Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Подобраны условия электроспиннинга, изготовлены и исследованы 3Д матриксы из растворов политриметиленкарбоната (ПТМК) и его сополимеров (ПТМК-ПКЛ и ПТМК-ПМК) в системе растворителей на основе дихлорметана (дихлорметан (ДХМ) с диметилформамидом (ДМФ)) и из растворов в 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропаноле (ГФИП). Обнаружено, что добавление ДМФ приводит к формированию капель, при уменьшении концентрации ДМФ размер капель уменьшается, однако склонность к формированию «капельно-волоконной» структуры у 3Д матриксов остается даже при их изготовлении из растворов в ДХМ (капли диаметром 5-6 мкм, волокна менее 1мкм). Матриксы, изготовленные из растворов в ГФИП, имеют волоконную структуру с диаметром волокон от 3-4 мкм в случае ПТМК-ПМК до 0,3-1 мкм у матриксов из ПТМК-ПМК с желатином (Жл). Добавление Жл приводит к существенному уменьшению диаметра волокон. Было обнаружено, что все матриксы на основе ПТМК необходимо тщательно вакуумировать для удаления остатков растворителя и хранить в сухих условиях, в противном случае они склонны формировать множественные контакты между волокнами, формируя перфорированные пленки. Матриксы не цитотоксичны, т.е не высвобождают токсичных компонентов (ГОСТ ISO 10993-5-2011, исследование выполнено на первичных эндотелиоцитах пупочной вены человека (ПЭПВЧ)). ПЭПВЧ прикрепляются и пролиферируют на поверхности таких матриксов не менее, чем в 2 раза хуже по сравнению с культуральным пластиком. Обнаружено, что при намокании 3Д матриксы склонны к усадке (особенно матриксы ПТМК-ПМК и матриксы с добавлением Жл), и, после высушивания они склонны к образованию стекловидной структуры. Матриксы, полученные из раствора ПТМК-ПМК и ПТМК-ПМК с Жл в ГФИП, имеют прочность 2.28±0.41 и 4.32±1.15 МПа, относительное удлинение 319.5±75.6 и 247.25±68.9, соответственно. Остальные матриксы имеют прочность не более 0,4МПа, чрезвычайной податливы, сильно проигрывают по этим показателям 3Д матриксам из других полимеров (например, поликапролактона или полиуретана Hasan, A., et al., Acta biomaterialia, 2014; Chen Q., et al., Progress in polymer science, 2013). Таким образом, 3Д матриксы на основе ПТМК мало пригодны для изготовления изделий для сердечно-сосудистой хирургии. В связи с этим нами были изготовлены и исследованы 3Д матриксы, полученные методом электроспиннинга из растворов биостабильного термопластичного полиуретана Tecoflex EG-80A (ТЕС) в ГФИП в том числе и растворов ТЕС с Жл. Были отработаны условия электроспиннинга, изготовлены и исследованы 3Д матриксов из ТЕС с Жл в различных весовых соотношениях. По данным СЭМ все полученные диаметр волокон полученных матриксов варьирует в диапазоне 0.60±0.21÷1.52±0.40 мкм, размером пор матриксов 1.21±0.53÷7.42±3.51 мкм. Пористость матриксов варьирует в диапазоне от 10.14 до 47.29% в зависимости от концентрации ТЕС в ГФИП. Увеличение концентрации Жл с 5 до 20% (весовые % относительно ТЕС) приводит к сильной усадке матриксов после увлажнения от 16±0.8 до 61±4.9%. Усадка 3Д матриксов из 3% ТЕС и 3% ТЕС c 5% Жл, практически не зависит от увлажнения образцов и составляет 16-18%. Концентрация ТЕС и Жл в растворе для электроспиннинга влияют на прочность материалов и максимальное удлинение образцов. 3Д матриксы с 5% Жл независимо от концентрации ТЕС в растворе для электроспиннинга имеют наименьшее удлинение при разрыве, а при повышении концентрации Жл (10-20%) наблюдается удлинение матриксов как минимум на 50%. Матриксы из 3% ТЕС + 15% Жл, 3% ТЕС + 10% Жл и 5% ТЕС + 15% Жл, отличаются повышенной прочностью и эластичностью. Прочность таких матриксов толщиной 150 мкм (ГОСТ Р ИСО 7198-2013) на прорыв ниткой составляет от 180 до 270 г. При сравнительном анализе ИК-спектров 3Д матриксов из чистого ТЕС со спектрами матриксов из ТЕС с добавлением Жл, наблюдаются аналогичные полосы поглощения и дополнительные полосы в области 1660-1640 cм-1, характеризующие валентные колебания C=O пептидных групп Жл (Ki, C. S., et all., Polymer. 