КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-75-20102

НазваниеРоль каспазы-2 и ее пост-трансляционных модификаций в регуляции гибели раковых клеток, индуцируемой химиотерапевтическими препаратами

РуководительКопеина Гелина Сергеевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова", г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ07.2017 - 06.2020

КонкурсКонкурс 2017 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словаРак, апоптоз, каспаза, высокомолекулярный комплекс, пост-трансляционная модификация, фосфорилирование, убиквитинилирование.

Код ГРНТИ34.15.51


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на изучение роли пост-трансляционных модификаций (ПТМ) в регуляции функций и активности каспазы-2, инициирующей апоптотическую гибель раковых клеток в ответ на различные индукторы и в первую очередь на ДНК-повреждающие химиотерапевтические препараты. В рамках проекта планируется с помощью протеомного, биоинформатического и биохимических анализов идентифицировать ПТМ каспазы-2 в раковых клетках и оценить их влияние на процесс апоптоза. Изучение механизмов ПГК является одним из наиболее быстро развивающихся областей биомедицинских исследований. В настоящее время ясно, что не только апоптоз, но и другие виды клеточной гибели, например, такие как некроптоз и аутофагия, участвуют в регуляции тканевого гомеостаза, а нарушения их механизмов приводят к развитию многих патологических состояний. Успехи в данной области знаний были отмечены присуждением 2х Нобелевских Премий (2002 и 2016). Установлено, что некоторые неврологические (болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона) и иммунологические (СПИД) заболевания, связаны с избыточной клеточной гибелью, а такое заболевание как рак - с ее недостатком. Известно также, что нарушение функционирования механизмов гибели клеток связано с устойчивостью патологических клеток к терапии. Хотя многие молекулярные механизмы определенных видов клеточной гибели известны, их контроль за счет пост-трансляционных модификаций, как фундаментального механизма регуляции активности жизненно-важных молекулярных путей, остается слабо изученным. Кроме того, разработка ингибиторов тирозинкиназ, осуществляющих пост-трансляционное фосфорилирование белков, ответственных за рост, деление и устойчивость раковых клеток к апоптозу, как противораковых препаратов, началась более 20 лет назад, однако остается открытым вопрос о точных молекулярных механизмах влияния этих препаратов на процессы клеточной гибели. Поиск новых путей контроля и регулирования гибели клеток за счет механизмов ПТМ каспаз – необходимый этап разработки нового класса лекарств, способных как стимулировать апотоз при лечении рака, так и ингибировать его для лечения нейро-дегенеративных заболеваний. ПТМ играют существенную роль при активации и в регуляции активности каспаз, контролируя не только их про-, но и неапоптотические функции. Проведенное нами исследование (Zamaraev et al., 2017) показало, что в качестве основных ПТМ каспаз можно выделить фосфорилирование остатков серина, треонина или тирозина и присоединение убиквитина и его цепей к остаткам лизина – моно- и полиубиквитинилирование. Убиквитинилировние может способствовать как активации каспаз, так и опосредовать их деградацию в зависимости от типа модификации. Фосфорилирование же в большинстве случаев приводит к блокированию активации или ферментативной активности каспаз. Например, при митозе киназа Cdk1-CyclinB1 ингибирует активность инициаторных каспаз-8 и -9 для успешного прохождения клеточного цикла и избегания случайной гибели при делении. Более того, проведенный нами биоинформатический анализ показал, что некоторые сайты фосфорилирования каспаз эволюционно консервативны как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных. Также нами продемонстрировано, что наибольшее количество механизмов регуляции программируемой гибели за счет ПТМ описано для инициаторных каспаз-8 и -9, однако для инициаторной каспазы-2 в литературе описано только 3 случая фосфорилирования, причем один из них не подтвержден для человека (Рис.1). Каспаза-2 является одним из самых консервативных белков семейства цистеиновых протеаз, из которого только она обладает сигналом ядерной локализации. Этот фермент участвует в индукции и усилении апоптотического ответа при повреждении ДНК, например, после обработки химиотерапевтическими агентами, или индукторами, вызывающими стресс эндоплазматического ретикулума. Кроме того, каспаза-2 обладает онкосупрессорными функциями, участвует