Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 г. в рамках гранта проведена серия экспериментов по валидации модели антибиотик-индуцированного дисбиоза у крыс. Антибиотик-индуцированный дисбиоз вызывали пероральным введением смеси антимикробных препаратов (АМП) широкого спектра действия: амоксициллина, метронидазола, кларитромицина. Такая схема назначения антимикробных препаратов является аналогом стандартной антихеликобактерной терапии, применяющейся у больных язвенной болезнью желудка. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при постановке эксперимента на мелких грызунах наиболее оптимальным сроком для регистрации статистически значимых параметров реакций макроорганизма является промежуток времени до 5 суток. Этот срок дополнительно зависит от наличия патогенных и условно-патогенных штаммов в составе кишечной микробиоты животного. Адаптация пищеварительной системы животных к введению в энтеральную среду антимикробных препаратов уже через 5 суток введения антимикробных препаратов проявляется в нормализации потребления корма и воды, а также ряда биохимических и иммунологических параметров. При этом нарушение эвакуации содержимого желудочно-кишечного тракта в слепой кишке является наиболее длительно сохраняющимся нарушением. Основная рабочая гипотеза данного проекта состоит в том, что индуцированные антимикробными препаратами системные метаболические изменения в организме могут направленно способствовать изменению устойчивости миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению. В данном исследовании для конвенциональных крыс с 3-х дневным введением АМП было отмечено уменьшение площади инфаркта по сравнению с группами с 5- и 7- дневным введением препаратов. Скрининговое исследование влияния ряда антимикробных препаратов (ципрофлоксацин, азитромицин, флуконазол, кларитромицин, аммоксициллин, метронидазол, рифаксимин, тетрациклин) на устойчивость миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению у улучшенных конвенциональных крыс на модели изолированного сердца по Лангендорфу показало разнонаправленность влияния различных АМП на размер инфаркта. В опыте на крысах SPF-категории с моделированием острого воспаления кишечника на модели инфаркта с окклюзией левой коронарной артерии было отмечено уменьшение зоны инфаркта. Однако размер инфаркта увеличивался в аналогичном протоколе эксперимента на улучшенных конвенциональных крысах по отношению к интактным крысам и крысам, получавшим высококалорийную диету, что указывает на роль системных факторов с учётом различного эндоэкологического состава кишечной микробиоты. Top-10 мировых научных достижений 2013 г. свидетельствует о выявлении определяющего влияния кишечной микробиоты на практически все процессы организма, включая мозговую деятельность и ее роль в развитии различных заболеваний. С учетом лидирующего значения патологии сердечно-сосудистой системы среди причин смертности и распространенности сочетания заболеваний желудочно-кишечного тракта и системы кровообращения, результаты данного исследования носят не только фундаментальный, но и прикладной характер. Широкое использование антимикробных препаратов для лечения инфекционных заболеваний и пробиотической коррекции дисбиотических нарушений кишечника должно рассматриваться как фактор риска усугубления кардиоваскулярных заболеваний и одновременно как инструмент для предотвращения их угрозы. Проведенное исследование подтвердило, что различный эндоэкологический микробный состав кишечника, а также исходное физиологическое состояние макроорганизма в целом и желудочно-кишечного тракта в частности, при введении антимикробных препаратов, играют решающую роль для поддержания стабильных функциональных и гемодинамических характеристик сердечно-сосудистой системы, при формировании зоны инфаркта, что в конечном счёте определяет исход критических кардиологических состояний. Несомненно, что следующий этап работы, направленный на мониторинг пробиотических штаммов, оказывающих влияние на пищеварительную систему через установление динамического равновесия состава кишечной микробиоты и модулирование про- и противовоспалительного статуса через каскадные механизмы иммунной системы, требует учета полученных результатов данного исследования с учётом поставленной цели проекта по разработке новой стратегии защиты миокарда от ишемического-реперфузионного повреждения путём управления составом кишечной микробиоты посредством антимикробных и пробиотических препаратов. По результатам исследований в 2018 г. опубликованы 2 работы: 1) Борщев Ю.