Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Название проекта: «Изучение механизмов асинхронного выброса нейромедиатора в перисоматических синапсах гиппокампа мыши in vitro». Актуальность: В гиппокампе грызунов выраженный асинхронный выброс нейромедиатора характерен для ГАМКергических перисоматических синапсов, сформированных холецистокинин-содержащими (ССК+) интернейронами на телах пирамидных клеток СА1 области гиппокампа и может быть вызван высокочастотной пресинаптической стимуляцией. Было показано, что CCK+ интернейроны участвуют в генерации тета-ритма. Возможно, длительное (100-200 мс) асинхронное высвобождение нейромедиатора играет решающую роль в определении частотного диапазона этих осцилляций и помогает перевести кратковременную высокочастотную пресинаптическую активность в длительное постсинаптическое торможение. Синхронный и асинхронный выброс нейромедиатора широко изучался в течение последних десятилетий, и было показано, что механизмы этих модальностей перекрываются. Обе модальности имеют общие процессы слияния везикул, но могут различаться по типу кальциевого сенсора и по источнику кальция, необходимому для запуска процесса выброса нейромедиатора. Целью данного проекта является выявление источников кальция, которые участвуют в генерации асинхронного выброса нейромедиатора в гиппокампальных перисоматических тормозных синапсах, образованных CCK + интернейронами на телах CA1 пирамидных клеток. Научная и практическая значимость: Асинхронный выброс нейромедиатора интенсивно исследовался на протяжении двух последних десятилетий, однако механизмы вызывающие этот феномен остаются малоизученными. Несмотря на то, что многократно была продемонстрирована зависимость асинхронного выброса нейромедиатора от увеличения внутриклеточной концентрации Са2+, источник длительного входа Са2+ до сих пор не идентифицирован. Таким образом, данные, которые мы получили в ходе выполнения этого проекта, необходимы для лучшего понимания механизмов, определяющих кальциевый гомеостаз в пресинаптических нервных окончаниях. Результаты первого года исследования (2017-2018): В качестве начального этапа выполнения заявленного проекта мы исследовали роль глутаматных NMDA рецепторов, ванилоидных рецепторов первого типа (TRPV-1) и рианодиновых рецепторов в генерации асинхронного выброса нейромедиатора. В ряде исследований было показано, что NMDA рецепторы глутамата могут экспрессироваться на пресинаптических нервных окончаниях ГАМКергических интернейронов. Соответственно, активация этих каналов в состоянии вызывать длительный NMDA-опосредованный вход Са2+ и таким образом запускать асинхронный выброс нейромедиатора. Тем не менее, блокада NMDA каналов селективным антагонистом (D-AP5) не приводила к изменению амплитуды и длительности асинхронного выброса нейромедиатора. В ряде исследований было показано, что ванилоидные рецепторы первого типа (TRPV1) могут обеспечить альтернативный вход Са2+ в пресинаптические терминали. Эти каналы могут быть активированы температурой и/или анандамидом. Второй способ активации может быть более перспективным, поскольку синапсы между ССК+ интернейронами и пирамидными нейронами экспрессируют каннабиноидные рецепторы первого типа (СВ1 рецепторы). Однако, также как и в случае NMDA каналов селективная блокада TRPV1 рецепторов не влияла на параметры асинхронного выброса нейромедиатора, что указывает на отсутствие роли этих рецепторов в генерации изучаемого феномена. Наконец, высокочастотная активация пресинаптических потенциал-чувствительных Са2+ каналов может вызывать Са2+- индуцированный выход кальция из внутриклеточных депо через активацию рианодиновых рецепторов и приводить к выбросу нейромедиатора. В частности данный механизм был описан для нервно-мышечного соединения холоднокровных. Аппликация рианодина в концентрации 100 μM не изменяло амплитуду и длительность асинхронного выброса нейромедиатора в синапсах сформированных ССК+ интернейронами на телах пирамидных клеток. Помимо заявленных на первый год исследований были проведены пилотные эксперименты по выявлению роли Na+/Са2+-обменника в генерации асинхронного выброса нейромедиатора. Полученные данные позволяют заключить, что обратный вход Са2+ через обменник способен как минимум увеличивать амплитуду и длительность асинхронного выброса нейромедиатора в изучаемых синапсах. Однако, для окончательного выявления механизмов данного феномена требуются дополнительные эксперименты. Ссылка на информационный ресурс в сети Интернет, посвященные проекту: https://media.kpfu.ru/news/ucenye-kfu-izucaut-mehanizmy-raboty-struktury-mozga-otvecausei-za-processy-pamati-i-obucenia