в поддержании генетической стабильности и регуляции клеточного цикла, толерантности к окислительному стрессу. Также было показано, что каспаза-2 может активироваться при заражении некоторыми микроорганизмами и участвовать в воспалительном ответе. В настоящее время исследование функций каспазы-2 и путей их регулирования является одной из «горячих точек» в изучении механизмов регуляции гибели клеток. Исследование ПТМ каспазы-2 в раковых клетках позволит установить механизм активации этого фермента, как один из механизмов регуляции апоптоза, а также даст новую информацию об его участии в процессах контролирования клеточного цикла, репарации и/или репликации ДНК. Настоящее исследование будет включать несколько этапов. В недавно (2016 г) проведенном нами масс-спектрометрическом анализе интерактомы каспазы-2 при индукции повреждений ДНК были обнаружены киназы, фосфатазы и белки, регулирующие клеточный цикл (белок 14-3-3, CaMKII, фосфатаза P1), а также Е3 убиквитин-лигазы. Регуляция каспазы-2 за счет ПТМ для некоторых из этих белков в литературе показана, однако роль большинства белков остается невыясненной. Для дальнейшего поиска белков, участвующих в регуляции ПТМ каспазы-2, предполагается выделить высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2, формирующийся в раковых клетках в ответ на повреждение ДНК. Далее будут проведены масс-спектрометрический и протеомный анализы полученных образцов с целью идентификации белков, способных регулировать формирование этого комплекса за счет ПТМ. На следующем этапе будет проведено сравнение белков, идентифицированных в данном анализе, с выявленными ранее потенциальными партнерами с целью обнаружения общих кандидатов. Соответственно, дальнейшее исследование предполагает экспериментальную проверку идентифицированных кандидатов с применением методов иммунопреципитации, аффинного выделения, гель-фильтрации и метода siRNA. Для обнаружения сайтов фосфорилирования на втором этапе будет проведен биоинформатический анализ сайтов ПТМ каспазы-2 с целью выявления наиболее консервативных остатков среди различных организмов. Сравнение эволюционно-консервативных остатков в последовательности каспазы-2 и других каспаз даст информацию о предпочтительном с точки зрения эволюции расположении сайтов фосфорилирования в третичной структуре каспаз. Данный анализ может выявить потенциальные сайты фосфорилирования, еще не описанные в литературе. В качестве дополнительного подтверждения будет проведен биоинформатический анализ последовательности каспазы-2 с использованием алгоритмов и баз данных, предназначенных для предсказания ПТМ (NetPhos, PhosphoSite, Disphos, NetPhorest и т.д.). Сравнительный анализ полученных с помощью этих двух подходов сайтов ПТМ далее будет использован с целью нахождения общих сайтов. На следующем этапе предполагается экспериментальная проверка предсказанных участков фосфорилирования с использованием генетических конструктов, содержащих последовательности дикого или мутантных вариантов гена каспазы-2. Будет проведено сравнение способности этих мутированных вариантов каспазы-2 расщеплять специфические и эндогенные субстраты, а также влиять на развитие апоптоза в ответ на повреждение ДНК в раковых клетках. Для этих экспериментов будут использованы созданные нами с помощью системы CRISPR/Cas9 линии раковых клеток дефицитных по каспазе-2. Данный анализ предполагается проводить с помощью современных методов исследования клеточной гибели и ее молекулярных путей, таких как масс-спектрометрия, разные виды проточной цитометрии, иммуноблотинг, измерение активности каспаз и конфокальная флуоресцентная микроскопия. В литературе не встречаются данные, подтверждающие факт убиквитинилирования каспазы-2. Однако для других каспаз описаны механизмы регуляции их функции за счет данного вида ПТМ. Таким образом, одной из целей настоящего исследования является анализ убиквитинилирования каспазы-2. Для этого будет проведена иммунопреципитация каспазы-2 из раковых клеток в оптимизированных условиях с последующим иммуноблотингом полученных образцов и окраской антителами как к общему убиквитину, так и специфических антител к различным цепям полиубиквитина. Такой анализ выявит, в первую очередь, происходит ли убиквитинилирование каспазы-2 в раковых клетках. В ходе дальнейшего исследования будет выявлено, меняется ли степень и характер убиквитинилирования каспазы-2 при повреждениях ДНК химиотерапевтическими агентами, что позволит сделать вывод о регуляции активации и уровня каспазы-2 за счет этого вида