Аннотация результатов, полученных в 2017 году
С целью получения специфических антител против белков острой фазы воспаления и маркеров окислительного стресса с использованием методов препаративной биохимии получены десять высокоочищенных белковых препаратов (фибриноген, сывороточный амилоид Р, гаптоглобин 1-1 и 2-2, церулоплазмин, тиоредоксин 1, миелопероксидаза, миоглобин, хлорированные ЛНП, хлорированный альбумин). С использованием методов электрофореза, масс-спектрометрии и ВЭЖХ доказана идентичность полученных белков предсказанной аминокислотной последовательности и высокая степень очистки. Проведен анализ титров антител при иммунизации лабораторных животных полученными белковыми препаратами. Отобраны оптимальные комбинации антигенов для иммунизации мышей, крыс и кроликов с целью получения антител. Проведен синтез стабильных при хранении сорбентов с ковалентно иммобилизованными белками (и ЛНП) для иммуноаффинной очистки антител на следующем годичном этапе выполнения проекта. В данном проекте получены результаты, позволяющие по-новому взглянуть на денатурацию фибриногена на уровне отдельных молекул. Исследование ультраструктуры молекул фибриногена, подвергнутых нагреванию или длительному контакту с поверхностью модифицированного графита, выявило ряд особенностей в морфологии фибриногена. Нагревание до 65°C и 90°C приводило к образованию различных конфигураций молекулы, содержащих глобулярные и фибриллярные структуры, которые являются мономерами и небольшими агрегатами развернутого белка. При комнатной температуре, после длительного (10 минут) контакта с поверхностью фибриноген формировал фибриллярные структуры, чья организация отражала нативную форму фибриногена: 6 полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями. Полученные результаты позволяют лучше понять вызванную различными факторами денатурацию фибриногена на молекулярном уровне, а также являются важными для использования в биомедицинских приложениях. Методами фотолитографии и молдинга создана модельная микрофлюидная система из ПДМС для биосенсора на ДПОВ в ОФК для исследований параметров возбуждения ПОВ в результате модификации завершающего слоя ФК и последующего осаждения белковых молекул. Данный подход позволит в дальнейшем не только создавать микрофлюидные системы для биосенсора на ДПОВ в ОФК, но и изготавливать микрофлюидные чипы для биосенсорных применений с различной геометрией, а также встраивать в подобные микрофлюидные чипы чувствительные элементы, такие как нанослои металлов, нанопоры, монослои биомолекул. Поверхности стекла, полистирола, полиметилметакрилата (ПММА), полидиметилсилоксана (ПДМС) или слюды, кремниевых пластин и наночастиц различных химических структур обрабатывали полиаллиламинами (ПАА) или полилизинами разной молекулярной массы для физической адсорбции биополимеров, вирусов и клеток. Сорбционная способность 0,1 мг / мл ПАА 65 кДа превышала способность других полиаминов с разной концентрацией. Толщины слоя PAA 65 измеренные как методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) на слюде, так и с помощью биосенсора с регистрацией критического угла полного внутреннего отражения на поверхности фотонного кристалла, покрытой SiO2, составляли ~ 1,5-2 нм. Дополнительная обработка глутаровым альдегидом (ГА) обеспечивала химическое сшивание соединений, содержащих первичные NH2-группы, с аминированными поверхностями. Белки, иммобилизованные на поверхности, обработанной pAA, сохраняли свою способность связываться с моноклональными и поликлональными антителами. Бактериальные клетки на поверхностях, покрытых PAA 65, сохранили морфологию и смогли экспрессировать ген GFP. Эукариотические клетки на стекле, обработанном ПАА, кремниевых пластинах и пластинах из полистирола также оставались жизнеспособными, как показало окрашивание синими или флуоресцентными красителями. Клетки на обработанных ПАА кремниевых пластинах были способны к делению клеток, хотя они не могли прикрепляться к необработанным поверхностям. Отработана двухэтапная процедура формирования одиночных нанопор радиусом 30-90 нм с модифицирующим покрытием – липидным бислоем (ЛБ), обладающим свойством двумерной жидкости с контролируемым поверхностным зарядом. Для