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Название проекта: «Изучение механизмов асинхронного выброса нейромедиатора в перисоматических синапсах гиппокампа мыши invitro». Результаты первого года исследования (2018-2019): Асинхронный выброс нейромедиатора интенсивно исследовался на протяжении двух последних десятилетий, однако механизмы вызывающие этот феномен остаются малоизученными. Несмотря на то, что многократно была продемонстрирована зависимость асинхронного выброса нейромедиатора от увеличения внутриклеточной концентрации Са2+, источник длительного входа Са2+ до сих пор не идентифицирован. В настоящее время имеются предположения о том, что в основе асинхронного выброса нейромедиатора могут лежать одна или несколько ниже перечисленных причин: 1) вход кальция в пресинаптическое нервное окончание через Са2+ проницаемые каналы (NMDA рецепторы и/или ванилоидные рецепторы (TRPV-1)); 2) выброс кальция из внутриклеточных депо; 3) замедление выведения Са2+ из пресинаптического нервного окончания. В первый год выполнения данного проекта нами были исследованы первые две причины, которые могли приводить к асинхронному выбросу нейромедиатора. Однако роль глутаматных NMDA рецепторов, ванилоидных рецепторов первого типа (TRPV-1) и рианодиновых рецепторов в генерации асинхронного выброса нейромедиатора была экспериментально опровергнута. На второй год проекта нами были запланированы эксперименты по выявлению роли замедленного выведения Са2+ из пресинаптического нервного окончания. В большинстве синапсов вывод Са2+ из пресинатического нервного окончания осуществляется за счёт белков плазматической мембраны. Са2+-АТФаза плазматических мембран имеет высокое сродство к ионам кальция, но относительно низкую скорость работы, а Na+/Са2+-обменник, наоборот, имеет низкое сродство, но высокую скорость переноса Са2+ (до 5000 ионов Са2+ в секунду). Поэтому совместная работа этих двух систем дополняет друг друга и доводит внутриклеточную концентрацию Са2+ до физиологичной нормы (сотни наномоль). Вклад входа кальция через обменник будет более выражен при недостаточном функционировании Са2+-АТФазы. В частности, имеются данные показывающие, что экспрессия Са2+-АТФазы может быть снижена в изучаемых нами ССК+ синапсах. Поэтому, в первой серии экспериментов был оценен эффект влияния селективного блокатора Са2+-АТФазы SE (5- (and - 6) – carboxyeosin diacetate, succinimidyl ester) (CEDA SE) (100 µМ) на амплитуду синхронных ответов, а так же на амплитуду и длительность асинхронного выброса нейромедиатора в синапсах сформированных ССК+ интернейронами на телах пирамидных нейронов СА1 области гиппокампа мыши. При добавлении в перфузируемый раствор CEDA SE мы наблюдали отсутствие эффекта вещества на амплитуду и динамику ГАМК-опосредованных токов. Для того чтобы убедиться в достоверности отсутствия эффекта вещества на выброс нейромедиатора в ССК+ синапсах, мы исследовали эффект CEDA SE на выброс нейромедиатора из синапсов, сформированных коллатералями Шаффера на дендритах пирамидных клеток СА1. Экспрессия Са2+-АТФазы в данных терминалях была показана иммуногистологическими и фармакологическими методами. В данном случае мы наблюдали достоверное увеличение амплитуды глутамат-опосредованных токов на 60% от контрольного значения. Известно, что в некоторых случаях, например, при высоких концентрациях ионов Na+, Na+/Са2+-обменник может выполнять противоположную работу, транспортируя Са2+ в клетку, а Na+ из клетки. Таким образом, после пачки потенциалов действия, которая значительно увеличивает концентрацию Na+ в пресинаптическом нервном окончании Na+/Са2+-обменник может значительно замедлять свою работу, а в определенных состояниях реверсировать и закачивать кальций в терминаль, тем самым вызывая асинхронный выброс нейромедиатора. В отдельных экспериментах были оценены эффекты блокады входа Са2+ через Na+/Са2+-обменник на амплитуду и длительность асинхронного выброса нейромедиатора. Аппликация блокатора Na+/Са2+-обменника KB-R7943 (20 µМ) существенно подавляла амплитуду и длительность асинхронного выброса нейромедиатора. Тем не менее оставался открытым вопрос: способен ли Са2+ входящий через обменник при повышенных концентрациях внутритерминального Na+ вызвать синаптический выброс нейромедиатора. Первичная проверка данной гипотезы состоялась в экспериментах, где вход Са2+ через потенциал-зависимые Са2+-каналы блокировался или существенно снижался активацией ГАМКБ рецепторов, экспрессированных на ССК+ терминалях. Действительно, аппликация ангониста ГАМКБ рецепторов Баклофена (30 µМ), приводило практически к полной блокаде фазовой компоненты выброса нейромедиатора. Однако, длительные высокочастотные пачки потенциалов действия, по-прежнему, вызывали асинхронное высвобождение нейромедиатора, которое эффективно подавлялось последующей аппликацией KB-R7943. В случае с фазовым синхронным выбросом нейромедиатора хорошо установлено, что основным источником входа Са2+ в изучаемом синапсе являются потенциал-зависимые Са2+-каналы N-типа. Поэтому в отдельной серии экспериментов синаптическая передача блокировалась селективным блокатором потенциал-чувствительных Са2+-каналов N-типа (ω-сonotoxin MVIIA) (250 nМ). Подобно экспериментам с активацией ГАМКБ, блокада Са2+-каналов полностью подавляла фазовый выброс нейромедиатора, а асинхронный выброс, вызванный высокочастотной стимуляцией подавлялся в присутствии KB-R7943. Таким образом, во второй год реализации проекта были проделаны все запланированные эксперименты, а так же дополнительные эксперименты, которые дали полную картину изучаемого феномена. Полученные данные свидетельствуют о том, что Са2+-АТФаза не принимает участия в регуляции базового уровня кальция в тормозном синапсе между ССК-интернейроном и пирамидным нейроном, тем самым, не может вносить существенный вклад в инициацию асинхронного выброса нейромедиатор, тогда как Na+/Са2+-обменник вовлечён в генерацию повышенного концентрации необходимого для асинхронного выброса нейромедиатора.