Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Согласно плану работ было проведено изучение действия известных антагонистов канала ASIC3 при различных способах активации канала – при «классическом» снижении рН среды от значений 7.8 до 5.5 и при «непротонной» активации при аппликации недавно открытого нами эндогенного изохинолинового алкалоида – ретикулина (Osmakov et al. Front Mol Neurosci. 2017). Показано, что пептидные ингибиторы ASIC3 канала, пептиды APETx2 и Ugr9-1 в концентрациях 1 мкМ и 20 мкМ, соответственно, вызывают значительное (около 70 %) ингибирование десенситизации тока, вызванного 1 мМ ретикулина, однако, не оказывают эффекта на амплитуду тока. Низкомолекулярный ингибитор ASIC3 канала, севанол, в концентрации 1 мМ практически полностью (90%) ингибирует ток, активируемый ретикулином. При стандартной активации канала ASIC3 протонами APETx2 проявляет дозозависимое ингибирование быстрой компоненты тока (IC50 0.3 мкМ), Ugr9-1 и севанол дозозависимо ингибируют быструю и медленную компоненты тока (IC50 9.1 и 1.9 мкМ для Ugr9-1 и 330 и 260 мкМ для севанола). Таким образом, общий ингибирующий эффект севанола при «непротонной активации канала сохраняется, в то время как эффект пептидных антагонистов существенно зависит от способа активации канала. Изучение активности открытого нами в конце 2017 года нового «непротонного» активатора канала ASIC3, линдолдхамина (Osmakov at al., Br J Pharmacol. 2018;175(6):924-937. doi: 10.1111/bph.14134), на различных подтипах гомомерных каналов ASIC показало, что в концентрациях 0.1 - 1 mM линдолдхамин существенно (30-40%) ингибирует протон-вызванные токи через ASIC1a, ASIC1b, а также значительно уменьшает максимальную амплитуду тока ASIC2а (35-60%). По-видимому, линдолдхамин конкурирует с протонами за за общий или частично перекрывающийся сайт связываания. Недавно полученные данные об эндогенных веществах различной химической природы, которые способны модулируют активность ASICs, свидетельствуют о наличии сложной взаимосвязи кислото-чувствительных рецепторов с другими рецепторными системам. Поскольку ретикулин вовлечен в цикл синтеза эндогенных опиоидов, нами была проведена проверка перекрестной активности ретикулина на мю-, дельта- и каппа-опиоидные рецепторы. В экспериментах на экспрессированных рецепторах было показано, что в милимолярных концентрациях ретикулин не оказывал действия на опиоидные рецепторы. С другой стороны, основываясь на анализе литературных данных и данных общедоступных структурных баз, нами был проведен поиск потенциальных соединений, способных взаимодействовать с каналами ASICs. Были выбраны соединения, которые проявляли биологические эффекты на животных, подобные эффектам антагонистов ASICs, проверена их активность по отношению к каналам ASIC. Часть выбранных молекул (прегабалин, куркумин, габазин, Субстанция Пи) оказались не активны. Однако, были обнаружены два новых уникальных модулятора ионных каналов ASIC - дауризолин, который имеет структурное сходство с молекулой ретикулина, и аналог энкефалина - MPRпептид. Их фармакологическая активность была частично охарактеризована в электрофизиологических экспериментах. Оба соединения оказывают на протон-активируемые каналы действие, которое не имеет опубликованных аналогов. Для проведения масштабных биологических испытаний все лиганды каналов ASIC были получены в полупрепаративных количествах, для чего были разработаны методы их получения - многоступенчатый химическый синтез для THP и ретикулина, схема выделения природного линдолтхамина, метод твердофазного синтеза MPRпептида и RF-амидного пептида, биотехнологический способ получения рекомбинантных дисульфид стабилизированных пептидов APETx2 и Urg9-1. Изучена активность агонистов и антагонистов ионных каналов ASICs на животных моделях. Показано, что «непротонные» активаторы каналов ASIC (MPRпептид или