получения одиночных пор радиусом 40-100 нм. использовались методы локального травления отверстий в нитридкремниевых пленках толщиной 20-200нм сфокусированным пучком ионов галлия. ЛБ наносился на поверхность нанопоры посредством инкубации ее с раствором однослойных липосом (радиусом 100 нм), полученных методом экструзии. Показано, что ЛБ сохраняет свойство двумерной жидкости. Для обеспечения высокой селективности к молекулам аналита, на поверхность ЛБ адсорбировали молекулярные комплексы ДНК аптамера тромбина, модифицированного холестерином. Показано, что наличие холестеринового “якоря” гарантирует необратимое встраивание в ЛБ молекулярного комплекса, который остается прикрепленным на поверхности мембраны после его отмывки из объема. При этом “заякоренный” аптамер сохраняет латеральную подвижность вдоль поверхности ЛБ. Разработан метод формирования цилиндрического липид-белкового конструкта с радиусом просвета 1,5-2 нм, геометрические характеристики которого позволяют детектировать прохождения одиночных объектов через их канал. На основании анализа импульсов изменения ионной проводимости разработаны методы измерения размера объекта (тромбин), его скорости и поверхностной концентрации.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
С целью получения антител против белков плазмы крови человека лабораторные животные были иммунизированы соответствующими антигенами: фибриногеном, сывороточным амилоидом P, миелопероксидазой (МПО), хлорированным альбумином, церулоплазмином, хлорированными липопротеинами назкой плотности, тиоредоксином 1, миоглобином, бета-цепью гаптоглобина. Иммунный ответ на введенные антигены оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На пике титра антител у животных отбирали кровь и получали сыворотку или забирали паховые лимфоузлы и проводили получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. Гибридомы были введены мышам и получены образцы асцитной жидкости, содержащей антитела. Полученные сыворотки и асцитные жидкости использовали для очистки антител. Для получения гомогенных препаратов моноклональных и поликлональных антител использовали различные биохимические методы, в том числе аффинную хроматографию, криопреципитацию, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию и др. Все полученные препараты антител были протестированы с помощью электрофореза в присутствии SDS и представляли собой тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов. Специфичность взаимодействия полученных нами моноклональных антител с антигенами была подтверждена с помощью иммунохимии (Вестерн-блоттинг) и поверхностного плазмонного резонанса (ППР). С помощью ППР определены константы диссоциации полученных пар антител и антигенов. Полученные нами моноклональные антитела были использованы для сравнения содержания МПО и фибриногена в образцах плазмы крови условно здоровых добровольцев (n=20) и в образцах плазмы пациентов с воспалительными заболеваниями (n=18) в динамике на фоне/до и в процессе хирургического лечения разной степени тяжести. Системный воспалительный ответ у пациентов подтвердили с помощью подсчета лейкоцитарной формулы крови и измерения концентрации свободных тиолов в плазме. Обнаружены достоверные отличия между концентрацией МПО и фибриногена в плазме здоровых добровольцев и у больных до операции, а также во всех временных точках в течение 2-х суток после операции. Так, уровень МПО в плазме пациентов до операции был в 2-3,5 раз выше, чем у здоровых доноров. Через 48 часов после операции наблюдалась тенденция к увеличению концентрации МПО в плазме в группе больных с острым воспалением относительно дооперационных значений, а также относительно величины этого показателя в группе больных с хроническим воспалением. Уровень фибриногена у пациентов был на 80-130% выше, чем у здоровых добровольцев, и не изменялся в пределах ошибки измерений на протяжении 48 часов после операции. Наши эксперименты показали перспективность применения полученных нами антител для клинических исследований. На основе метода осаждения из газовой фазы с активацией плазмой из углерод-содержащих прекурсоров разработаны сверхострые зонды для АСМ-исследований. Размеры острия синтезируемых нами