ПТМ. Помимо этого, поскольку в проведенном в 2016 году масс-спектрометрическом анализе была выявлена Е3 убиквитин-лигаза (ТРИМ21), то будет проанализировано возможное взаимодействие данного фермента с каспазой-2 и его влияние на ее работу. Также, используя разработанный нами метод выделения ядер апоптотических клеток, будет проводиться оценка убиквитинилирования каспазы-2 я ядре. Такой анализ позволит выявить характер убиквитинилирования каспазы-2 в ядре (моно-, поли-, тип цепей), что даст ключ к пониманию ее роли в ядре в необработанных и подвергшихся генотоксическому стрессу раковых клетках. Таким образом, проект предполагает детальное исследование ПТМ каспазы-2 и их влияние на ее функции и активность после воздействия ДНК-повреждающих препаратов, используемых в терапии опухолей. Полученные знания в первую очередь будут использованы для оценки, каким образом нарушения механизмов ПТМ каспаз влияют на процессы, отвечающие за выживание/гибель здоровых и патологических клеток, а также каким образом возможно преодолеть устойчивость патологических клеток к терапии.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта ожидается получить следующие результаты: 1) Будут выявлены новые сайты фосфорилирования каспазы-2 и установлено влияние этих сайтов на активность данного фермента и развитие апоптоза в целом. Полученные результаты в первую очередь прольют свет на механизмы регуляции функций и активности каспазы-2 в процессе запуска апоптоза и помогут восполнить пробел в знаниях механизмов действия ДНК-повреждающих химиотерапевтических препаратов. Несмотря на очевидную важность онкосупрессорных и проапоптотических функций каспазы-2 до сих пор не выяснен механизм активации и регуляции активности этого белка. Так, механизмы контроля ее активности и функций на уровне ПТМ изучены слабо и известно только 5 примеров модификаций в целом (в отличие от каспазы-8, для которой описано не менее 7 сайтов только фосфорилирования). Ответ на вопрос, каким образом происходит регуляция функций и активности каспазы-2 за счет фосфорилирования, является приоритетной задачей современной онкобиологии и медицины. Помимо этого, разработка методологии поиска новых сайтов ПТМ в будущем поможет выполнять аналогичные исследования для других белков, играющих существенную роль в процессах онкогенеза, ответе раковых клеток на терапию или их устойчивости к ней. 2) Будет установлено, подвергается ли каспаза-2 поли- или моноубиквитинилированию, каков характер этого убиквитинилирования, и как оно влияет на осуществление проапоптотических функций каспазы-2. На сегодняшний момент факт убиквитинилирования каспазы-2 не установлен, хотя известно, что данный тип ПТМ ответственен за широкий спектр функций подавляющего количества белков. Так моно- и полиубиквитинилирование регулируют фундаментальные процессы, такие как деградация белков, белок-белковые взаимодействия, трансляция, репарация ДНК и т.д. Необходимо отметить, что в литературе описаны примеры убиквитинилирования центральных белков апоптоза – инициаторных каспаз-8, -9 и эффекторных каспаз-3, -7. Данный тип модификаций тонко регулирует баланс активных и неактивных каспаз за счет контроля процессов активации или деградации, существенно влияя на ответ клеток на апоптотические стимулы. Есть все основания полагать, что функции и активность каспазы-2 также регулируются аналогичным образом. Следовательно, исследование пост-трансляционного убиквитинилирования каспазы-2 даст ключ к пониманию механизмов действия этого фермента и развития апоптотического ответа при генотоксическом стрессе. Таким образом, настоящий проект предполагает развернутое изучение наиболее важных типов ПТМ каспазы-2 и их влияния на процесс апоптоза в раковых клетках. Его значимость для биологии и медицины не вызывает сомнений, поскольку анализ современной литературы показывает, что только в конце 2016 и начале 2017 годов было опубликовано 3 статьи, посвященные исследованию функций и механизмам регуляции каспазы-2, в журналах с импакт-фактором от 7.9 до 26.3. Кроме того, все три экспериментальные работы, посвящённые фосфорилированию каспазы-2, были опубликованы в журналах EMBO J и Cell. Участие молодых ученых в семинарах и конференциях в рамках проекта будут иметь большое значение для теоретической и практической подготовки студентов и молодых научных кадров в области исследования клеточной гибели.