Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В течение первого года выполнен полный объем подготовительных работ, подробно проанализированы теоретические и практические аспекты ранее опубликованных исследований по изучаемой проблеме, отработана и внедрена технология непрерывного получения микропроб внутритканевой жидкости трансплантата и их анализа, получены количественные и качественные характеристики протекающих в пересаженной печени метаболических реакций, изучено их соответствие динамике стандартных лабораторных показателей в периферической крови реципиента печени. Ниже приведены краткие описания клинических наблюдений, демонстрирующие два варианта течения послеоперационного периода: 1) нормальная начальная функция трансплантата и 2) ранняя дисфункция трансплантата, осложнившаяся тромбозом печеночной артерии и приведшая к летальному исходу. Наблюдение 1. Пациент К., 51 года с диагнозом "Цирроз печени в исходе вирусного гепатита C, класс B по Child-Pugh, MELD 13 баллов" получил трансплантат целой печени от донора со смертью мозга Т. 39 лет. Время холодовой ишемии трансплантата составило 8 часов 7 минут, время тепловой ишемии - 48 минут. Операция выполнена по стандартной методике без интраоперационных особенностей и осложнений. Сбор микродиализных проб начат интраоперационно, через 3,5 часа после артериальной реперфузии. В течение 7 послеоперационных суток (168 часов) получено и проанализировано 48 микродиализных проб. Межклеточная жидкость собиралась непрерывно, медиана времени между сбором проб составила 3 часа. - Концентрация внутритканевой глюкозы за время наблюдения находилась в пределах 4,7 - 16,8 ммоль/л и всегда была не ниже концентрации глюкозы в периферической крови (4,7 - 14,9 ммоль/л). - Концентрация внутритканевого лактата лежала в пределах 1,3 - 4,4 ммоль/л и всегда была не ниже концентрации лактата в периферической крови (0,7 - 3,9 ммоль/л). Через 24 часа после операции и далее концентрация лактата в трансплантате не превышала 2,8 ммоль/л, в периферической крови - 1,2 ммоль/л - Концентрация внутритканевого пирувата оставалась стабильной в течение периода исследования (100 - 200 мкмоль/л) - Отношение лактат:пируват и лактат:глюкоза были максимальными в течение первых 6 часов после операции - 38,4 и 0,907, далее быстро снижались и не превышали значений 20,2 и 0,550, соответственно. Стандартные лабораторные критерии оценки функции трансплантата по уровню аспартат- и аланинаминотрансферазы (АСТ и АЛТ), билирубина и международного нормализованного отношения (МНО) по общепринятому определению K. Olthoff et al. (2010) показали отсутствие ранней дисфункции трансплантата: максимальные значения АСТ и АЛТ в промежутке от 24 часов после трансплантации до 7-го послеоперационного дня составили 889 и 362 Ед/л, общий билирубин на 7-е сутки - 21,8 мкмоль/л, МНО на 7-е сутки - 1,08. Дальнейшее течение послеоперационного периода гладкое, пациент выписан под амбулаторное наблюдение через 2 недели после операции. Наблюдение 2. Пациент И., 45 лет с диагнозом "Цирроз печени в исходе первичного склерозирующего холангита, класс A по Child-Pugh, MELD 16 баллов" получил трансплантат целой печени от донора со смертью мозга Н., 43 лет. Время холодовой ишемии составило 8 часов 0 минут, время тепловой ишемии - 45 минут. Операция выполнена по стандартной методике без интраоперационых особеностей и осложнений. Сбор микродиализных проб начат интраоперационно через 4,5 часа после артериальной реперфузии. В течение 5 послеоперационных суток (120 часов) получено и проанализировано 38 микродиализных проб.Межклеточная жидкость собиралась непрерывно, медиана времени между сбором проб составила 2 часа. В течение 24 часов после операции динамика концентраций исследуемых веществ как в межклеточной жидкости, так и в периферической крови соответствовала нормальному течению послеоперационного периода. При этом абсолютные концентрации глюкозы, лактата и пирувата были в 1,5-2 раза выше, чем в Наблюдении №1, что предположительно могло говорить о выраженном ишемическом-реперфузионном повреждении трансплантата. Уровень АСТ и АЛТ через 24 часа после операции составил 6461 Ед/л и 2674 Ед/л, что в соответствии с критериями K. Olthoff, позволило установить диагноз ранней дисфункции трансплантата. Обращало на себя внимание медленное снижение концентрации лактата в ткани трансплантата и его стабилизация к исходу первых суток на значениях 5,0 - 5,5 ммоль/л, при этом