Ю., Минасян С.М., Буровенко И.Ю., Борщев В.Ю., Галагудза М.М. (Borshchev Yu.Yu., Minasian S.M., Burovenko I.Yu., Borshchev V.Yu., Galagudza M.M.) Антибиотик-индуцированный дисбиоз кишечника и устойчивость миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению у крыс с различным микробиологическим статусом Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология (2018 г.), 2) Борщев Ю.Ю., Синица А.В., Захарченко М.М., Борщев В.Ю., Буровенко И.Ю., Галагудза М.М. (Borshchev Yu.Yu., Sinitsa A.V., Zakharchenko M.M., Burovenko I.Yu., Galagudza M.M.) Влияние антибиотикоиндуцированного дисбиоза и его коррекции пробиотиками на устойчивость миокарда к ишемически-реперфузионному повреждению у крыс SPF категории Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (2018 г.). На Российском научно-практическом конгрессе "Метаболический синдром. Фундаментальные и клинические аспекты - от теории к практике", Санкт-Петербург, 3-4 декабря 2018 г, от группы исследователей Борщев Ю.Ю., Минасян С.М., Сонин Д.Л., Бельский Ю.П., Буровенко И.Ю., Семенова Н.Ю., Буровенко Д.В., Борщева О.В., Галагудза М.М., Борщевым Ю.Ю. было сделан устный доклад "Метаболический профиль у крыс с разным микробным статусом при моделировании ишемического-реперфузионного повреждения". Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ "Программа цифровой обработки гистологических изображений зоны некроза (Black shadow)".

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Разработанная нами новая комплексная модель синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) у крыс с первичным висцеральным ожирением (ПВО) вследствие химически-индуцированного воспалительного заболевания толстого кишечника, осложненного антибиотик-индуцированным дисбиозом (АИД), вызванного смесью АМП широкого спектра действия (амоксициллин, метронидазол, кларитромицин) для изучения устойчивости миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению (ИРП), отражает широко распространённое сочетание патологий в современной урбанизированной человеческой популяции и позволяет в рамках одного исследования получать существенный информационный массив для составления базы данных с определением корреляционных взаимодействий в открытой биологической системе. Полученные гематологические, иммунологические, биохимические параметры крови, определение состава короткоцепочечных жирных кислот (КЦКЖ), микробиологического состава фекалий с использованием метода ПЦР в реальном времени, с подтверждением гистологических характеристик внутренних органов, гемодинамических и морфофункциональных показателей миокарда, позволяет обеспечить высокую эффективность экспериментальных работ на животных, для последующей трансляции полученных знаний в современную клиническую практику. Выбранный способ моделирования первичного алиментарного ожирения позволяет в течение короткого срока добиться кратного увеличения висцеральных жировых депозитов. Способ адекватной индукции ССВР у таких животных позволяет в контролируемых условиях осуществлять модуляцию воспалительного процесса, отягощенного АИД, с помощью лекарственных средств, в т.ч. антимикробных и пробиотических препаратов. С использованием данной модели нами показано специфическое влияние антимикробных и пробиотических препаратов на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов, состав кишечной микробиоты, короткоцепочечных жирных кислот, ишемически-реперфузионное повреждение миокарда у крыс с ССВР. Учитывая известную иммуномодуляторную роль КЦКЖ, в данной экспериментальной модели очевидна взаимосвязь между ССВР и АИД, изменением состава кишечной микробиоты, ростом концентрации провоспалительных цитокинов и липополисахарида (ЛПС) в крови. Однако, введение смеси АМП при сохранении титра E.coli, но при увеличении представительства Proteus spp., вызвало снижение уровня ЛПС и провоспалительных цитокинов при высокой концентрации уксусной и пропионовой кислот. Учитывая высокий показатель IL-8, можно предположить, что решающее значение в изменении морфофункциональных характеристик миокарда играет нарушение баланса цитокинов системы воспаления и токсического влияния высоких концентраций КЦКЖ. Исследование механизмов всасывания моносахаридов в изолированной петле тонкой кишки при введении антимикробных препаратов показало корреляционную связь изменения всасывания в кишке с объемом ишемического-реперфузионного повреждения