2005). Сдвиги положения максимумов полос поглощения (на 1-5 см-1), отвечающих колебаниям NH- и C=O - групп в матриксах из ТЕС с Жл относительно спектра матрикса без белка свидетельствует о взаимодействии полимерных цепей белка и полиуретана. После инкубации матрикса с белком в фосфатном буфере в спектрах изменяется частота С=О и N-H групп ТЕС (1696 см-1, 3320 см-1), С=О групп белка (1660 и 1640 см-1). Сдвиги составляют от 3 до 10 см-1 и свидетельствуют о изменении силы водородных связей в системе взаимодействия полиуретана с белком. Длительная инкубация 3Д матриксов из ТЕС с Жл в физиологическом растворе приводит к изменению микроструктуры матриксов. Как было показано на примере матриксов, обработанных глутаровым альдегидом (ГА), причиной изменения структуры является высвобождение Жл. При этом потеря массы составляет не более 1% для всех исследуемых 3Д матриксов на сроке 28 дней. Прочность матриксов со временем несколько увеличивается (кратковременное уменьшение наблюдается только для 3% ТЕС + 15% Жл, обработанного ГА на сроке 7 дней). По-видимому, это происходит в связи с гидратацией и реорганизацией белка с формированием дополнительных контактов между молекулами Жл и ТЕС (см. данные ИК-спектроскопии). Фиксация белка ГА уменьшает подвижность молекул и возможность их реорганизации с формированием новых межмолекулярных взаимодействий в процессе гидратации. По-видимому, изменение структуры волокна определяет и уменьшение линейных размеров материалов (усадку) после их инкубации в водных растворах. ПЭПВЧ по данным СЭМ хорошо прикрепляются к поверхности исследуемых матриксов с сохранением характерной клеточной морфологии. Данные относительно способности ПЭПВЧ, полученных от трех разных доноров, прикрепляться и пролиферировать на поверхности 3Д матриксов демонстрируют, что 3Д матрикс, содержащий 3% ТЕС с 15% Жл и обработанный ГА является оптимальным субстратом для ПЭПВЧ. Этот матрикс и был использован на следующих этапах выполнения работ по проекту. Для того, чтобы оценить способность 3Д матриксов поддерживать формирование нормального эндотелиального слоя первичными эндотелиоцитами человека, было начато исследование профиля экспрессии генов эндотелиоцитов, культивируемых на разных 3Д матриксах. Чтобы исключить влияние индивидуальной вариабельности, в исследование были включены образцы первичных эндотелиоцитов человека, полученные от трех биологических доноров. Были получены РНК из клеток, культивированных на поверхности 3Д матриксов, изготовленных методом электроспиннинга из растворов 3% ТЕС, 3% Тес с 15% Жл, фиксированные ГА, 3% ТЕС с 15% Жл и 1,5% бивалирудина, фиксированные ГА, на культуральном пластике, а также на биологическом 3Д матриксе, изготовленном из аутологичной пупочной вены человека. Данные, полученные при помощи Bioanalyzer 2100 (Agilent, Германия) демонстрируют, что все образцы РНК имеют хорошее качество. Из всех 15 образцов РНК с использованием QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit FWD for Illumina (Lexogen GmbH, Австрия) были приготовлены кДНК библиотеки для секвенирования на платформе HiSeq 2500. Данные относительно профилей экспрессии генов в клетках, культивируемых на разных матриксах, будут получены в декабре 2017 г. Было выполнено исследование 3Д матриксов на основе 3% ТЕС с 15% Жл на параметры гемостаза крови. Было обнаружено, что исследуемые матриксы практически не влияют на концентрацию фибриногена и Д-димера. Введение в состав матрикса бивалирудина существенно повышает активированное парциальное тромбопластиновое время, причем это повышение, по-видимому, связано с высвобождением бивалирудина (поскольку 3Д матриксы с бивалирудином, обработанные ГА не влияют на АТПВ). 