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Одной из важнейших инициаторных каспаз, играющих центральную роль в запуске ответа на повреждения ДНК, является каспаза-2. Более того, этот белок обладает онкосупрессорными функциями в организме, поддерживает генетическую стабильность клеток тканей и обеспечивает элиминацию клеток с неправильным числом хромосом. Несмотря на важность этого фермента в индукции гибели раковых клеток механизм его активации остается до сих пор невыясненным. Ассоциация этого фермента с комплексом PIDDosome, который впервые был описан в 2004 году, по существующим данным не является единственным механизмом активации каспазы-2. Так, в нашей лаборатории впервые было показано существование альтернативной платформы активации, формирующейся в клетках карциномы яичника в ответ на обработку ДНК-повреждающим химиотерапевтическим агентом цисплатином. Для дальнейшего изучения механизма активации этого фермента был проведен ряд экспериментов по выделению комплекса активации каспазы-2. В данных экспериментах были использованы линия клеток карциномы яичника Caov-4 и цисплатин в концентрации 70 µМ. Для выделения комплекса активации каспазы-2 был применен ранее разработанный нами подход, основанный на комбинации гель-фильтрации и последующей иммунопреципитации (ИП) каспазы-2 из высокомолекулярных фракций. Для дополнительного подтверждения PIDDosome-независимого механизма в ходе экспериментов также было проанализировано, детектируется ли белок RAIDD в профилях гель-фильтрации в высокомолекулярных фракциях из обработанных цисплатином клеток. Согласно Вестерн-блот анализу каспаза-2 обнаруживалась в высокомолекулярных фракциях гель-фильтрации из лизатов клеток, обработанных цисплатином. Таким образом, данный фермент после индукции апоптоза взаимодействовал и образовывал стабильный комплекс со своими белками-партнерами при генотоксическом стрессе. При этом анализ профилей гель-фильтрации показал, что в противовес каспазе-2 белок RAIDD – молекулярный адаптор платформы PIDDosome – не обнаруживался в высокомолекулярных фракциях гель-фильтрации клеток, обработанных цисплатином. Таким образом, отсутствие RAIDD в высокомолекулярных фракциях, обработанных цисплатином клеток подтвердило тот факт, что этот белок не взаимодействует с активированной каспазой-2, следовательно, активация этого фермента происходит по PIDDosome-независимому механизму. Необходимо отметить, что после обработки клеток ДНК-повреждающим агентом в высокомолекулярных фракциях (MW>670 кДа) гель-фильтрации были обнаружены каспаза-8 и белок RIP. Данный факт свидетельствовал о том, что в клетках карциномы яичника под действием цисплатина формируется комплекс RIPoptosome. Не исключено, что после повреждений ДНК каспаза-2 может включаться в состав RIPoptosome и активироваться или регулировать активность комплекса. Также для выделения комплекса активации использовались ранее созданные генетические конструкты каспазы-2, содержащие ген каспазы-2 с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид для аффинной хроматографии, так называемый tag - Strep-tag, Twin-Strep-tag, GST-tag, Flag-tag. Далее были получены образцы каспазы-2, выделенные из контрольных и обработанных 70 µМ цисплатина клеток Caov-4. При этом каспазу-2 и взаимодействующие с ней белки выделяли с помощью двух методов: 1) гель-фильтрацией лизатов клеток с последующий ИП каспазы-2 из высокомолекулярных фракций; 2) оверэкспрессией конструкта, содержащего последовательность caspase-2-Twin-Strep, в клетках KO-casp2 Caov-4 с последующим выделением с помощью сорбента Strep-Tactin Superflow high capacity. Полученные образцы были проанализированы с помощью метода масс-спектрометрии. Данный анализ подтвердил эффективность разработанного метода, поскольку в спектре было обнаружено от 3 до 6 пептидов каспазы-2. Полученные масс-спектрометрические данные анализировали по определенному ранее разработанному алгоритму, позволившему исключать неспецифически-ассоциированные белки. Полученный список белков сравнивали с ранее детектированными потенциальными белками-партнерами каспазы-2. Результаты данного исследования показали, что в образцах каспазы-2 из высокомолекулярных фракций обнаруживался убиквитин, полиубиквитин, а также белки р62 и ТРИМ21. р62 участвует в процессе аутофагии и является убиквитин-связывающим белком, ТРИМ21 является убиквитин-лигазой. Таким образом, каспаза-2, вероятно, подвергается убиквитинилированию в процессе индукции клеточной гибели. Для анализа возможного убиквитинилирования каспазы-2 была проведена ИП с использованием антител против этого белка в денатурирующих условиях из лизатов контрольных и обработанных цисплатином клеток линии Caov-4. Вестерн-блот