THP) не вызывают болевого или анальгетического эффекта при введении в дозе 1 мг/кг в подушечку лапы мыши. Линдолдхамин проявляет значительный анальгетический эффект в тесте на тепловую гиперчувствительность при воспалении, вызванном введением адьюванта Фрейнда и не проявляет значительной активности в тесте «уксусные корчи» в дозе 1 мг/кг при внутривенном способе введения, что может свидетельствовать о локализации основной мишени линдолдхамина в нейронах ЦНС, а не на периферических нейронах. Также было показано, что при интраназальном способе введения ретикулин проявляет выраженную анальгетическую и противовоспалительную активность. Было изучено биологическое действие пептидных и низкомолекулярных ингибиторов каналов ASIC3 (APETx2, Ugr9-1, диклофенак (как препарата сравнения) и севанол): в экспериментах «открытое поле» исследованные лиганды не нарушают опосредованное ЦНС поведение; в тесте «уксусные корчи» все исследованные соединения в дозе 1 мг/кг оказывали сильное анальгетическое действие, при этом дозозависимый анализ показал колоколообразный профиль активности для APETx2 и линейную зависимость эффекта от дозы для севанола; в тестах на тепловую гиперчувствительность при воспалении, вызванном введением адьюванта Фрейнда диклофенак и APETx2 в дозах 1 мг/кг показали одинаковую эффективность анальгезии, превышающую анальгетическую активность севанола и Ugr9-1, при этом токсин APETx2 обладал способностью достоверно снимать отек лапы при различных концентрациях. Полученные результаты были опубликованы в журнале Marine Drugs (Andreev at al. Analgesic Activity of Acid-Sensing Ion Channel 3 (ASIС3) Inhibitors: Sea Anemones Peptides Ugr9-1 and APETx2 versus Low Molecular Weight Compounds. Mar. Drugs 2018, 16(12), 500; https://doi.org/10.3390/md16120500) Таким образом, показано, что агонисты каналов ASICs при действии на периферические нейроны не способны вызывать альгезию, а при проникновении в ЦНС способны вызывать анальгетический эффект подобно антагонистам канала. Дополнительно к заявленному плану в рамках тематики проекта был продолжен поиск новых модуляторов ASICs в природных источниках, таких как яды морских и наземных животных и лекарственные растения. Проведена первичная характеристика новых пептидных ингибиторов каналов ASIC1a из яда актинии Urticina sp. aff. Urticina coriacea. В отсутствии специфичных ингибиторов каналов ASIC1a дальнейшая характеристика найденных активных молекул является весьма актуальной. Результаты представлены в статье - И. Н. Гладких, А. Н. Кветкина, Е. Е. Костина, Р. С. Калина, Б. Б. Гребнев, С. Г. Кошелев, С. А. Козлов, М. М. Монастырная, Э. П. Козловская Пептидные модуляторы ASIC каналов актинии Urticina sp. aff. Urticina coriacea (Cuvier, 1798) из Охотского моря. Биология Моря 2018 т.44, №6, 395-401 Doi 10/1134/SO134347518060049.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Проведено детальное изучение активности двух алкалоидов дауризолина (DAU) и линдолдхамина (LIN) на каналах ASIC1a крысы, получены экспериментальные данные, характеризующие как активность алкалоидов, так и новые фармакологические свойства каналов в целом. Выявлено, что DAU сдвигает зависимость активации от pH в сторону более кислых значений, но этот эффект сочетается со сдвигом кривой постоянной кислотной инактивации (SSD) в сторону более кислых значений pH, что приводит к повышению возбудимость каналов в небольшом кислотном диапазоне pH от 6,8 до 7,2. DAU активирует канал ASIC3 и не вызывает активацию подтипа ASIC1a крысы. Необычное действие DAU выражается в расщеплении «пиковой» компоненты тока ASIC1a крысы на две ярко выраженные и десенсетизируемые компоненты при ответе канала на закисление. LIN, структурно родственный DAU, не вызывает образования второго пикового компонента у ASIC1a крысы. Показано, что LIN эффективно ингибирует токи ASIC1a, активированные небольшими