3Д матрикс из 3% TЕС с 15% Жл и 1.5% бивалирудина, обработанный ГА практически не влияет на параметры гемостаза и, по данным СЭМ, к его поверхности практически не прикрепляются тромбоциты. Таким образом, этот матрикс представляет особый интерес для изготовления изделий для сердечно-сосудистой хирургии. Протезы сосудов из ePTFE диаметром 2.0±0,2 мм, предоставленные компанией ЗАО НПК "ЭКОФЛОН" (Россия) и протезы, изготовленные методом электроспиннинга из раствора 3% ТЕС с 15% Жл и 1,5% бивалирудина и обработанные ГА, были имплантированы в инфраренальный отдел брюшной аорты крыс (всего 36 животных) на сроки 1, 12 и 24 недель. Интраоперационная оценка качества изготовленных протезов показала их хорошую устойчивость к «разлохмачиванию» при отрезании части ножницами, высокую способность сохранять свою цилиндрическую форму на протяжении всех этапов имплантации. Формирование анастомозов не сопровождалось подворачиванием краев трансплантата, протез формировал плотный контакт с нативной артерией. Протезы обоих типов не пропитывались кровью, время местного гемостаза для протезов из ePTFE составило 23,79±2,61 мин, для протезов TЕС - 18.11±1.81 мин. В условии пульсирующего кровотока отмечалась хорошая растяжимость протезов из ТЕС. На 1-й неделе, у 3 животных, а также на 41 и 65 у животных с имплантированным протезом из ePTFE наблюдался острый тромбоз протеза с развитием клиники острой ишемии задних конечностей, подтвержденных результатами УЗИ и вскрытия после эвтаназии. У животных с имплантированными протезами из TЕС, окклюзии протезов не наблюдалось. Линейная скорость кровотока (ЛСК) по данным УЗИ-сканирования на 7 сутки после имплантации между 2-мя типами протезов и контрольными животными статистически значимо не отличалась (р=0.84, U-критерий Манна-Уитни). Спустя 3 мес. после имплантации ЛСК для протезов из TЕС составляла 1.2 ± 0.13 м/с, для протезов из ePTFE 1.87 ± 0.23 м/с; наблюдалось явное стенозирование протезов из ePTFE. Максимальная степень стеноза в таких протезах составила 70-80% (по критерию NASCET). Во время эксплантации протезов на 7 сутки и после 3-х мес при макроскопическом исследовании не было выявлено видимых деформаций стенки обоих типов протезов; плотное фиксирование протезов сосудов с окружающими тканями и участки васкуляризации протезов из ТЕС наблюдалось на сроке 3 мес. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования будут выполнены после эксплантации всех протезов. В рамках выполнения проекта методом электроспиннинга было изготовлено несколько вариантов трехстворчатых клапанов легочной артерии. В качестве материала для клапанов был использован белок-наполненный полиуретан ТЕС (3% ТЕС с 15% желатина и 1,5% бивалирудина и обработанный ГА). Для изготовления трехстворчатого клапана (легочной артерии) были изготовлены электроды-коллекторы трех типов, в том числе и вариант, предложенный D'Amore A., et all., Biomaterials, 2018. С использованием электрода, повторяющего по форме створку клапана, были изготовлены створки, и после их установки в дополнительный электрод-коллектор изготовлена и внешняя, циллиндрическая часть клапана, т.