Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Антибиотики цефалоспоринового ряда широко используются в медицинской практике, поскольку они воздействуют на широкий спектр бактерий и легко проникают в ткани. Однако, существует множество сообщений о том, что цефалоспорины могут вызывать эпилептические судороги у пациентов. Считается, что это является результатом блокирования ГАМКа-рецептор-опосредованной синаптической передачи. В то же время, до настоящей работы отсутствовали электрофизиологические исследования влияния цефалоспоринов на тормозную синаптическую передачу в головном мозге. В ходе выполнения работы по гранту было произведено исследование ингибирующего влияния двух антибиотиков цефалоспоринового ряда (цефепима и цефтриаксона) на ГАМКа-рецептор-опосредованную синаптическую передачу, выявлены их эффективные концентрации, оценено влияние на кинетику инактивации вызванного ГАМК-опосредованного ответа, охарактеризована их способность приводить к развитию эпилептоподобного состояния в условиях in vitro. Исследование влияния цефалоспоринов на тормозную синаптическую передачу проводилось на переживающих срезах головного мозга крыс Wistar, содержащих энторинальную кору и гиппокамп. Регистрация синаптических токов производилась методом пэтч-кламп в конфигурации «целая клетка» в режиме фиксации напряжения. Вызванные ответы индуцировались с помощью электрической стимуляции среза посредством внеклеточного электрода. ГАМКа-рецептор-опосредованные постсинаптические ответы регистрировались в присутствии цефалоспоринов в нескольких концентрациях. Продемонстрировано, что оба антибиотика являются слабыми блокаторами ГАМК-опосредованной синаптической передачи: IC50 цефепима и цефтриаксона составили 1.65 мМ и 2 мМ соответственно. Полученные данные указывают на то, что непосредственная блокада ГАМКа-рецепторов не является основной причиной проэпилептического действия цефалоспоринов, поскольку данные концентрации почти на два порядка выше регистрируемых в спиномозговой жидкости пациентов при терапии этими антибиотиками. Известно, что почечная недостаточность у пациентов является основным фактором, способствующим развитию судорог при приеме цефалоспоринов. Зачастую это состояние сопровождается дисбалансом ионных концентраций в организме. Нами было показано, что применение цефтриаксона или цефепима в концентрации 4 мМ в сочетании с повышенным содержанием ионов калия и пониженным содержанием ионов магния в перфузирующем растворе может приводить к развитию эпилептоподобного состояния в переживающем срезе мозга крысы, содержащего энторинальную кору и гиппокамп: наблюдаются как интериктальные, так и иктальные разряды. В отсутствие цефалоспоринов перфузирующий раствор такого состава вызывает лишь редкие ГАМКа-рецептор-опосредованные синхронизованные разряды. Таким образом, было продемонстрировано, что антибиотики вызывают эпилептоподобное состояние в переживающем срезе только при условии повышенной концентрации ионов калия и сниженной концентрации ионов магния во внеклеточной среде. Результаты опубликованы в статье: Amakhin, D. V., E.B. Soboleva, and A. V. Zaitsev. 2018. Cephalosporin antibiotics are weak blockers of GABAa receptor-mediated synaptic transmission in rat brain slices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 499:868–874. doi:10.1016/j.bbrc.2018.04.008. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X1830771X

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В работе исследовано влияние цефалоспоринового антибиотика цефепима на интериктальные разряды в энторинальной коре головного мозга крысы, регистрируемые в модели острого судорожного состояния in vitro. Поскольку данное вещество является слабым конкурентным антагонистом ГАМКа-рецепторов, исследовалось временное течение тормозной синаптической проводимости в ходе ответа и производилось сравнение эффекта цефепима с эффектом классического конкурентного антагониста ГАМКа-рецепторов - бикукуллина. Для этого с помощью оригинальной методики (Amakhin et al., 2016, 2018a; Chizhov and Amakhin, 2018) оценивался относительный вклад трех основных типов ионотропных рецепторов (AMPA-, NMDA- и ГАМКа-типа), участвующих в постсинаптическом ответе пирамидного нейрона во время эпилептоподобного разряда. При применении цефепима