анализ полученных образцов показал, что после воздействия ДНК-повреждающего агента количество убиквитинилированной каспазы-2 возрастает. При этом в образцах ИП каспазы-2 из обработанных цисплатином клеток возрастает количество полиубиквитина К48, присоединение которого усиливает протеосомную деградацию белков. Таким образом, каспаза-2 подвергается убиквитинилированию, при этом оно усиливается при повреждениях ДНК. Вероятно, изменение степени и/или характера убиквитинилирования влияет на работу этого фермента при индукции апоптотической гибели раковых клеток химиотерапевтическими агентами. Эксперименты по изучению возможного взаимодействия каспазы-2 и р62 проводили с помощью метода ИП этих белков из лизатов контрольных и обработанных цисплатином клеток и с помощью трансфекции клеток конструктом, содержащим последовательность caspase-2-Twin-Strep. Анализ результатов этих экспериментальных подходов показал, что в образцах ИП через антитела к каспазе-2 происходит существенное обогащение каспазой-2, но при этом р62 и ТРИМ21 детектируются на слабом уровне как в контрольных, так и в обработанных цисплатином клетках. Анализ образцов выделенной экзогенной каспазы-2 после трансфекции клеток соответствующим конструктом показал, что белки р62 и ТРИМ21 не декретируются в этих образцах. Также была проведена ИП с использованием антител к р62 и ТРИМ21 из контрольных и обработанных цисплатином клеток линии Caov-4. Вестерн-блот анализ образцов ИП показал, что каспаза-2 также не детектируется в этих образцах. Таким образом, возможное взаимодействие каспазы-2 и белков р62 и ТРИМ21 является очень слабым. Несмотря на довольно большое количество описанных сайтов фосфорилирования для инициаторных каспаз-8 и -9, для каспазы-2 охарактеризовано только 3 таких сайта. Вероятно, регуляция активности и активация каспаза-2 происходит за счет большего количества сайтов фосфорилирования, поскольку этот фермент регулирует клеточную гибель в ответ на широкий ряд стимулов, включая повреждения ДНК, нагревание, стресс эндоплазматического ретикулума и метаболический стресс. Для поиска новых сайтов фосфорилирования каспазы-2 проведен биоинформатический анализ с использованием следующих баз данных: NetPhos, PhosphoSite, Disphos, NetPhorest, ScanSite, 3Dpdb, PhosphoNet. При поиске возможных сайтов фосфорилирования каспазы-2 учитывали, насколько используемый алгоритм надежно предсказывает уже известные сайты фосфорилирования каспазы-2: Ser-157, фосфорилируемый киназой CK2; Ser-164, фосфорилируемый CaMKII; Ser-340, фосфорилируемый CDK1. Далее сравнивали все сайты, найденные всеми алгоритмами. Из них выбирали те, которые были определены как минимум тремя различными алгоритмами. В качестве возможных сайтов фосфорилирования были отобраны: S196, S220, S384, T39, T380, Y151, Y420, Y444. Для более точного предсказания сайтов фосфорилирования был проведен сравнительный анализ консервативных остатков серина, треонина и тирозина в последовательности каспазы-2 среди позвоночных и беспозвоночных организмов. При рассмотрении этих сайтов, оказалось, что остатки S220, S384 и T380 показывают высокую консервативность. Помимо этого, было выполнено аналогичное множественное выравнивание среди других каспаз. Также положения всех остатков были рассмотрены на третичной структуре соответствующих каспаз и соотнесены с уже известными сайтами фосфорилирования. Анализ множественного выравнивания показал, что экспериментально доказанные сайты фосфорилирования достаточно консервативны. Таким образом, было сделано предположение, что данные сайты могут принимать участие в модификации указанных каспаз и регуляции протеолитической активности этих ферментов. Поскольку из всех выявленных возможных сайтов фосфорилирования остатки S220, S384 и T380 обладают высокой консервативностью, а два последних располагаются близко к активному центру, то остатки S384 и T380 были выбраны для экспериментальной проверки. На основе уже имеющихся конструкта, содержащего последовательность caspase-2-Twin-Strep, были созданы мутантные варианты каспазы-2 с заменами S384А и T380А. Эксперименты по оверэкспресии показали, что конструкты, содержащие мутантные варианты каспазы-2 с заменами S384А и T380А, удалось успешно экспрессировать в клетках линий KO-casp2 Caov-4 и HEK 394T. Далее полученные конструкты будут использоваться для исследования роли остатков S384 и T380 в процессе активации каспазы-2 при генотоксическом стрессе и их влияние на апоптотическую гибель раковых клеток после обработки химиотерапевтическими препаратами.