структур составляют 1,5-2 нм. Полученные зонды позволяют минимизировать артефакты, ухудшающие разрешение метода. Для выбора подложки для создания библиотеки геометрических параметров белков-маркеров окислительного стресса методами АСМ охарактеризована морфология отдельных молекул фибриногена при различном времени адсорбции на поверхности ВОПГ, модифицированного производной углеводородно-олигоглицинового соединения (GM). Относительно большая продолжительность процесса разворачивания молекул фибриногена на поверхности GM-ВОПГ (более 5 минут), особенно по сравнению со свежесколотой поверхностью ВОПГ (~ 1 с), позволяет считать структуру адсорбированного белка в первые секунды после адсорбции близкой к нативной. Поэтому для создания библиотеки геометрических параметров белков-маркеров окислительного стресса методами АСМ в качестве подложки использовалась поверхность GM-ВОПГ, а нанесение производилось в пределах 10 с. В работе создана библиотека АСМ-изображений белков-маркеров, адсорбированных на данной поверхности, и определены геометрические характеристики этих белков. В результате модельного исследования влияния поверхности каналов микрофлюидного диагностического чипа на изменение внутренней структуры адсорбированных маркерных белков показано, что поверхность свежесколотого ВОПГ вызывает сильную денатурацию ряда адсорбированных белков плазмы крови, а поверхность GM-HOPG – медленное разворачивание молекул белка, связанное с частичной потерей третичной структуры. Доказано, что разворачивание происходит именно на поверхности подложки после адсорбции молекул белка, а не в объеме раствора. Выявлено, что при нанесении фибриногена на поверхность GM-ВОПГ из раствора с высокой концентрацией, за несколько минут образовывается плотный белковый слой, затрудняющий конформационные изменения молекул. Кроме того, разворачивание молекул фибриногена, адсорбированных на поверхность GM-ВОПГ по истечении периода времени от ~10 минут после нанесения, также не наблюдается. Объяснение данного эффекта может быть связано с ослаблением влияния подложки на адсорбированный белок из-за накопления большого количества адсорбированного ранее и развернутого белка, а также из-за осаждения на поверхность других низкомолекулярных примесей. Полученные на модельных поверхностях данные демонстрируют влияние ряда факторов, которые могут оказывать влияние на адсорбцию и конформационные изменения белков на поверхности каналов разрабатываемого микрофлюидного диагностического чипа. Среди этих факторов время проведения анализа, концентрация белков, свойства поверхности, использование модификации поверхности. С помощью биосенсора на поверхностных волнах в одномерном фотонном кристалле (ОФК) в реальном времени исследованы взаимодействия для пар белковых маркеров воспаления и окислительного стресса с соответствующими рецепторами. Получены кинетические кривые специфического связывания для пар “белок - рецептор”. Собраны записи регистрации чистых МОИ-спектров всех целевых макромолекул (факторов острого воспалительного процесса) при прохождении отдельных молекул белка через просвет одиночной нанопоры, модифицированной липидным бислоем в различных модельных средах (ионная сила, рН, присутствие двухвалентных катионов, присутствие примесей ПАВ). На основе полученных регистраций составлен банк данных для дальнейшей разработки метода количественного определения присутствия целевых веществ в пробе. Предложен метод идентификации молекул на основании анализа амплитуды и формы спектра МОИ.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках выполнения проекта разработан иммуноферментный анализ по определению фибриногена и миелопероксидазы в плазме крови человека с использованием иммобилизованных моноклональных антител, а также определены предел чувствительности метода, специфичность и линейный диапазон. Методика иммуноферментного анализа фибриногена представляет собой прямой вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для его реализации использовано моноклональное антитело 5G11, созданное в рамках данного проекта, с эпитопной специфичностью к фибриногену человека. На первой стадии анализа фибриноген, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывается с твердой фазой. На второй стадии иммобилизованный фибриноген взаимодействует с антителом 5G11, на третьей – осуществляется реакция взаимодействия меченного антителом 5G11 фибриногена с антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена. Во время инкубации с субстратной смесью (пероксид водорода и триметилбензидин) происходит пероксидазная реакция, сопровождающаяся окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшегося антитела А9044 и, соответственно, количеству фибриногена. Чувствительность определяли как минимальную концентрацию фибриногена в анализируемом растворе, при которой значения оптической плотности (Abs450нм) не пересекаются с диапазоном значений для “холостой” пробы. Значения Abs450нм для “холостой” пробы не превышали 0,06; при этом стандартное отклонение (SD) не превышало 0,006. Минимальная определяемая концентрация фибриногена не превышает 100 нг/мл анализируемой пробы. Линейный диапазон данного метода был установлен в области концентраций фибриногена 200 - 1600 нг/мл анализируемой пробы. Для определения специфичности готовили растворы фибриногена с разной концентрацией в PBS. Для приготовления анализируемых проб смешивали равные объемы растворов фибриногена и плазмы, а также фибриногена и PBS вместо плазмы. Результаты экспериментов показали, что графики зависимости оптической плотности от концентрации стандартного фибриногена, внесенного в пробы, содержащие плазму, лежат выше и при этом параллельно калибровочному графику в отсутствие плазмы. Более того, этот сдвиг графика для проб с плазмой был пропорционален количеству плазмы. Эти результаты доказывают специфичность данного метода для определения фибриногена в плазме крови человека. Для анализа чувствительности, специфичности и линейного диапазона ИФА тест-системы для определения миелопероксидазы (МПО) в плазме крови человека использовали мноклональные антитела к МПО AT2F7, полученные в рамках данного проекта. Разведенные в карбонатном буферном растворе антитела (5 мкг/мл) иммобилизуют на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок). На следующей стадии МПО, содержащаяся в тестируемых образцах или в калибровочных растворах, связывается с иммобилизованными антителами. После тщательной промывки лунок связавшиеся молекулы МПО взаимодействуют с мечеными пероксидазой хрена первичными антителами. На последней стадии вносится субстратная смесь, содержащая тетраметилбензидин и пероксид водорода. После измерения оптической плотности раствора в лунках при длине волны 450 нм на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация МПО в анализируемых образцах. Минимальная определяемая концентрация составила не более 0,7 нг/мл. При измерении концентрации МПО в плазме в диапазоне 3,1 – 25 нг/мл метод является специфичным, поскольку результаты измерений не зависят от присутствия других белков плазмы, полученной как с использованием ЭДТА, так и цитрата в качестве антикоагулянта. В проекте также разработаны метод и алгоритм идентификации белков по спектрам ОИ по различным параметрам молекул. Для разработки метода идентификации белков по спектрам ОИ использовался тот факт, что амплитуда сигнала определяется ориентацией молекулы внутри канала нанопоры. Амплитуда ОИ определяется соотношением геометрических параметров белка и поры, которое умножается на электрический коэффициент формы, равный 1.5 для сферической молекулы. Максимальное и минимальное значение амплитуды ОИ будет соответствовать максимальному и минимальному значению электрического коэффициента формы. В рамках приближения молекулы белка можно рассматривать сферическими, вытянутыми или сплюснутыми. При этом вектор их поляризации (дипольный момент) можно считать или совпадающим с определяющей осью или ортогональным ей. Для сферической молекулы (нет определяющей оси) направление вектора поляризации не будет иметь никакого влияния на спектр ОИ. Ориентация молекулы внутри канала, к которому приложена разность потенциала, будет определяться электрической энергией молекулы, а также энергией тепловых флуктуаций. Соответственно распределение плотности вероятности возможных ориентаций будет задаваться согласно распределению Больцмана. Добавление электрического поля приводит