Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Длительная история исследования влияния катехоламинов на различные физиологические процессы, неоднозначность их трактовки, использование адренергических препаратов в клинической практике ставит вопрос о механизмах действия этих соединений на различные структурные функционально важные элементы живого организма. Нервно-мышечный синапс играет ведущую роль в обеспечении локомоторной, дыхательной функций, а также в поддержании позы. Процесс передачи информации от аксона к мышечному волокну обеспечивается сложным механизмом нейросекреторного аппарата, который подвержен различным модуляторным воздействиям, но должен обеспечивать надежность и пластичность синаптической передачи. В связи с этим важно понимание каким образом катехоламины могут влиять на функции синаптического аппарата. Проведенное в рамках проекта РНФ исследование показало, что в нервно-мышечном синапсе теплокровных эффекты адреналина, норадреналина– медиаторов, которые в организме вырабатываются эндогенно – зависят от функционального типа мышцы и режима ее ритмической активности. Так, в синапсах дыхательной мышцы, содержащей как «быстрые», так и «медленные» волокна, адреномиметики адреналин, норадреналин и специфические агонисты отдельных подтипов адренорецепторов вызывают угнетение спонтанной квантовой секреции ацетилхолина путем изменения активности α1, α2 и β1 адренорецепторов. В модуляции адреномиметиками вызванного нервным стимулом освобождения квантов ведущую роль играют рецепторы α2, β1 и β2 подтипов, их активация может приводить как к повышению интенсивности секреции, так и ее снижению. В условиях ритмической стимуляции двигательного нерва, характерной для работы синапса в физиологических условиях, норадреналин усиливал синаптическую депрессию. Помимо влияния на количество освобождаемых квантов ацетилхолина впервые установлено, что адреномиметики вызывали изменения временного хода секреции, приводя к десинхронизации выделения квантов, увеличивая время нарастания переднего фронта многоквантового постсинаптического ответа. В реализации этого эффекта принимают участие рецепторы α2 и β2 подтипов. Активация этих рецепторов приводит к замедлению скорости проведения потенциала действия по аксону. В отличие от синапсов дыхательной мышцы, в синапсах мышцы Levator auris longus, имеющей преимущественно «быстрые» волокна, под действием норадреналина наблюдалось повышение интенсивности как спонтанного, так и вызванного нервным импульсом освобождения квантов ацетилхолина. При этом не происходило изменения временных параметров квантовой секреции медиатора. В синапсах локомоторной мышцы с «медленным» типом волокон Soleus под действием норадреналина происходило возрастание интенсивности спонтанной секреции квантов, которая характеризует состояние секреторного аппарата в покое. При ритмической стимуляции двигательного нерва с низкой частотой действие норадреналина приводило к повышению интенсивности вызванного освобождения квантов, в отличие от синапсов диафрагмальной мышцы. При этом локомоторная мышца оказалась более чувствительной к адреномиметику, чем дыхательная, поскольку в ней синаптическая депрессия при высокочастотной стимуляции нерва была более выражена под действием норадреналина, чем в дыхательной. Временной ход секреции квантов в синапсах мышцы Soleus претерпевал изменения в сторону повышения несинхронности выделения квантов ацетилхолина. Проведенные дополнительные исследования связи эффектов норадреналина на временной ход секреции квантов ацетилхолина с работой потенциал-зависимых кальциевых каналов в синапсах лягушки показали, что при блокаде нитрендипин-чувствительных каналов L-типа синхронизирующее действие адреномиметика не проявляется. Это позволяет предполагать, что и в синапсах теплокровных действие катехоламинов может быть связано с активностью потенциал-зависимых каналов, и прежде всего, кальциевых. Результаты проведенных исследований убедительно показывают, что катехоламины оказывают влияние на процесс синаптической передачи возбуждения и работу нейросекреторного аппарата в нервно-мышечных соединениях мыши и крысы. Направленность и выраженность эффектов зависят от функциональной принадлежности мышцы и типа волокон, входящих в ее состав. Действие специфических агонистов и антагонистов, влияющих на активность разных подтипов адренорецепторов, указывает на их совместное сосуществование в пределах одного синапса. Обнаруженное впервые в синапсах теплокровных влияние катехоламинов на временной ход секреции необходимо учитывать при анализе действия этих соединений на процессы синаптической передачи. Таким образом, при использовании катехоламинов в клинической практике необходимо принимать во внимание, что они могут оказывать влияние на локомоторную и дыхательную мускулатуру.