е. изготовлен работоспособный клапан. Поверхность смыкания клапана имеет сложную выпукло-вогнутую форму. Для тестирования работоспособности клапанов был спроектирован и изготовлен стенд для гидравлических испытаний, использующий мембранный насос оригинальной конструкции, выталкивающий за цикл от 30 до 60 мл раствора. Анализ скорости открывания/запирания клапана и полноты его открывания по данным телеметрии показала, что створки открываются полностью, время полного открывания створок составляет 0,12-0,16 сек, клапан плотно запирается, объем обратного тока составляет 4-6 мл и обусловлен не столько скоростью запирания клапана сколько деформацией внешнего цилиндра клапанной конструкции. Предварительных испытания ресурса клапана (60 имп/мин, импульс 40 мл, 1, 5 мес или 4×106 циклов) не выявили изменений в скорости и полноте открывания/запирания створок клапана, а также механических дефектов. Маштабные испытания клапанов по ГОСТ 26997-2003 и/или ISO 5840-1:2015 на установке Pulse Duplicator system (ViVitro Labs, Канада) планируется выполнить на следующем этапе работы.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Для улучшения эндотелизации поверхностей были использованы лиганд интегринов – RGD-пептид (RGD) из структуры фибронектина и ДНК-аптамер (ДАП) к рецепторам эндотелиальных клеток (ЭК) и их предшественников (ПЭК). Для изготовления 3Д матриксов, экспонирующих RGD-пептид и ДАП были синтезированы коньюгаты пептида с человеческим сыворочным альбумином (ЧСА) и коньюгаты ДАП с олеиламидом и биотином. Коньюгат ЧСА-RGD был синтезирован с использованием пептида Cyclo(-Arg-Cly-ASP-D-Phe-Cys (RGDfC) после функционализации ЧСА N-гидроксисукцинимидным эфиром 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоновой кислоты с последующим сопряженным присоединением по Михаэлю RGDfC пептида. Структуру коньюгата подтверждали данными 1Н ЯМР спектроскопии, электрофореза, степень модификации (3) определяли по данным УФ-спектроскопии. ДАП синтезировали с использованием протоколов твердофазного фосфитамидного синтеза, остатки олеиламина и биотина вводили на 5'-конец олигонуклеотида, чтобы не нарушить пространственную структуру аптамера (олеиламин - после активации ОН-группы N,N' дисукцинимидилкарбонатом, биотин N-оксисукцинимидный эфир после введения гексаметиленаминового линкера). Для оптимизации поверхности были использованы 3Д матриксы изготовленные методом электроспиннинга из растворов Tecoflex EG-80A (ТЕС) с 10% ЧСА (вес ЧСА : вес ТЕС) в гексафторизопропаноле. Были исследованы физические свойства, структура поверхности и связывание первичных эндотелиоцитов пупочной вены человека (HUVEC) с матриксами ТЕС-ЧСА, Тес-ЧСА-RGDfC-ЧСА, ТЕС-ЧСА-ДАП, ТЕС-ЧСА-авидин. Все матриксы представляли собой волокнистые структуры с диаметром волокон от 0,5 до 2 мкм и диаметром пор от 1,2 до 3,5 микрон, прочностью около 16 мПа, с типичной для эластомеров диаграммой растяжения. При помощи флуоресцентно-меченого биотина и коньюгата биотина с пероксидазой было обнаружено, что матриксы с авидином не связывают биотин и не пригодны для связывания коньюгатов ДАП-био или RGD-био. Исследование экспонирования ДАП-ол на поверхности матриксов методом РФЭС продемонстрировало, что в принципе РФЭС позволяет детектировать Р2р электроны фосфора, но в этих матриксах олигонуклеотиды в поверхностном слое (толщиной до 10 нм) не обнаруживаются. Эти же данные были подтверждены в экспериментах по связыванию ЭК – клетки связываются с этими ДАП-био и ДАП-ол матриксами так же как и с контрольными. При помощи ИК-Фурье, показано, что поверхности матриксов экспонирован как ЧСА, так и ЧСА-RGD. При помощи AlamarBlue™ Cell Viability Reagent (Invitrogen, США), флуоресцентной микроскопии с предварительно мечеными цитотрекером (СТ orange) ЭК (после фиксации матриксов клетки докрашивали SIBR Green II) и СЭМ, исследовано связывание с матриксами ЭК и ЭК в смеси с клетками крови. Показано, что HUVEC хорошо связываются с матриксами TEC-ЧСА-RGD, в отличие от матриксов ТЕС-ЧСА, ЭК имеют типичную морфологию. Клетки крови так же лучше связываются с TEC-ЧСА-RGD, чем с ТЕС-ЧСА 3Д матриксами. Таким образом, было показано, что использование ДАП в