 

Публикации

1. А. Ю. Егоршина, А. В. Замараев, И. Н. Лаврик, Б. Д. Животовский, Г. С. Копеина. КАСПАЗА-2 – ОНКОСУПРЕССОР И РЕГУЛЯТОР МЕТАБОЛИЗМА: ЧТО ДЕНЬ ГРЯДУЩИЙ НАМ ГОТОВИТ? Молекулярная Биология, - (год публикации - 2018).

2. Копеина Г.С., Замараев А.В., Животовский Б.Д., Лаврик И.Н. Каспаза-2 как инициаторный белок апоптоза в клетках карциномы яичника в ответ на повреждения ДНК Гены и Клетки, Том XII, № 3, 2017, c. 127 (год публикации - 2017).

3. Копеина Г.С., Прохорова Е.А., Лаврик И.Н., Животовский Б.Д. Alterations in the nucleocytoplasmic transport in apoptosis: Caspases lead the way Cell Proliferation, Oct;51(5):e12467. Epub 2018 Jun 26. (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На первом году исследований применение ряда биоинформатических методов показало, что, возможно, остатки S384 и T380 в последовательности каспазы-2 могут фосфорилироваться и участвовать в регуляции функционирования этого белка. Для анализа влияния этих остатков были созданы мутантные последовательности с заменами S384А и T380А на основе конструкции, содержащей ген каспазы-2 дикого типа. Для дальнейшего анализа влияния мутации S384A и T380А на активацию каспазы-2 были использованы клетки эмбриональной почечной линии HEK293Т, карциномы яичника Caov-4 и ее генетическими модифицированного варианта без каспазы-2 Caov-4 KO-Casp-2, полученного с помощью технологии Crispr/Cas9. Клетки были трансфицированы генетическими конструктами, содержащими последовательность каспазы-2 дикого типа и с мутацией S384A или T380А. Вестерн-блот анализ показал, что в клетках, оверэкспрессирующих ген каспазы-2 дикого типа или с заменой T380А, наблюдался автокаталитический процессинг каспазы-2 и происходило накопление каталитически активных фрагментов р32 и р19. Введение мутации S384A препятствовало этому процессу. Образование каталитически активных фрагментов каспазы-2 дикого типа, но не с мутацией S384A, усиливалось при индукции апоптоза ДНК-повреждающим агентом цисплатином. Количество фрагмента p19, который свидетельствует об образовании максимально активного гетеротетрамера фермента, было заметно меньше в клетках, трансфицированных конструкцией с заменой S384A, по сравнению с теми, где была оверэкспрессирована каспаза-2 дикого типа или с заменой T380А. Более того, выделение каспазы-2 с помощью аффинной хроматографии показало, что в образцах мутантного варианта каспазы-2 с заменой S384A фрагмент р19 практически не детектировали. Соответственно, данный эксперимент подтверждал, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин приводила к практически полной блокировке автокаталического расщепления каспазы-2 и формирования ее ферментативно активных субъединиц. Для подтверждения влияния замены S384A на функционирование каспазы-2 было проведено измерение активности этого фермента в клетках, трансфицированных конструктами с последовательностью каспазы-2 дикого типа либо с заменой S384A. После индукции апоптоза цисплатином клетки собирали и измеряли ферментативную активность каспазы-2 по ее способности расщеплять флуоресцентный пептид Ac-VDVAD-AMC. Измерение активности каспазы-2 подтвердило, что мутированная каспаза-2 не обладала каталитической активностью. Полученные данные свидетельствовали о том, что замена S384A в последовательности каспазы-2 приводила не только к блокировке автокаталитического процессинга профермента, но и к практически полному подавлению ферментативной активности каспазы-2 при индукции апоптоза повреждением ДНК. Для оценки влияния замены S384A на интенсивность клеточной гибели был проведен Вестерн-блот анализ маркеров апоптоза - расщепленной активированной каспазы-3 (clCasp3) и расщеплённой формы белка PARP (clPARP), который является субстратом эффекторных каспаз. Данный анализ клеток после трансфекции соответствующими конструктами и обработки цисплатином показал, что накопление clCasp-3 и clPARP было заметно снижено в клетках, экспрессирующих мутантный вариант каспазы-2 c заменой S384A, по сравнению с клетками, синтезирующими каспазу-2 дикого типа. Такое снижение уровня накопления маркеров апоптоза хорошо коррелировало с подавлением процессинга мутированной каспазы-2. Дальнейший количественный анализ уровня клеточной гибели с помощью метода проточной цитофлуориметрии подтвердил полученные результаты. Для того, чтобы оценить влияние замены S384A на клеточную гибель, клетки Caov-4 KO-Casp-2 и НЕК293Т трансфицировали соответствующими конструктами. После обработки клеток цисплатином 70 мкМ в течение 24 часов клетки были собраны и окрашены аннексином V-FITC и пропидия иодидом, после чего была проведена проточная цитофлуориметрия. Данный эксперимент продемонстрировал, что обработка цисплатином приводила к индукции апоптоза как в нетрансфицированных клетках, так и после трансфекции конструктами с геном каспазы-2 дикого типа или с мутацией. Однако после индукции гибели ДНК-повреждающим препаратом размер апоптотической популяции был заметно больше в клетках, продуцирующих каспазу-2 дикого типа, по сравнению с клетками, синтезирующих каспазу-2 с заменой S384A. Полученные данные подтвердили, что мутация S384A в последовательности каспазы-2 снижала уровень апоптоза, вызванного химиотерапевтическим препаратом. Суммарно, полученные данные показали, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин в последовательности каспазы-2 приводила к блокировке автокаталитического процессинга этого фермента и ингибированию его ферментативной активности, что вызывало подавление процесса цисплатин-индуцируемого