кислотными раздражителями, при этом эффективность ингибирования LIN коррелирует с силой применяемого кислотного стимула. Основное действие LIN на канал заключается в смещении кривой протонной активации ASIC1a в сторону более кислой области. В тестах на животных показана эффективность LIN в модели воспалительной боли. 2. Разработана оптимальная схема синтеза синтетичесткого севанола (s706), получено несколько производных севанола - s788, s590, эпифилловая кислота (EA), отличающихся от исходной молекулы количеством доступных кислотных групп. Проведено тестирование активности синтетичесткого севанола и его структурных аналогов на каналах ASIC1a и ASIC3, которое показано, что укороченные аналоги севанола активны на экспрессированных каналах. Проверена активность аналогов севанола на животной модели «уксусные корчи». Все протестированные аналоги севанола показали свою эффективность в качестве анальгетиков при двух различных способах введения - внутривенном и интраназальном. Наименьшая активность наблюдалась у соединения s788, которое не ингибировало каналы, экспрессированные в ооцитах лягушки. 3. Проведен поиск новых молекул, способных взаимодействовать с кислото-чувствительными каналами. В коллекции синтезированных эндогенных нейропептидов обнаружена активная молекула – 35-членный пептид ноцистатин из крысы, который проявляет яркое активирующее действие на все типы каналов ASIC без исключения. Показано, что протоны и ноцистатин влияют на ASIC аналогичным образом, вызывая токи с подобными характеристиками. Основные различия наблюдаются в скорости десенситизации вызванных токов. Установлено, что по сравнению с протонами ноцистатин вызывает: (а) более быстрый десенситизирующийся ток на ASIC1a, (б) более быстро активируемый ток с большей амплитудой, чем реакция на закисление pH 7,4-5,5 на ASIC2a; (в) более медленно активируемый и десенситизируемый ток с небольшим уменьшением амплитуды на ASIC3, при этом у этого подтипа также меняется форма ответа. Совпадение характеристик токов, индуцированные ноцистатином и протонами, может свидетельствовать о сходных механизмах, контролирующих функционирование каналов ASIC, который может, в зависимости от условий, отвечать на уровень кислотности среды снаружи клетки, так и реагировать на изменение концентрации эндогенного лиганда. Таким образом, обнаруженный нами первый прямой агонист ASIC-каналов - эндогенный нейропептид ноцистатин – может стать основой для разработки новой фармакологической стратегией для лечения воспалительных и нейродегенеративных заболеваний. По результатам одной из публикаций (Osmakov at. al. Biomolecules. 2019, 22;9(9). pii: E401) был подготовлен пресс-релиз, опубликованный на сайте РНФ (http://rscf.ru/ru/node/molekula-boli?sphrase_id=32677). Также в в СМИ опубликован ряд новостей с обзором полученных результатов работы. Список ссылок в сети интернет: https://indicator.ru/biology/notsistatin-oblegchenie-boli-11-09-2019.htm https://naukatv.ru/news/25889 https://russian.rt.com/science/article/667520-uchyonye-obnaruzhili-molekulu-boli https://www.gazeta.ru/science/news/2019/09/12/n_13455007.shtml https://www.poisknews.ru/news/odna-iz-molekul-nervnoj-sistemy-vliyaet-na-oblegchenie-boli-vyyasnili-rossijskie-uchenye/

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