варианте их введения в раствор для электроспиннига неэффективно. Авидин, введенный в состав волокна с ТЕС и ЧСА, также не может быть использован для связывания биотинилированных лигандов клеточной поверхности и повышения их эндотелизации. Введения в раствор для электроспиннига RGD-пептидов может быть использовано для улучшения их эндотелизации, однако необходима тщательная оптимизация концентрации RGD-пептида, уменьшение связывания клеток крови, и исследование функционирования таких матриксов in vivo. Функциональный статус эндотелиоцитов культивируемых на разных матриксах исследовали методом массового параллельного секвенирования на платформе HiSeq 3000. В качестве контрольного матрикса использовали децеллюляризованную по протоколу не использующему детергентов пупочную вену человека (dUV). Гистологическое исследование продемонстрировало полное удаление клеток и уплотнение ткани и сохранение соединительнотканных белков. По данным СЭМ dUV имеет гладкую поверхность с волокнами диаметром не более 0,1 мкм. HUVEC хорошо прикрепляются и пролиферируют на dUV (AlamarBlue™ Cell Viability, флуоресцентная микроскопия, СЭМ). HUVEC культивировали на поверхности 3Д матриксов изготовленных методом электроспиннинга из растворов 3% ТЕС (ТЕС), 3% Тес с 15% Жл (ТЕС-Жл) и 3% ТЕС с 15% Жл и 1,5% бивалирудина (ТЕС-Жл-Бв). Подготовка образцов для секвенирования и секвенирование описано в отчете за 2017 г. Анализ данных секвенирования демонстрирует высокое качество препаратов РНК выделенных из всех трех биологических повторов (средний RIN=7,4), высокое общем количество прочтений ( в среднем 8,19 млн/обр), хорошее качество Q30 и GC-состав с нормальным распределением пика на ожидаемом уровне 40-60%. Общее число картированных последовательностей, составляло от 74,5 до 86%, и процент уникальных последовательностей от 70,5 до 72,8, что наряду с высокой сходимостью биологических повторов позволяет использовать полученные данные для анализа функционального статуса ЭК. Выполнены сравнения дифференциально экспрессированных генов (ДЭ-гены) ЭК, культивированных на культуральном пластике (КП) и на dUV, а также на dUV и ТЕС, ТЕС-Жл, ТЕС-Жл-Бв. Сравнены уровни экспрессии (RPKM), отличия в экспрессии ДЭ-генов (FC) с использованием обычно используемых инструментов (РСА-анализ, Gene Ontology и т.д.) и с использованием подхода, предложенного в работе (Frausto R.F., et al., Cell Trasplant., 2016), с группировкой образцов по общей функции. Анализ данных секвенирования, ранее опубликованных данных относительно скорости заселения и пролиферации HUVEC на разных матриксах (Chernonosova VS, et al., BioMed Res. 2018) и данных относительно гемосовместимости матриксов (Chernonosova V.S., et al., IJPMPB, 2018), полученные в рамках этого проекта позволяют сделать заключение, что матрикс ТЕС-Жл-Бв позволяет поддерживать функциональный статус эндотелиоцитов и оптимален для изготовления изделий для сердечно-сосудистой хирургии. С использованием аналогичных инструментов и подходов (МПС) проанализирован статус ЭК, культивируемых в потоке среды (пилотное исследование). Обнаружены ДЭ-гены, в клетках, культивируемых в ПС в биореакторе, показано, что подход может быть использован для исследования влияния потока среды на статус ЭК, подготовлены 2/3 образцов РНК клеток, культивируемых в ПС из ТЕС-Жл-Бв в стационарных условиях и в потоке среды. Исследование будет завершено в 2019 г. В 2018 г. была завершены эксперименты по исследованию состоятельности ПС из ТЕС-Жл-Бв in vivo. Интраоперационная оценка качества ПС ТЕС-Жл-Бв показала их хорошую устойчивость к «разлохмачиванию» и высокую способность сохранять форму на протяжении всех этапов операции, формировать плотный контакт с артерией, затягивать проколы от иглы. Свобода от окклюзии