апоптоза. Нами также было показано, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию. Было отмечено, что в образцах каспазы-2 увеличивается количество именно полиубиквитина К48, присоединение которого к белкам обычно свидетельствует об усилении их протеосомной деградации. Исходя из этого стало необходимым изучение протеасомной деградации каспазы-2. Для этого клетки линий Caov-4 обрабатывали протеасомным ингибитором MG-132 в концентрации 1 мкМ в течение 24 часов или комбинацией MG-132 с ДНК-повреждающими химиотерапевтическими препаратами цисплатином, доксорубицином или этопозидом. Исследование протеасомой деградации каспазы-2 продемонстрировало, что блокировка этого процесса MG-132 приводила к накоплению расщепленной активированной каспазы-2 - фрагмента р19 - даже через 4-8 часов инкубации. Аккумуляция р19 существенно усиливалась при комбинировании MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами. Комбинация MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами приводила также к усилению апоптотической гибели, о чем свидетельствовало усиление аккумуляции фрагмента р89 белка PARP. Соответственно, блокирование протеасомой деградации при помощи MG-132 приводило к накоплению в клетках активных форм каспазы-2 и усиливало их гибель при сочетании ингибитора с химиотерапевтическими препаратами. Поскольку не было отмечено какого-либо падения уровня проформы каспазы-2 в этих условиях, то было выдвинуто предположение, что накопление фрагмента р19 является результатом блокировки его протеосомной деградации, а не усиления расщепления проформы. Таким образом, вероятно, при индукции генотоксического стресса происходит усиление убиквитинилирования каспазы-2, в особенности ее активных расщепленных форм, что ведет к деградации фермента и замедляет апоптоз в опухолевых клетках. При блокировке этого процесса ингибитором протеасом происходит накопление активной каспазы-2, что способствует ускорению клеточной гибели наравне с другими путями, стимулирующими апоптоз при подавлении механизмов деградации белков. Нами обнаружено, что в процессе апоптоза каспаза-2 транслоцируется в ядро в активной форме наряду с другими инициаторными каспазами. Было показано, что данный процесс не зависел от того, каким образом был индуцирован апоптоз – повреждением ДНК, ингибированием киназ или стимуляцией рецепторов смерти. Таким образом, транслокация каспазы-2 в ядро является неизбежным событием в процессе апоптоза, вызванного различными стрессовыми стимулами. Возможно, каспаза-2 участвует в деградации компонентов ядра наряду с другими каспазами. При анализе распределения каспазы-2 между ядром и цитоплазмой было отмечено появление в ядерной фракции новой полосы, детектируемой антителами против каспазы-2, но находящейся выше, чем проформа каспазы-2. Эта полоса характеризовалась небольшим сдвигом электрофоретической мобильности по сравнению с полосой, соответствующей прокаспазе-2. Регистрируемый сдвиг составлял приблизительно 8-9 кДа по массе и мог соответствовать моноубиквитинилированию каспазы-2. При этом ингибирование протеасомной деградации с помощью MG-132 приводило к накоплению данной формы каспазы-2 в ядерной фракции, но не в цитоплазме, что подтверждало предположение о существовании ядерной моноубиквитинилированной формы каспазы-2. Проведение иммунопреципитации каспазы-2 из цитоплазматической и ядерной фракций также показало наличие полосы каспазы-2 массой 57 кДа специфично в ядерной, но не в цитоплазматической фракции. Данная полоса детектировалась в лизатах необработанных клеток, и соответствующий сигнал усиливался при добавлении протеасомного ингибитора и/или проведении ИП. При обработке клеток ДНК-повреждающим агентом данная форма каспазы-2 исчезала. Таким образом, в то время как до настоящего момента в литературе отсутствовали какие-либо данные об убиквитинилировании каспазы-2, серия полученных нами результатов впервые предполагает важность убиквитинилирования каспазы-2 в регуляции ее активности и функций. Возможно, моноубиквитинилирование данной каспазы влияет на ее локализацию в клетке и неапоптотические функции. При этом полиубиквитинилирование регулирует уровень активных форм данного фермента в клетке, что влияет на интенсивность апоптоза. Таким образом, не исключено, что убиквитинилирование важно для переключения функции каспазы-2 с неапоптотических на апоптотические в ответ на определенный уровень повреждения ДНК в клетке. Дополнительно были проанализированы структура, функции и важнейшие белок-белковые взаимодействия антиапототического белка семейства Bcl-2 – Mcl-1. При запуске апоптоза повреждением ДНК активированная каспаза-2 расщепляет проапоптотический белок Bid, что запускает пермеабилизации внешней мембраны митохондрии (ПВММ), после чего происходит выход в цитоплазму цитохрома С, формирование апоптосомы и активация каспазы-9. Процесс ПВММ напрямую зависит от Mcl-1, который связывает проапоптотические белки Bak и Bax и не дает сформироваться порам в мембранах митохондрий. Поскольку уровень Mcl-1 зачастую повышен в опухолевых тканях, то этот белок представляет собой важную терапевтическую мишень. С помощью биоинформатических и структурных методов исследования нам удалось выявить молекулярные аспекты взаимодействия Mcl-1 с его природными антагонистами — белками Noxa и Bim, а также с одним из синтезированных низкомолекулярных ингибиторов. Полученные данные позволили сформулировать теорию о направленном создании соединений, вызывающих специфическую деградацию Mcl-1 в протеасомах.