За отчетный этап проведено получение новых лигандов и изучение механизмов функционирования двух подтипов протон-активируемых ионных каналов - ASIC1a и ASIC3. Из экстракта морской анемоны Metridium senile с использованием многостадийной хроматографии выделен полипептид MS 5.4, ответственный за общий потенцирующий эффект исходного экстракта на протон-активируемые токи через экспрессированные каналы ASIC1a. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность нового полипептида из 21 а.о., не имеющая выраженной гомологии с известными токсинами. Пептид MS 5.4 является уникальным как по механизму действия, так по структуре, представляет новый структурный тип пептидных модуляторов каналов ASIC. Для низкомолекулярных лигандов (аналоги Севанола) оптимизированы способы их получения химическим синтезом, синтезирован новый аналог s414, представляющий собой диэтиловый эфир эпифиловой кислоты (ЕА). Определены основные параметры лиганд-рецепторного взаимодействия. В случае ASIC1a крысы эффективность ингибирования протон-вызванных токов Севанолом и его аналогами s590 и ЕА отличалась непринципиально - IC50 составила 230- 415 мкM при полном блоке проводимости высокими концентрациями лигандов, аналог s414 ингибировал вызванный ток только наполовину и имел IC50 3,5 мM. Эффективность ингибирования (значение IC50) вызванного протонами тока через ASIC3 крысы падала в ряду анализируемых лигандов - 175 мкM (севанол), 241 мкM (s590), 424 мкM (ЕА), тогда как s414 не ингибировал вызванный ток совсем. Не смотря на различную эффективность в тестировании на экспрессированных каналах in vitro, измеренная активность севанола и его аналогов in vivo в двух моделях (острой боли от введения кислоты и нейрогенного воспаления) была сопоставима. Проведен анализ активности севанола и его аналогов при различных способах аппликации - 2 неинвазивных (внутривенное и внутримышечное введение) и 2 парентеральных (интраназальное и пероральное введение). При всех способах введения исследуемые вещества обладали выраженной анальгетической активностью. Наименьшая активная доза веществ в тесте уксусные корчи, достоверно отличавшаяся от контрольной группы, получавшей физраствор, составила: - при внутривенном введении: Севанол – 0,1 мг/кг, s590 – 0,01 мг/кг, s414– 0,01 мг/кг, ЕА – 0,01 мг/кг; - при пероральном введении: Севанол – 0,01 мг/кг s414 -– 0,1 мг/кг, ЕА – 0,1 мг/кг; - при интраназальном способе введения: Севанол – 0,1 мг/кг, s590– 0,01 мг/кг, ЕА– 0,1 мг/кг. Наименьшая активная доза веществ в тесте на гиперчувствительность, вызванную введением полного адьюванта Фрейнда, достоверно отличавшаяся от контрольной группы, получавшей физраствор, составила следующие значения: - при внутримышечном введении: Севанол – 0,1 мг/кг, s414– 0,01 мг/кг; - при пероральном введении: Севанол – 0,1 мг/кг, s414– 0,01 мг/кг, ЕА – 0,01 мг/кг; - при интраназальном введении: Севанол – 0,5 мг/кг, s590– 0,05 мг/кг, s414– 0,005 мг/кг, ЕА – 0,5 мг/кг. Таким образом, Севанол и его аналоги являются эффективными анальгетиками, без выявленных на данный момент побочных действий, что делает их конкурентно способными с существующими анальгетическими препаратами, и могут быть рекомендованы для практического внедрения как пероральные анальгетики. По результатам проведенных биологических тестов подана заявка на патент РФ. Проведено изучение изоформ ASIC3 человека и крысы на предмет различий в ответе канала на активацию в зависимости от субъединичного состава конечного тримерного комплека. Для жесткой фиксации состава были разработаны и экспрессированы конкатемерные («сшитые» из трех субъединиц в один слитный белок) каналы. При сборке конкатемерных каналов смешанного состава эффект значительного усиления пиковой компоненты тока (характерной для канала крысы, но не человека) наблюдался для канала, состоящего из последовательности субъединиц человеческая-человеческая-крысиная, тогда как канал, состоящий из последовательности субъединиц крысиная-человеческая-крысиная, имел наименьшую постоянную компоненту тока. Получены данные о влиянии С-концевого внутриклеточного домена канала ASIC3 человека на форму ответа при активации протонами или пептидными агонистами. Показано, что удаление С-концевых остатков канала приводит к изменению формы ответа канала при активации, которое выражается в значительном увеличении амплитуды пиковой компоненты тока при оставлении постоянной компоненты тока в неизменной форме.