ПС за весь период наблюдения составила: для группы ТЕС-Жл-Бв 94,5%; для контрольной группы ПС из ePTFE - 66,6% (р=0,04). Во всех группах не было обнаружено признаков инфицирования или воспаления, гематом, как в зоне самого трансплантата, так и окружающих его тканей. В группе ПС из Тес-Жл-Бв толщина неоинтимы между 12 и 24 неделями не изменяется. При межгрупповом сравнении, статистически значимой разницы толщины неоинтимы в различных протезах, на 12 и 24 неделе, не обнаружено. По данным гистологического и иммуногистохимического (Factor 8, α-SMА, Collagen IV) исследований во всех протезах на 3-м и 6-м месяце имплантации отмечалось формирование неоинтимального слоя, который соответствовал нормальному строению интимы сосуда. В стенках ПС из ePTFE наблюдается большое количество клеток крови и интенсивная кальцификация, в отличие от тестируемых ПС. По совокупности свойств ПС из ТЕС-Жл-Бв могут быть рекомендованы к дальнейшему исследованию на крупных животных. Исследована способность ПС отвечать на пульсовую волну, т.е. податливость ПС. Для этого изготовлен специальный стенд, позволяющий имитировать пульсовую волну при разных перепадах давления и выполнять 64 измерения диаметра ПС в секунду. Показано, что в отличие от брюшной аорты крыс, ПС из PTFE производства «Экофлон» и ПС из ТЕС-Жл не меняют диаметра во всех исследованных диапазонах перепада давления, даже при уменьшении толщины стенки в 2 раза относительно требуемой. Предложен вариант изготовления податливых ПС (ППС), разработаны и изготовлены оснастка и устройства для их производства. Получены ППС близкие по свойствам к нативным артериям. Исследовано влияние «старения» на ПС из ТЕС-Жл и ППС из этого же материала. Показано, что диаметр ППС со временем увеличиваются на 10-12% (обычные ПС напротив усаживаются) и протезы сильнее деформируются при физиологическом перепаде давлений (deltaD 2-2,5% у «новых», спустя 28 дней 3,5-4%). Следует отметить, что аналогичные работы в мире не выполняются (по меньшей мере, нет аналогов в открытой печати). Продолжены ресурсные испытания клапана, изготовленного, на первом этапе проекта, после 5×107 циклов было выполнено сравнительное испытание пульсового объема клапана "ЕВРОС-МИ" АМЛ-25 и изготовленного методом электроспиннинга. Показано, что клапан, изготовленный методом ЭС не уступает коммерческому аналогу. Разработана и изготовлена оснастка для производства клапанов для транскатетерной доставки методом ЭС. Из ТЕС-Жл изготовлены такие клапана (толщина варьирует в диапазоне 180-300 мкм) и начаты их стендовые испытания. При помощи измерения минутного и пульсового объема, и телеметрии показана хорошая коаптация створок, высокое быстродействие и более высокий расход жидкости, обеспечиваемый таким клапаном по сравнению с клапаном "ЕВРОС-МИ" АМЛ-25. Были определены требования к механическим свойствам каркасов клапанов в соответствие с ГОСТ 31618.1. Были разработаны конструкции каркасов клапана, отработаны условия термообработки каркасов. Был изготовлен протез аортального клапана для транскатетерной имплантации. Была разработана методика фиксации створчатого аппарата к каркасу клапана. Были проведены стендовые испытания каркасов клапанов на деформацию каркаса (в соответствии с требованием п. 5.6 ГОСТ 31618.1), жесткости каркаса на сжатие в радиальном направлении (п.1.1.16 ГОСТ 31618.1.) Была выполнена отработка способа имплантации клапана лабораторным животным. Проведены работы по фиксации створчатого аппарата, выполненного методом электроспиннинга, к каркасу клапана. Были проведены гидравлические испытания клапана, выполненного методом электроспиннинга. Были определены требования к каркасу стента, а именно прочности, упругости, стальных элементов конструкции и их фиксации с оболочкой.