – наиболее трудноразлагаемых сельскохозяйственных отходов. Процесс проводили в биореакторе с рабочим объемом 2.4 литра, при температуре 60оС, с участием 3-компонентного консорциума, включающего протеолитика (Thermoanaerobacter sp. 1004), гидрогенотрофного метаногена (Methanothermobacter sp. 3734) и сульфатредуктора (Thermodesulfovibrio sp. 3408-1), который потреблял часть кислот, образующихся при сбраживании аминокислот, передавая электроны метаногену. В результате удалось значительно увеличить экономичность и продуктивность процесса в отношении как разлагаемого субстрата, так и образуемого метана. С целью увеличения выхода водорода, образующегося при анаэробном окислении СО, была осуществлена адаптивная инженерия выделенной нами термофильной Carboxydocella thermautotrophica 019. C. thermautotrophica 019 пересевалась в условиях, благоприятствующих отбору вариантов, обладающих повышенной скоростью автотрофного роста за счет реакции СО + Н2О = СО2 + Н2. В результате 725 клеточных генераций был получен производный штамм 019_F2, который при росте в атмосфере 100% СО характеризовался, в сравнении с исходным штаммом, повышенными в 2 – 2.5 раза скоростью роста и продуктивностью по водороду в расчете на единицу объема среды в единицу времени. В результате сравнительного анализа генома штамма 019_F2 и генома исходного штамма 019 было обнаружено 28 точечных (однонуклеотидных) различий, что соответствует фиксации одной мутации на 26 генераций. Предположительно увеличение скорости роста, урожая клеток и выхода водорода у штамма 019-F2 связано с мутацией гена CFE_RS08350, кодирующего анаэробную СО-дигдрогеназу и обуславливающей возможность прямого использования СО в пути автотрофной фиксации С1 единиц, минуя энергозатратное восстановление СО2 в СО. Достигнуты успехи в исследовании электрогенных микробных систем. С помощью термофильной целлюлозолитической бактерии Melioribacter roseus, способной к гидролизу целлюлозы и одновременно к восстановлению оксида железа, то есть к переносу электронов на нерастворимый акцептор, нам удалось получить устойчивую генерацию тока, сопряженную с использованием целлюлозосодержащего субстрата. Для автотрофного карбоксидотрофа T. ferriacetica с помощью ингибирования гидрогеногенеза избыточным H2 при CO-трофном росте на аноде подтверждена конкуренция между двумя энергодающими процессами – использованием анода и воды в качестве акцепторов электронов при окислении монооксида углерода. Для железовосстанавливающей бактерии Carboxydothermus ferrireducens наибольшая электрокаталитическая активность была зафиксирована при гетеротрофном росте на глицерине. Таким образом, нам удалось показать возможность получения электрического тока из субстратов, представляющих сельскохозяйственные и промышленные отходы – целлюлозы, СО и глицерина, который в больших количествах образуется при производстве биодизеля. Была создана биоэлектрохимическая система с культурой одного и того же штамма Geoalkalibacter ferrihydriticus, способного как к электрогенезу (использованию анода в качестве акцептора электронов), так и к электротрофии (использованию катода в качестве донора электронов при автотрофном росте). Зафиксировано образование электрогенной и электротрофной биоплёнок на аноде и катоде, соответственно. Причём, катодная автотрофная биоплёнка являлась продуцентом основного субстрата анодной биоплёнки (ацетата), замыкая таким образом цикл углерода в рамках одной БЭС. Устойчивой продукции тока в этом эксперименте получить не удалось, но он продемонстрировал возможность существования в природе экосистем, состоящих из единичных видов, которые способны замыкать циклы обмена углеродом и энергией с использованием процессов внеклеточного переноса электронов (например, через минералы железа), восстановленных эквивалентов и источников углерода (в форме ацетата). Создана лабораторная модель МТЭЛ для эффективного получения электричества из углеводородов при низких температурах в условиях загрязнённых океанических осадков. Модельный МТЭЛ продемонстрировал устойчивую генерацию электрического тока до максимальной плотности 3 мА/м2 анода, соответствующей максимальной плотности мощности 2 мВт/м2. На аноде при этом сформировалось психрофильное электрогенное микробнок сообщество с преобладанием углеводородокисляющих бактерий родов Thalassolituus, Pseudoalteromonas, Marinobacter. Хроматографический анализ показал практически полную деградацию дизельного топлива в осадке за время работы модельной МТЭЛ. Таким образом, в 4-й год выполнения проекта нам удалось добиться нескольких важных результатов. Были выделены новые анаэробные бактерии, в частности, представитель нового рода и вида Anaerotalea alkaliphilus, образующая этанол в качестве основного продукта брожения глюкозы. Получены устойчивые лабораторные культуры микроорганизмов, считающихся некультивируемыми – архей филума Bathyarchaeota и ANME 2a-2b – микробных консорциумов, анаэробно окисляющих метан за счет окисления закисного железа. Анализ геномов, собранных из метагенома источника Бурлящий в кальдере Узон, Камчатка, показал, что обитающие там микроорганизмы обладают необходимыми генами для прижизненного синтеза углеводородов, так называемой «молодой нефти» Узона. Создана модельная установка получения метана из птичьих перьев – трудноразлагаемых отходов птицеводства. С помощью адаптивной инженерии удалось существенно ускорить рост и увеличить выход водорода анаэробной СО-окисляющей бактерии Carboxydocella thermautotrophica. Сравнительный анализ геномов нового и исходного штаммов C. thermautotrophica позволил выявить мутацию, приведшую к ускорению роста, увеличению урожая клеток и выхода водорода, и объяснить механизм этого явления. Получена двухкомпонентная культура алкалофильных бактерий, развивающаяся за счет энергии света и двухвалентного железа. Получены лабораторные системы, позволяющие получать микробное электричество из различных видов отходов – целлюлозы, СО, глицерина. Также создана установка для получения электричества из углеводородных загрязнений за счет деятельности психрофильного электрогенного микробного консорциума.