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе выполнения второго этапа проекта были продолжены исследования особенностей и механизмов модулирующего влияния катехоламинов на параметры спонтанной и вызванной секреции квантов ацетилхолина из двигательных нервных окончаний в синапсах мышц разного функционального профиля. Поскольку вход ионов кальция в нервное окончание является процессом, запускающим экзоцитоз синаптических везикул, то очевидно было предположить, что наблюдаемые в предыдущих исследованиях эффекты адренергических соединений могут изменяться при варьировании внеклеточного содержания кальция. Выполненный анализ зависимости изменения параметров квантовой секреции в синапсе диафрагмальной мышцы показал наличие реципрокных взаимодействий между входом кальция и временными параметрами секреции – при понижении внеклеточной концентрации кальция эффект норадреналина на кинетику секреции возрастал. Использование методов современного флуоресцентного анализа с помощью специфического кальций-чувствительного красителя позволило оценить, как изменяется вход ионов кальция в нервное окончание в ответ на нервный стимул при действии адренергических соединений. Оказалось, что под действием норадреналина кальциевый сигнал не изменял свою амплитуду. А в присутствии активатора α2-адренорецепторов происходило снижение кальциевого ответа, что свидетельствует в пользу участия этого подтипа рецепторов в реализации угнетающего квантовую секрецию действия адренергических агентов посредством снижения входа ионов кальция в нервное окончание. В ответ на нервный импульс кальций входит в нервное окончание через потенциал-зависимые кальциевые каналы и запускает процесс секреции квантов медиатора. Поэтому одним из этапов исследования механизмов действия адренергических соединений стал анализ участия потенциал-зависимых кальциевых каналов в реализации эффектов катехоламинов. Блокада потенциал-зависимых кальциевых каналов P/Q типа не устраняла влияние активатора α2-адренорецепторов на квантовый состав и временной ход секреции, но при этом полностью исчезало снижение спонтанной секреции, вызываемое дексмедетомидином. При блокировании потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа также сохранялось действие агониста на квантовый состав, но устранялось изменение временных параметров секреции. Полученные данные в очередной раз подтверждают выдвинутую нами ранее гипотезу (Bukcharaeva et al., 1999; Bukharaeva et al., 2004) о наличии разных механизмов, участвующих в модуляции количества освобождающихся квантов медиатора и временных параметров их секреции. Фармакологический анализ эффектов адренергических соединений в синапсах диафрагмальной мышцы, выполненный на первом этапе проекта, показал, что они могут реализовываться через разные подтипы адренорецепторов. Проведенное на данном этапе исследование с помощью Вестерн-блоттинга и иммунофлуоресцентного метода при использовании специфических антител к разным подтипам адренорецепторов выявил наличие в препарате диафрагмальной мышцы α1A; β1; α2A, α2B, α2C, α1B подтипов адренорецепторов и фермента тирозин гидроксилазы, участвующего в синтезе норадреналина, колокализованного с синаптическим контактом. Таким образом, различия в направленности и выраженности эффектов адренергических соединений на параметры квантовой секреции ацетилхолина, которые мы наблюдаем при исследовании их «доза»-зависимости, в синапсах мышц разного функционального профиля, могут быть обусловлены как включением, так и десенситизацией адренорецепторов разных подтипов., что приводит включению многообразных внутриклеточных каскадов, активируемых или ингибируемых при активации разных подтипов адренорецепторов. Так, ранее нами было показано, что в синапсах лягушки при активации норадреналином β1 подтипа рецепторов происходила