Аннотация результатов, полученных в 2017 году
До настоящего времени единственным подходом к устранению мутаций мтДНК в клеточных линиях человека является использование сайт-специфических нуклеаз. В частности, это направляемые в митохондрии клеток человека эндонуклеазы рестрикции, TAL-эффекторные нуклеазы и нуклеазы типа “цинковые пальцы”. Перечисленные подходы базируются на использовании принципа узнавания белковой молекулой специфической нуклеотидной последовательности мтДНК, внесения в нее двухцепочечного разрыва и последующей элиминацией. Технологии, основанные на бактериальных системах CRISPR кажутся более гибкими и перспективными, поскольку используют РНК для узнавания ДНК по принципу Уотсона-Крика. Ограничением повсеместного использования таких систем в отношении мтДНК является их двухкомпонентная природа: технологии CRISPR представлены белковой и РНК структурами. Успешная доставка молекул РНК в митохондрии во многом остается под вопросом, хотя существуют доказательства такого импорта. Для запуска репарации по типу гомологичной рекомбинации дополнительно требуется доставка ДНК матрицы внутрь митохондрий. Использование CRISPR позволяет в более сжатые сроки модифицировать систему для узнавания новой мутации, так как не требует перекодирования белковой части машинерии для редактирования – нуклеаза Cas9 всегда остается одинаковой. За отчетный период нами была создана линия клеток HEK-293T Phoenix, стабильно экспрессирующая нуклеазу SpCas9 с митохондриальной локализацией. Присутствие нуклеазы в митохондриях подтверждено методом иммуноцитохимического анализа и вестерн-блоттинга. Так же была разработана технология доставки дцДНК в митохондрии с помощью рекомбинантного белка MitoTALE. Импорт рекомбинантного белка MitoTALE в митохондрии подтвержден с помощью иммуноцитохимического анализа и вестерн-блоттинга. Специфичное связывание рекомбинантного белка MitoTALE с дцДНК подтверждено методом задержки в геле. Функционирование дцДНК внутри митохондрий показано методом флуоресцентной микроскопии и вестерн-блоттинга. Таким образом, нами была создана база для последующих экспериментов, позволяющих продемонстрировать функциональную активность системы CRISPR в отношении митохондриального генома клеток человека.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Ранее мы предположили, что дцДНК может быть специфично импортирована в митохондрии клеток человека в комплексе с ДНК-связывающим белком через систему митохондриальных пор (TOM/TIM комплекс). Разработанная система mitoTALE, сконструированная на первом этапе проекта, состояла из двух функциональных частей: модифицированного ДНК-связывающего белка на основе TAL-эффектора и нуклеотидной последовательности на 5'-конце доставляемой дцДНК матрицы. Для того, чтобы разработанный комплекс использовать в ходе трансфекции с коммерческими липофильными агентами, была создана другая модификация системы, названная mitoTALE-negGFP. Она включала объединение TAL-эффектора с отрицательно заряженным (супернегативным) зеленым флуоресцентным белком. Подобная модификация, по нашей задумке, позволит доставлять комплекс рекомбинантного белка с дцДНК короткого размера. На данном этапе проверена эффективность и специфичность связывания рекомбинантным белком mitoTALE-negGFP матриц дцДНК. Чтобы детектировать потенциальный сайт расщепления мтДНК системой MitoRGEN/SpCas9, была использована линия клеток с нокаутом гена MGME1, тетрациклин зависимо экспрессирующая нуклеазу SpCas9. Нокаут гена MGME1 в данной клеточной модели обеспечивает подавление процесса деградации мтДНК с двухцепочечным разрывом (то есть линейных молекул мтДНК). Таким образом, у нас появляется возможность детектировать свободные концы линейной мтДНК, используя линкер-опосредованную ПЦР. После активации нуклеазы SpCas9 и трансфекции модифицированной направляющей РНК gRNA-HF-HD удалось детектировать потенциальный сайт расщепления мтДНК. Специфичность полученного после линкер-опосредованной ПЦР продукта была подтверждена капиллярным секвенированием по методу Сенгера. Данный эксперимент является по сути “проверкой принципа” и показывает принципиальную возможность использования модифицированной для функционирования в митохондриях РНК-направляемой эндонуклеазы SpCas9 для редактирования мтДНК.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Чтобы детектировать потенциальный сайт расщепления мтДНК системой mitoRGEN/AsCpf1, была использована линия клеток с нокаутом гена MGME1, тетрациклин зависимо экспрессирующая нуклеазу AsCpf1. Нокаут гена MGME1 в данной клеточной модели обеспечивает подавление процесса деградации мтДНК с двухцепочечным разрывом (то есть линейных молекул мтДНК). После активации нуклеазы AsCpf1 и трансфекции модифицированной направляющей РНК gRNA-HF удалось детектировать потенциальный сайт расщепления мтДНК. Данный эксперимент является по сути “проверкой принципа” и показывает принципиальную возможность использования модифицированной для функционирования в митохондриях РНК-направляемой эндонуклеазы AsCpf1 для редактирования мтДНК. Нами были созданы трансгенные цитоплазматические гибридные линии, изначально полученные от пациентов с синдромом NARP из-за патогенной мутации m.8993T>G. Была показана клеточная локализация нуклеазы mitoSpCas9 в митохондриях клеток NARP. Мы изучили влияние внедрения трансгена и субкультивирования на уровень гетероплазии патогенный мутации, количество копий мтДНК, а также процессы селективной митофагии. Было показано, что гидовая РНК специфично узнает только мутантный гаплотип m.8993G. Начаты эксперименты по сдвигу уровня гетероплазмии m.8993T>G.