концентрация лактата в периферической крови за это время снизилась с 9,8 до 2,0 ммоль/л. В течение последующих 12 часов значимой динамики внутритканевых концентраций глюкозы и ее метаболитов не наблюдалось. При ультразвуковом исследовании через 36 часов после операции отмечено отсутствие кровотока по печеночной артерии, предположен ее тромбоз. Диагноз был подтвержден при компьютерной томографии (38 часов после операции) с внутривенным контрастированием и при ангиографии (42 часа после операции). Несмотря на выполненную попытку тромбэкстракции и баллонной ангиопластики печеночной артерии восстановить адекватное артериальное кровоснабжение трансплантата не удалось ввиду распространения тромбоза на дистальное артериальное русло. Пациент поставлен в ургентный лист ожидания повторной трансплантации печени. Дальнейший мониторинг методом микродиализа показал стойкие, близкие к нулевым значениям концентрации глюкозы и пирувата и одновременно высокую (более 25 ммоль/л) концентрацию лактата. Кроме того, показательной является динамика внутритканевой концентрации глицерола (отражает степень повреждения клеточных мембран) - наблюдаемое в первые сутки окончания операции резкое снижение, через 26-28 часов сменилось быстрым ростом сначала до исходных показателей, а потом до значений в 100-150 раз выше минимальных. По-видимому, динамика этого показателя в большей степени отражает интенсивность цитолиза, чем уровень АСТ и АЛТ. Несмотря на ургентный статус пациента в листе ожидания в течение 2 суток приемлемый трансплантат для повторной операции найден не был и на фоне прогрессирующей полиорганной недостаточности на 5 послеоперационный день наступил летальный исход. Анализ представленных клинических случаев позволил выделить ряд важных закономерностей, которые будут уточнены по мере набора новых случаев в течение второго года: (А) При неосложненном течении послеоперационного периода и хорошей начальной функции трансплантата (Наблюдение 1): В периферической крови: 1) Умеренная гипергликемия (10 - 15 ммоль/л) в течение первых 24 - 48 часов после трансплантации. 2) Последовательное снижение концентрации лактата и его нормализация (уровень не более 1,5 ммоль/л) в течение 24 часов после трансплантации. В межклеточной жидкости трансплантата: 3) Концентрация глюкозы в трансплантате больше или равна концентрации глюкозы в периферической крови. 4) Концентрация лактата в трансплантате больше или равна концентрации лактата в периферической крови и снижается в динамике. 5) Нормальный уровень лактата через 24 часа не превышает 3,0 - 3,5 ммоль/л. 6) Снижение отношения лактат:пируват менее 30 в течение первых 12 часов или ранее. 7) Снижение отношения лактат:глюкоза менее 1,0 в течение первых 12 часов или ранее. 8) Соответствие динамики концентрации пирувата динамике концентрации лактата - значения концентраций веществ могут меняться в широком диапазоне, однако форма кривых на графике "концентрация-время" должны повторять друг друга. (B) При ранней дисфункции трансплантата, определяемой по уровню амитрансфераз, билирубина и значению МНО периферической крови (стандартные критерии) наблюдаются следующие закономерности внутритканевого метаболизма глюкозы (Наблюдение 2 - первые 36 часов, до развития тромбоза): 1) Концентрация глюкозы в трансплантате больше или равна концентрации глюкозы в периферической крови 2) Концентрация лактата в трансплантате в 2-3 раза выше, чем в периферической крови 3) Скорость снижения концентрации лактата в трансплантате меньше, чем скорость снижения концентрации лактата в периферической или наблюдается ее стабилизация на уровне выше 3,5-4,0 ммоль/л через 24 часа после операции. 4) Снижение отношения лактат:пируват менее 40 в течение первых 12 часов или ранее 5) Снижение отношения лактат:глюкоза менее 1,5 в течение первых 12 часов или ранее 6) Соответствие диамики концентрации пирувата динамике концентрации лактата - значения концентраций веществ могут меняться в широком диапазоне, однако форма кривых на графике "концентрация-время" должны повторять друг друга. (C) При развитии тромбоза печеночной артерии наблюдаются следующие закономерности изменения внутритканевых концентраций лактата, пирувата и глицерола в трансплантате (Наблюдение 2 после развития тромбоза): 1) Быстрое снижение внутритканевой концентрации глюкозы до значений близких к 0 ммоль/л на фоне нормальной или повышенной ее концентрации в периферической крови. 