к смещению в сторону ориентации дипольного момента вдоль оси поры. Алгоритм идентификации молекул белков по спектрам основан на аппроксимации распределения амплитуды ОИ конволюцией бимодального (флуктуация молекул внутри канала) и гауссового (приборный и Найквистовский шум). В качестве параметров аппроксимации используется дипольный момент молекулы. Аппроксимация проводится для всех возможных вариантов бимодального распределения (вытянутая, сплюснутая форма молекулы, а также дипольный момент совпадает с длинной осью или перпендикулярен ей). В итоге отбирается форма и направление момента, при котором аппроксимация дает наилучшее приближение. Чувствительность метода ОИ определяется двумя факторами - соотношением размеров белка и нанопоры, а также временем прохождения белка (длительностью сигнала ОИ). Использование пор с диаметром и длиной около 20 нм позволяет получать соотношение сигнал/шум, превышающее 10dB, для всех исследуемых молекул. При этом точность определения объема молекулы будет увеличиваться по мере увеличения размера самой молекулы. При длительности прохождения более 400 мкс ошибка определения электрического коэффициента формы белка, величины дипольного момента не превышает 30%. Важно, что данный метод позволяет работать с концентрациями молекул в диапазоне 1-10 нМ, если молекулы не связываются с поверхностью нанопоры, и в диапазоне 1-10 пМ, если поверхность нанопоры модифицирована липидным слоем, содержащим рецепторы к исследуемым молекулам белка. Требуемый объем материала при этом составляет несколько мкл. Стоит также отметить, что специфичность метода может быть обусловлена двумя факторами: 1) специфичностью сигнала - каждая молекула имеет свой отличный паттерн ОИ, 2) в случае модифицированных липидным бислоем молекул, за счет специфичности связывания с молекулой рецептора. В основе метод ПОВ в ОФК лежит специфическая адсорбция молекул аналита на поверхность однофотонного кристалла, которая достигается за счет его модификации молекулами рецептора. В данном случае принцип его действия не отличается от иммуно-флуоресцентного анализа. Но основное преимущество ПОВ в ОФК заключается в возможности работы с флуоресцентно не мечеными молекулами, а также использования меньшего количества анализируемого вещества. Таким образом методы ОИ и ПОВ в ОФК являются взаимодополняющими друг друга, так как в основе их функционирования лежит регистрация принципиально разных сигналов и определения разных параметров белка. Так метод ПОВ в ОФК может существенно облегчить задачу индетификации сферических молекул, анализ которых методами ОИ может быть затруднен. Кроме того, так как рабочие концентрации и объем образца, требуемые для двух методов лежат в одном диапазоне значений, они могут быть реализованы параллельно на базе одного чипа. Для реализации разделения пробы (отделения форменных элементов) в разрабатываемом микрофлюидном чипе, была проведена работа по адаптации технологии фильтрации для малых объемов пробы в системе микрофлюидных каналов. При разработке технологии разделения пробы в микрофлюидном чипе, проводились эксперименты на модельных системах с микрофильтрующими мембранами, изготовленными из полиэтилентерефталатных пленок марки «Hostaphan RNK 12», толщиной 12 мкм. В ходе исследований нами был разработан способ интеграции данной микрофильтрующей мембраны в систему микрофлюидных каналов чипа. Разработанная микрофлюидная система фильтрации пробы на микрофлюидном чипе представляет собой камеру, разделенную по горизонтали трековой микрофильтрующей мембраной. При процессировании микрофлюидного чипа в нижнюю часть данной камеры поступает проба, далее проба проходит сквозь мембрану, при этом объекты, характерный размер которых больше диаметра пор, остаются на мембране. Из-за малой толщины, мембрана может быть расположена между слоями адгезива, толщина мембраны при этом компенсируется эластичностью адгезива. В слоях адгезива также сформированы верхний и нижний резервуары фильтрующей камеры и ламели, поддерживающие мембрану и препятствующие ее деформации под воздействием давления и потока. В слоях ПЭТ находятся переходные отверстия, которые соединяют фильтрующую камеру с остальной системой микрофлюидных