 

Публикации

1. - Ученые уточнили механизм гибели раковых клеток Газета.ru, - (год публикации - ).

2. - Как перехитрить раковые клетки «Стимул». Журнал об инновациях в России., - (год публикации - ).

3. - Ученые МГУ нашли в клетке опухоли мишень для противораковой терапии Медвестник, - (год публикации - ).

4. А. В. Замараев, А.Ю. Егоршина, И. Н. Лаврик, Б. Д. Животовский, Г. С. Копеина Выделение высокомолекулярных комплексов активации инициаторных каспаз при повреждениях ДНК Клеточные технологии в биологии и медицине, - (год публикации - 2019).

5. Г. С. Копеина, А. В. Замараев, Е. Прохорова, А.Ю. Егоршина, И. Н. Лаврик, Б. Д. Животовский, The role of caspase-2 in the regulation of apoptosis, necroptosis and mitotic catastrophe upon genotoxic stress in ovarian carcinoma cells CELL DEATH DISCOVERY, V 5, 47 (год публикации - 2019).

6. Копеиной Г.С, Замараева А.В., Лаврик И.Н., Животовского Б.Д. Способ выделения белкового высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 человека -, 2671570 (год публикации - ).

7. Прохорова Е.А., Копеина Г.С., Лаврик И.Н., Животовский Б. Apoptosis regulation by subcellular relocation of caspases Scientific Reports, 15;8(1):12199. (год публикации - 2018).

8. Сенечкин В.В., Стрелецкая А.Ю., Животовский Б.Д. и Копеина Г.С. Molecular Comprehension of Mcl-1: From Gene Structure to Cancer Therapy Trends in Cell Biology, - (год публикации - 2019).