2) Быстрый рост внутритканевой концентрации лактата до значений, превышающих 8-10 ммоль/л на фоне стабильной (возможно повышенной) концентрации лактата в периферической крови. 3) Быстрое снижение внутритканевой концентрации пирувата. 4) Быстрый рост внутритканевой концентрации глицерола (в 5-10 раз и более по сравнению с минимальным достигнутым значением). 5) Рост отношения лактат:пируват более 100. 6) Рост отношения лактат:глюкоза более 10.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение второго года работы в исследование включено 13 наблюдений: - 6 трансплантаций целой печени посмертного донора, - 2 трансплантации правой доли печени родственного донора, - 3 измерения параметров внутритканевого метаболизма глюкозы во время изъятия холодовой консервации и подготовки донорского органа к трансплантации, - 1 эксперимент по холодовой консервации печени мини-свиньи, - 1 эксперимент по аппаратной нормотермической перфузии печени мини-свиньи. К концу отчетного периода общее количество наблюдений, как и было запланировано, составило 16 случаев. При выполнении проекта были расширены критерии включения наблюдений в исследование, что позволило получить данные об особенностях внутритканевого метаболизма глюкозы не только при трансплантации печени от посмертного донора, но и в других клинических ситуациях, а также получить принципиально новые данные о состоянии донорского органа при разных вариантах его консервации в эксперименте. Были решены следующие технические вопросы: - установка микродиализного катетера в паренхиму правой доли печени, его фиксация и выведение на переднюю брюшную стенку для продленного мониторинга; - организация исследования на донорском этапе и в течение консервации донорского органа; - установка микродиализного катетера и получение адекватных проб внутритканевой жидкости из печени мини-свиньи с учетом ее анатомических особенностей и размеров; - проведение непрерывного мониторинга температуры и отбора микродиализных проб в течение холодовой консервации печени в эксперименте; - проведение исследования особенностей внутритканевого метаболизма глюкозы при аппаратной нормотермической перфузии печени с оксигенацией. Сформулированы новые и уточнены ранее предложенные критерии определения начальной функции трансплантата по данным исследования внутритканевого метаболизма глюкозы на сроках 6 - 48 ч после артериальной реперфузии трансплантата (на материале 11 клинических наблюдений). - Для нормальной функции трансплантата характерно: 1) Уровень глюкозы не ниже 4-5 ммоль/л (с первых часов до конца первых суток и далее); 2) Концентрация лактата не выше 10-12 ммоль/л через 6-9 ч и его снижение до 2 - 3 ммоль в интервале 12 - 24 ч; 3) Концентрация пирувата в интервале 80 - 350 мкмоль/л (с первых часов до конца первых суток и далее); 4) Отношение лактат : пируват не более 100 - 120 через 6 - 9 ч и его снижение до 10 - 20 в интервале 12 - 24 ч; 5) Концентрация глицерола не более 500 мкмоль/л через 6 - 9 ч и ее снижение 10 - 50 мкмоль/л в интервале 12 - 24 ч. - Для ранней обратимой дисфункции трансплантата характерно: 1) Уровень глюкозы не ниже 4-5 ммоль/л (с первых часов до конца первых суток и далее); 2) Концентрация лактата в пределах 18 - 25 ммоль/л через 6 - 9 ч и его снижение до 10 - 15 ммоль/л в интервале 12 - 24 ч, нормализация до уровня 2 - 3 ммоль в сроки до 48 ч; 3) Уровень пирувата в интервале 50 - 200 мкмоль/л через 6 - 9 ч и его рост до 400 - 1200 мкмоль/л в интервале 12 - 24 с последующим снижением до 80 - 350 мкмоль/л в сроки до 48 ч; 4) Отношение лактат:пируват более 100 через 6 - 9 ч с медленным снижением в интервале 12 - 24 ч до значений 25 - 50 и нормализацией на уровне 10 - 15 в сроки до 48 ч; 5) Концентрация глицерола 500 - 1100 мкмоль/л с последующим снижением до 70 - 100 мкмоль/л в интервале 12 - 24 ч и нормализацией на уровне 10 - 50 мкмоль/л в сроки до 48 ч. - Для критического необратимого исходного (первично-нефункционирующий трансплантат) или возникшего в раннем послеоперационном периоде (тромбоз печеночной артерии) повреждения характерно: 1) Уровень глюкозы менее 3 ммоль/л c быстрым снижением до 0 ммоль/л; 2) Исходная или быстро (2 - 4 часа) возросшая концентрация лактата до 25 - 30 ммоль/л и выше; 3) Концентрация пирувата менее 50 мкмоль/л и снижение до значенией близких к 0 мкмоль/л; 4) Отношение лактат:пируват более 10000; 5) Концентрация глицерола 1500 - 2000 мкмоль/л с тенденцией к росту. Полученные данные и сформулированные закономерности