каналов чипа. Общий размер вклеиваемой мембраны составляет 17*22 мм. Мембрана раскраивается с помощью программируемого лазерного гравера Laser Pro GCC Spirit GLS 100, и совмещается с слоями адгезива при помощи вакуумного фиксатора (пинцета). В ходе исследовательской работы нами экспериментально были подобраны такие параметры как: a) площадь мембраны, b) диаметр пор мембраны и c) доля площади поверхности мембраны, занятая порами. Работоспособность микрофлюидной технологии фильтрации крови была протестирована и подтверждена на модельной системе. При этом осуществлялась прокачка пробы объемом 55 мкл через микрофлюидный чип с объемной скоростью перемещения жидкости 0,1 мкл/с. Данная скорость прокачки согласована с временем инкубации пробы с связывающими агентами. При этом мембрана не потеряла структурной целостности, а давления, созданного шприцевым насосом оказалось достаточно для прокачки всего объема пробы. Конформационные изменения отдельных молекул белка на поверхности каналов микрофлюидного диагностического чипа были визуализированы и охарактеризованы на модельной системе (поверхности высокоориентированного пиролитического графита, модифицированного производной олигоглицина [Gly4-NHCH2]2C10H20, GM-ВОПГ) с использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ). Десорбция небольшой части молекул фибриногена наблюдалась в течение нескольких минут после их адсорбции на поверхности GM-HOPG. Однако большинство белковых молекул оставалось на поверхности после их адсорбции и претерпевало конформационные изменения, такие как постепенное превращение глобулярных структур в фибриллярные. Такие изменения можно интерпретировать развертыванием фибриногена, т. е. потерей третичной структуры белка. Разворачивание отдельных молекул фибриногена в фибриллы обычно наблюдается в течение 4-16 минут после адсорбции молекул. Развертывание фибриногена на поверхности GM-HOPG сопровождается уменьшением высоты белка. Средняя высота фибриллярных структур составила 1,26 ± 0,24 нм. Десорбция фибриллярных структур фибриногена не наблюдалась. Различные глобулярные области одной и той же молекулы фибриногена разворачиваются независимо друг от друга. Интервал времени между развертыванием глобулярных областей составляет от 2 до 10 мин. Поверхность GM-ВОПГ изменяет ее поверхностные свойства (такие как заряд, трение, адгезия и т. д.), которые могут влиять на поведение адсорбированных белков. Одним из основных факторов, влияющих на белково-поверхностные взаимодействия, является площадь контакта, которая может варьироваться от молекулы к молекуле из-за асимметричной формы молекулы фибриногена, неоднородности поверхности и стохастической природы адсорбции белка. Большие площади контакта белка с поверхностью приводят к более сильной адсорбции молекул белка и более скорому их разворачиванию. Атомарно-гладкие поверхности слюды и графита являются идеальными субстратами для микроскопических наблюдений молекул ДНК, но из-за ограничений в физико-химических свойствах (графит – предельно гидрофобен) обычно используются в сочетании с модификаторами – олиго- или полимерными веществами, образующие однородные мономолекулярные поверхностные пленки толщиной ~1 нм. Считается общепринятым, что при адсорбции на такие пленки базовая двухспиральная структура ДНК остается неизменной, претерпевая лишь небольшие изгибные деформации. Вместе с тем, многочисленные опубликованные АСМ изображения ДНК содержат большое количество сильно изгибных участков в разительном противоречии с ожиданиями WLC модели. В нашей работе была поставлена цель понять причину многочисленных изгибных аномалий. Было выяснено, что единственным фактором, существенно влияющем на появление и величину изгибных аномалий, является ионная сила раствора, из которого проводилась адсорбция. Продемонстрирована зависимость данного эффекта от Дебаевского экранирования. При этом амплитуда изгибов оказывалась малой при больших ионных силах, увеличивается при уменьшении ионной силы и выходят на насыщение при малых ионных силах. В другой серии измерений было обнаружено, что пленка модификатора, кажущаяся однородной на топографических изображениях является вероятнее всего двуслойной системой, так как при