синхронизация процесса выделения квантов медиатора, обусловленная повышением активности аденилатциклазы и увеличением уровня внутриклеточного цАМФ (Bukcharaeva et al., 1999; Bukharaeva et al., 2002). Однако, в синапсах мыши повышение цАМФ за счет его входа в терминаль при обработке препарата проникающим дибутирильным производным не приводило к изменению параметров секреции. В то же время, при блокаде α2-адренорецепторов повышение уровня цАМФ в клетке воспроизводило эффекты активации β2 подтипа адренорецепторов, вызывающие увеличение несинхронности секреции квантов ацетилхолина. Полученные в ходе выполнения второго этапа проекта данные подтверждают нашу концепцию, объясняющую особенности модуляции нейросекреторного процесса адренергическими соединениями наличием разных подтипов адренорецепторов в области синаптического контакта, изменение активности которых запускает различные внутриклеточные каскады.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения третьего этапа проекта были продолжены исследования модулирующего влияния адреналина, норадреналина и соединений, специфически активирующих или блокирующих адренорецепторы разных подтипов, на параметры передачи возбуждения в синапсах мышц разного функционального профиля. Полученные в последние десятилетия с помощью современных методов иммунофлуоресцентной и конфокальной микроскопии данные о тесной колоколизации нервно-мышечных синапсов скелетной мускулатуры с окончаниями симпатических нервов (Khan et al., 2016; Rodrigues et al., 2019) поставили задачу выяснения в каких количествах могут содержаться эндогенные катехоламины в непосредственной близости к синапсу. Использование методики иммуноферментного анализа и набора специфических реактивов для определения количественного содержания адреналина и норадреналина в среде позволило определить, что даже в отсутствие стимуляции двигательного нерва в растворе, перфузирующем нервно-мышечный препарат диафрагмальной и локомоторной мышц мыши, содержалось в среднем 12 пг/мл адреналина и 62 пг/мл норадреналина. Эти значения близки по величине к тем, которые определяются при анализе катехоламинов в человеческой крови. Стимуляция двигательного нерва и/или ингибирование фермента моноаминоксидазы, разрушающей катехоламины, приводили к заметному росту содержания катехоламинов в околосинаптической среде. Аналогичные изменения происходили и в гомогенатах нервно-мышечных препаратов, количество катехоламинов, в которых, естественно, было выше, чем в перфузионном растворе. Таким образом, мы впервые подтвердили данные микроскопии о том, что симпатические нервные окончания, которые подходят близко к концевой пластинке, в синаптическом контакте выделяют эндогенные катехоламины и поэтому вполне способны оказывать модулирующее действие на синаптическую передачу. Ранее мы показали, что адренергические соединения, изменяющие активность адренорецепторов разных подтипов, влияют на процесс секреции квантов нейромедиатора ацетилхолина из двигательных нервных окончаний. На данном этапе исследований был поставлен вопрос о возможном действии этих соединений на параметры постсинаптической мембраны мышечного волокна – проводимость и время жизни ацетилхолинового рецепторно-канального комплекса. Предпосылкой для этого исследования стали данные о том, что активация адренорецепторов может приводить к изменению мембранного потенциала мышечного волокна (Cheng et al., 1977; Clausen, Flatman, 1977; Edstrom, Phillis, 1981) и влиять на состояние ацетилхолиновых рецепторов концевой пластинки (Clausen et al., 2016). Полученные нами данные показали, что в синапсах диафрагмы активация α1 и β1 подтипов рецепторов не изменяет параметры работы ацетилхолинового рецепторно-канального комплекса. Специфический агонист α2 адренорецепторов вызывал ускорение спада ионного тока, а блокатор, напротив, затягивал спад и предотвращал эффект активатора, что указывает на изменение времени жизни открытого состояния ионного канала, сопряженного с ацетилхолиновым рецептором. Поскольку мы выявили наличие эндогенных адреналина и норадреналина в области синаптического контакта, то естественно было посмотреть, вызовет ли устранение симпатической иннервации изменения в параметрах синаптической передачи. Введение резерпина внутрибрюшинно снижает выход катехоламинов в синаптическую щель, что