не противоречат и подтверждают справедливость предложенных ранее и наиболее часто используемых в клинической практике критериев ранней дисфункции трансплантата (K. Olthoff и соавт., 2010), однако позволяют идентифицировать дисфункцию в течение первых суток после операции, в то время как при использовании стандартных лабораторных тестов для постановки диагноза производится в период с 24 ч до 7 дней после трансплантации. Полученные данные подтвердили правильность исходной гипотезы о целесообразности исследования параметров внутритканевого метаболизма глюкозы для ранней диагностики дисфункции трансплантата. В трех клинических наблюдениях трансплантации печени посмертного донора дополнительно провели определение концентраций глюкозы, лактата, пирувата и глицерола до пересадки донорского органа. В двух случаях после операции наблюдали нормальную функцию трансплантата, в одном - обратимую раннюю дисфункцию. Малое количество случаев не позволяет обоснованно сформулировать какие-либо выводы, однако в случае когда развилась дисфункция, еще на донорском этапе, во время холодовой перфузии наблюдали рост внутритканевой концентрации лактата с 1,5 до 10 ммоль/л. В двух других наблюдениях концентрация лактата в донорском органе от момента лапаротомии у донора до пуска артериального кровотока у реципиента оставалась стабильной и не превышала 5 ммоль/л. Кроме того отличия наблюдали в динамике концентрации пирувата: при нормальной функции трансплантата с момента получения первой пробы во время изъятия до реперфузии отмечали плавное снижение концентрации; в случае когда развилась ранняя дисфункция зарегистрирован подъем концентрации пирувата 30 до 240 мкмоль/л во время перфузии абдоминального комплекса органов консервирующим раствором с последующим снижением до значений близких к 0. Данные наблюдения рассматриваются нами как "задел" для последующих исследований с целью определения особенностей внутритканевого метаболизма в донорском органе до его пересадки пациенту и использования этих данных для прогнозирования результата операции и обоснованного принятия решения о пригодности донорской печени для безопасной трансплантации. Также в рамках формирования научного задела для будущих работ и предварительной проверки гипотезы о возможности применения внутритканевого микродиализа для оценки различных методов консервации донорских органов и их оптимизации выполнено два эксперимента на печени мини-свиньи. В первом случае орган сохраняли стандартным способом в условиях гипотермии в консервирующем растворе Кустодиол в изотермическом контейнере с хладоэлементами. Отмечено, что "остановка" аэробного метаболизма глюкозы наступила не сразу после начала консервации органа, а спустя 3 часа консервации и только после того как температура печени снизилась до значений близких к 0С. В дальнейшем динамика концентраций лактата и пирувата также зависела от текущей температуры органа, что позволяет сделать вывод о том, что температура является одним из ключевых факторов, определяющих характер метаболических реакций в донорском органе. Дальнейшие исследования должны быть направлены на подробное изучение этой взаимосвязи и, возможно, использования ее для "управления" метаболическими реакциями в донорском органе как на этапе эксплантации, так и во время транспортировки и реперфузии. Во втором эксперименте исследовали характеристики внутритканевого метаболизма глюкозы в условиях аппаратной нормотермической перфузии печени. После подбора оптимальных параметров перфузии по показателям объемного кровотока и давления в воротной вене и печеночной артерии отметили рост концентрации пирувата, стабилизация уровня лактата, снижение отношения лактат:пируват, что свидетельствовало о восстановление нормального метаболизма глюкозы в органе и его жизнеспособности (пригодности для пересадки) При снижении концентрации гемоглобина в перфузионном растворе спустя 3 часа работы системы (вероятно из-за гемолиза и/или осаждения эритроцитов в открытой части контура) наблюдали одновременный рост концентрации лактата и пирувата, что свидетельствовало о недостаточном поступлении кислорода в орган. Таким образом, определение внутритканевых параметров метаболизма глюкозы представляется крайне перспективным способом не только для оценки жизнеспособности донорского органа во время перфузионного хранения, но и для разработки новых модификаций перфузионных машин, состава перфузионного раствора и режимов перфузии.