адсорбции на графит при малых концентрациях модификатор всегда образовывал эпитаксиальные ламеллярные структуры шириной ~4 нм . Показано, что пленки модификатора графита в основании содержат эпитаксиальный ламеллярный подслой, с сильно анизотропным электростатическим взаимодействия с ДНК. Обращает на себя внимание, что Дебаевский радиус сопоставим с шириной ламелей (RD(5mM)=4nm). Изгибность в наномасштабе появляется вследствие противоположно направленных изгибных моментов в середине ламели и на краях в точках пересечения. Из-за анизотропии взаимодействия величина изгиба растет при уменьшении угла между ДНК и ламелями. Кроме того, качественно объясняется зависимость эффекта от ионной силы раствора, так как при больших ионных силах происходит экранирование электростатических сил взаимодействия ДНК с ламелями, приводящее к уменьшению изгибных моментов. Разработанная модель впервые демонстрирует важность учета влияния на конформацию ДНК латеральных сил. Кроме того, модель предсказывает, что при уменьшении угла между ДНК и ламелями происходит резкое увеличение изгибного момента (~1/θ при малых углах), который, таким образом, может достичь критического порога образования кинков в ДНК. Наконец, в работе проведено исследование структуры нетканых полимер-белковых пленок методами микроскопии и спектроскопии для последующего использования их в микрочипах в качестве функционализированных мембран. Мы использовали рамановскую микроспектроскопию для того, чтобы проверить, насколько однородно распределены две компоненты (полилактид и желатин) в составе пленки. Результаты показали, что что в спектрах полилактида и желатина присутствуют характеристические пики. Наиболее удобные из них – это пик вблизи 1665 см-1 (характерный для белков пик колебаний пептидной связи) и пик вблизи 1765 см-1 (он соответствует колебаниям связи С=О и не регистрируется в спектре желатина). В спектрах, полученных от волокон смеси полилактида и желатина, наблюдались оба эти пика, т.е. в каждом из исследованных волокон присутствовали обе компоненты. Методическая значимость этой работы состояла в том, что мы предложили способ регистрации рамановских спектров от отдельных волокон. Мы продемонстрировали, что дезинфекция этанолом может улучшить механические свойства пленок из полилактида и показали, что этанол является эффективным пластификатором для полилактида. Если проинкубировать образец в спирте в изометрических условиях или в свободном состоянии, высушить и подвергнуть деформации, то его предельное удлинение также возрастает. Таким образом, обработка спиртом делает нетканые пленки из полилактида более пластичными. Эта особенность была использована, чтобы выстраивать волокна вдоль одного направления. Существует традиционный способ изготовления ориентированных волокон – использование двух параллельных лезвий в качестве коллектора. Он обеспечивает выстраивание волокон вдоль одной линии, но в образце неизбежно оказываются волокна, направление которых случайно. Если деформировать нетканую пленку из полилкатида на воздухе, то нельзя добиться значительной ориентации волокон, т.к. пленка порвется уже приблизительно при ~50% деформации. Зато вытяжка в спирте делает волокна практически параллельными. Перечисленные закономерности подтверждаются количественной обработкой изображений, полученных на СЭМ.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В плазме крови больных с острой хирургической патологией и андрогенетической алопецией методом иммуноферментного анализа исследовано содержание белков острой фазы воспаления и белков-маркеров окислительного стресса (миелопероксидазы, фибриногена, интерлейкинов -6, -8, -10) в зависимости от выраженности воспалительной реакции организма. Продемонстрировано, что выявленные маркеры воспаления и окислительного стресса могут служить основой для создания микрочипов и тестовых систем на основе микрофлюидных технологий. Разработан экспериментальный протокол исследования активности одиночных белков и белковых комплексов в режиме “реального времени” в процессах, связанных с деформацией и топологической перестройки мембран [Bashkirov P.V. et al Nature Protocols 2020]. Данный протокол объединяет ряд уникальных экспериментальных