приводит, как правило, к ослаблению адренергических влияний на эффекторные системы периферических органов (Martínez-Olivares et al., 2006). На этом фоне можно ожидать усиление действия экзогенно вводимых активаторов адренорецепторов на синаптические процессы в нервно-мышечном синапсе. Проведенные эксперименты показали, что в синапсах диафрагмальной мышцы мыши через два часа после внутрибрюшинного введения резерпина наблюдалось небольшое увеличение частоты спонтанных ответов и квантового состава, по сравнению с синапсами животных контрольной группы, которым по такой же схеме вводили раствор, не содержащий резерпин. Добавление экзогенного агониста α2 адренорецепторов дексмедетомидина приводило к более выраженному снижению спонтанной секреции квантов медиатора и более быстрому спаду тока концевой пластинки в синапсах десимпатизированных мышей, по сравнению с этими параметрами в синапсах контрольных животных. Под действием дексмедетомидина в синапсах животных после симпатэктомии происходило повышение степени синхронности выделения квантов в ответ на нервный стимул, тогда как в синапсах контрольных животных, напротив, наблюдалась десинхронизация секреции, такая же как описанная нами ранее (Tsentsevitsky et al., 2020). Таким образом, устранение эндогенных катехоламинов в результате действия резерпина действительно приводило к усилению эффектов активации α2 адренорецепторов на параметры квантовой секреции, влияние агониста на кинетику секреции даже меняло свою направленность. Безусловно, этот эффект требует дальнейших исследований для выяснения механизмов его возникновения. Другой вариант симпатэктомии был реализован с помощью инъекций 6-гидроксидофамина (6-OHDA), который является фармакологическим инструментом для избирательной дегенерации норадренергических нервных окончаний (Malmfors and Thoenen, 1971) в периферической и центральной нервной системе (Hedreen and Chalmers, 1972). После 10-дневных инъекций 6-OHDA в синапсах диафрагмальной мышцы также наблюдалось увеличение интенсивности спонтанной секреции квантов медиатора, тенденция к повышению количества квантов, выделившихся в ответ на нервный стимул. В «десимпатизированных» синапсах мышцы с «быстрым» типом волокон наблюдалось существенно более значимое возрастание мембранного потенциала мышечного волокна и квантового состава под действием экзогенного адреналина, чем в синапсах контрольных животных. Наблюдаемое повышение интенсивности секреции квантов в результате десимпатизации объясняется устранением угнетающего действия эндогенных катехоламинов, которое подтверждается полученными нами ранее результатами о снижении квантовой секреции в нервно-мышечном синапсе мыши под действием экзогенных адреналина, норадреналина и их аналогов, активирующих α2 адренорецепторы (Tsentsevitsky et al., 2020). Распространение нейро-дегенеративных заболеваний ставит задачу разработки эффективных лекарственных препаратов. В последние несколько лет адренергические соединения стали предлагаться для лечения одной из таких болезней – бокового амиотрофического склероза (БАС). Одним из механизмов его развития предполагают нарушения функций периферического синаптического контакта. В связи с этим мы исследовали параметры синаптической передачи возбуждения в нервно-мышечных синапсах у мышей с моделью БАС. В синапсах животных с признаками БАС наблюдался более высокий уровень вызванной квантовой секреции ацетилхолина, повышенные значения проводимости и времени жизни открытого состояния рецепторно-канального ацетилхолинового комплекса постсинаптической мембраны мышечного волокна в диафрагмальной мышце. Эффекты активации адренорецепторов в синапсах животных с БАС не проявлялись в изменениях параметров синаптической передачи, в отличие от повышения уровня секреции у контрольных животных. У симптомных животных в синапсах мышцы, содержащей преимущественно волокна «быстрого» типа, активация адренорецепторов α2 подтипа вызывала увеличение входа ионов кальция в нервное окончание в ответ на стимул. Полученные данные свидетельствуют о существенных различиях в параметрах синаптической передачи возбуждения и в реакциях на активацию адренорецепторов в синапсах животных с моделью БАС, что необходимо учитывать при разработке новых лекарственных препаратов для лечения заболеваний с синаптическим дефектом.