или бикукуллина в концентрациях, обеспечивающих 80% блокаду амплитуды вызванного тормозного постсинаптического тока, наблюдаемый эффект этих веществ на эпилептоподобную активность отличался: под действием цефепима на поздних этапах интериктального разряда происходило парадоксальное увеличение проводимости ГАМКа-рецепторов, которое не происходило в результате применения бикукуллина. Поскольку генерация исследованного типа интериктальных разрядов сопряжена с нарушением хлорного гомеостаза в нейронах энторинальной коры (Chizhov et al., 2017, 2019), подобное усиление ГАМК-проводимости на поздних фазах разряда в определенных условиях может усугубить течение судорожного состояния. Для in vivo оценки просудорожного эффекта цефалоспориновых антибиотиков использовались две наиболее распространенные модели острых судорожных состояний – пентилентетразоловая (ПТЗ) и максимального электрошока (МЭШ). Судороги у 6-недельных крыс Вистар вызывали через 2 часа после введения цефтриаксона или цефепима в дозах 200 и 600 мг/кг. В модели МЭШ крысы получали импульс постоянного тока различной интенсивности через ушные электроды. Цефтриаксон не влиял на протекание судорог, в то время как цефепим снижал силу тока, необходимую для развития экстензии задних конечностей после электрошока. Этот результат подтверждает более высокую вероятность возникновения просудорожных побочных эффектов вследствие приема цефепима, чем цефтриаксона, что также согласуется с оценками силы блока ГАМК-опосредованного постсинаптического тока, сделанными нами ранее (Amakhin et al., 2018b). В модели ПТЗ крысы получали внутрибрюшинную инъекцию ГАМКa блокатора пентилентетразола, что приводило к развитию судорог, оцениваемых в течение 30 минут по 4-балльной шкале (Lüttjohann et al., 2009). Цефтриаксон не оказывал выраженного эффекта на течение судорожного состояния, вызванного введением ПТЗ. Цефепим же оказывал выраженный противосудорожный эффект: наблюдалось как снижение смертности крыс, так и снижение силы и длительности судорог. Поскольку в ПТЗ-модели эпилептических судорог наблюдался выраженный противоэпилептический эффект цефепима, была осуществлена проверка возможности окклюзии эффектов этих двух конкурентных антагонистов ГАМКа-рецепторов на постсинаптический ток, вызванный экстраклеточной стимуляцией. Показано, что в присутствии низкой концентрации цефепима, которая сама по себе оказывает слабый эффект на ГАМК-опосредованный синаптический ток, ПТЗ снижал свою эффективность действия: блок медленных компонент ответа посредством ПТЗ ослабевает. Представляется вероятным, что в основе данного феномена и описанного выше усиления ГАМКа-рецептор-опосредованной проводимости в ходе поздних фаз интериктального разряда, может лежать один и тот же молекулярный механизм. В ходе первого года работы над проектом нами было показано, что для эффективной блокады тормозной синаптической передачи в головном мозге крысы необходимы очень высокие концентрации этих веществ, значительно превышающие реально достижимые в ходе терапии этими веществами: для эффективной блокады синаптического ответа нужны миллимолярные концентрации, тогда как предельно-достижимые концентрации цефалоспоринов в спинномозговой жидкости пациентов или подопытных животных составляют десятки микромоль на литр. В связи с этим была предпринята попытка поиска альтернативного механизма проэпилептического действия цефалоспоринов (помимо блокады ГАМКа-рецепторов), для реализации которого нужны гораздо меньшие концентрации антибиотиков. В ходе последующей работы над проектом были получены доказательства наличия данного механизма действия у цефепима. Показано, что в условиях, в которых полностью исключено влияние этого вещества на тормозную синаптическую передачу, цефепим увеличивает частоту эпилептоподобных разрядов в модели судорожной активности in vitro. При этом, для возникновения подобного эффекта, достаточно гораздо меньших концентраций цефепима, чем необходимо для блокады ГАМКа-рецепторов. В связи с этим, есть основания предполагать, что именно этот механизм может быть основным при возникновении побочных эффектов данного препарата в клинике. Предварительные данные указывают на то, что в основе этого эффекта лежит увеличение концентрации экстраклеточного глутамата в энторинальной коре.