методик, включая быстрое определение изменений геометрических и механических параметров мембранной нанотрубки под воздействием различных белков, измерение таких характеристик белка, как его размер, эффективная спонтанная кривизна. Был проведен эксперимент по мультиплексному одновременному обнаружению биохимических реакций в 96 точках в режиме “реального времени”. Разработан протокол, позволяющий исключить влияния эффектов неспецифической адсорбции и изменения объемного коэффициента преломления раствора аналита на результат измерения. Проведен анализ взаимодействия фибриногена с миелопероксидазой. Образование фибриноген-миелопероксидазных комплексов происходит в течение нескольких секунд. Показано, что каждая внешняя глобулярная область молекулы фибриногена может самостоятельно связывать молекулу миелопероксидазы. Обнаружено разворачивание фибриногеном миелопероксидазой. На примере разворачивания фибриногена, индуцированного миелопероксидазой, показано, что разворачивание белка может быть опосредовано контактом с другим белком. В связи с высокой биосовместимостью и нетоксичностью белков, их использование в качестве фактора, вызывающего разворачивание белка, может представлять особый интерес для биотехнологий и медицины. Разработана методика измерения ионного тока тяжей ДНК. Данная методика основана на вытягивании тяжей ДНК между двумя электродами, помещенными в раствор, с помощью ультрачувствительных наноманипуляторов. Получены вольт-амперные характеристики ДНК-тяжей на воздухе и в масле, которые проявляют диодные характеристики. Выявлено увеличение сопротивления тяжей ДНК при их вытягивании. Установлено влияние геометрии системы (в частности, симметрии системы) на поведение ионной проводимости ДНК. Полученные результаты могут быть использованы для разработки нового типа основанных на ДНК электронных устройствах, использующих ионный ток вдоль ДНК. Кроме того, инвертированный ДНК-капилляр может быть использован для контролированного переноса и секвенирования небольших нуклеотидных последовательностей и белковых молекул, что востребовано в разных биотехнологических приложениях. Была представлена визуализирующая модификация биосенсора на поверхностных волнах в одномерном фотонном кристалле. Данный подход позволяет проводить безмаркерную диагностику белок-белкового взаимодействия одновременно для большого числа антител. Антитела наносятся на поверхность чипа одномерного фотонного кристалла в виде микроспотов, после чего через систему пропускается аналит. Анализ сигнала от отдельного пятна позволяет определить наличие или отсутствие интересующего вещества в аналите. Было продемонстрировано мультиплексное одновременное обнаружение биохимических реакций в 384 точках с помощью биосенсора на поверхностных волнах в одномерном фотонном кристалле. Было показано, что чувствительность данной системы выше, чем у аналогов, основанных на возбуждении поверхностных плазмонных волн на поверхности металла. Также были получены электроформованные пленки с различной укладкой волокон: обычные матриксы со случайно уложенными волокнами, ориентированные матриксы, состоящие из практически параллельных волокон, и структурированные матриксы, в которых чередуются области с различной укладкой. Все матриксы изготовлены из полилактида или из смесей на его основе, для встраивания в микрофлюидные чипы были изготовлены матриксы из нейлона 6. Ориентированные электрофоромованные матриксы из полилактида были использованы как субстраты для культивирования клеток. Методом СЭМ показано, что на матриксах, состоящих из ориентированных волокон, клетки (кератиноциты человека линии HaCaT) вытягиваются вдоль направления волокон. Сопоставлен рост клеток HaCaT на “обычных” и структурированных матриксах из смеси полилактида и желатина. Методом флуоресцентной микроскопии показано, что обычные матриксы лучше поддерживают пролиферацию клеток, чем структурированные. Показано, что электроформованный матрикс из нейлона может быть использован в качестве элемента диагностического микрофлюидного чипа, предназначенного для выявления антител в пробе. Матрикс использован в качестве мембраны, на которой иммобилизованы микросферы, несущие на своей поверхности антиген.