миокарда на модели изолированного сердца у крыс. Значимое снижение всасывания нутриентов у здоровых животных при введении АМП широкого спектра действия осложняется АИД, что в итоге может проявляться в усугублении ишемического-реперфузионного повреждения миокарда. На примере терациклина нами впервые показана отмена известного кардиопротективного эффекта терапевтических доз тетрациклина у здоровых животных при моделировании коморбидности, включающей ПВО, АИД и ССВР. Использование пробиотических препаратов у животных с ССВР и АИД в ряде случаев привело к нормализации воспалительного статуса, цитокинового профиля, состава кишечной микробиоты и КЦКЖ, с уменьшением величины ишемического-реперфузионного повреждения миокарда изолированного сердца, что требует расширения спектра исследуемых пробиотических препаратов и выяснения молекулярно-генетических механизмов полученного эффекта. По результатам исследований в 2019 г. опубликовано 5 полнотекстовых статей в рецензируемых журналах. Результаты работы представлены в виде устных и постерных докладов на совещании экспертов рабочей группы Европейского кардиологического общества по биологии развития, анатомии и патологии (Малага, Испания), Российском национальном конгрессе кардиологов 2019 (Екатеринбург, Россия), IX Российском конгрессе «Метаболический синдром: междисциплинарные аспекты проблемы» (Санкт-Петербург, Россия), Ежегодной Всероссийской научно-практической конференции и 59 сессии ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии" Минздрава России "Современная кардиология: базовые принципы и прогресс" (Москва, Россия), VIII Международном молодёжном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чтения-2019" (Санкт-Петербург, Россия).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработанная нами новая комплексная модель синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) у крыс с первичным висцеральным ожирением (ПВО) дополнена новыми сведениями о возможности существенной модуляции путем изменения качественного состава жиров в диете. При моделировании ССВР у контрольных животных, находившихся на стандартном корме, через 8 суток отмечено значимое увеличение концентрации провоспалительных цитокинов и уменьшение противовоспалительного цитокина трансформирующего фактора роста-1β (TGF-1β). ССВР сопровождалась выраженными нарушениями пищевого поведения и эвакуаторной функции желудочно-кишечного тракта. Минимальные изменения состава кишечной микробиоты, а также максимально выраженные признаки регенерации кишечного эпителия отмечены у крыс в группе с введением молочного жира, по сравнению с крысами, которым в диету вводили гидрогенизированные жиры, растительное масло и животный жир. Была отмечена тенденция к увеличению размера инфаркта в результате ишемического-реперфузионного повреждения (ИРП) у крыс во всех группах по сравнению с контролем, прямо коррелируя с увеличением продукции мозгового нейротрофического фактора (BDNF) и интерлейкина-2 (IL-2), однако значимое увеличение размера инфаркта было обнаружено только в группе, получавшей молочный жир, что указывает на снижение устойчивости миокарда к ишемии-реперфузии. В результате исследования сделан вывод о том, что наличие ССВР на фоне ПВО характеризуется контролируемым изменением маркеров воспаления и зависит от качества жиров в рационе. Степень ухудшения морфофункциональных характеристик изолированного сердца, в т.ч. снижение устойчивости к ИРП, коррелирует с концентрацией BDNF и IL-2 при изученном сроке наблюдения. При создании локального очага воспаления (хирургической костной травмы, не ограничивающей локомоторные функции) на фоне ССВР, нами получена ещё одна экспериментальная модель, отражающая особенности протекания полиморбидной патологии в клинике, включающей ожирение, острый воспалительный процесс желудочно-кишечного тракта, антибиотик-индуцированный дисбиоз и костную травму. Данная модель полиморбидности стала основой для тестирования эффективности пробиотических препаратов в отношении маркеров образования костной ткани. Смесь пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus (LA-5) и Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BB-12), в концентрации КОЕ 10*8 на одно животное применительно к большинству изученных параметров показала свою эффективность по сравнению с другими использованными пробиотиками. Нами получены подтверждения пробиотического модулирования таких регуляторов обмена веществ, как цинкосодержащие биомолекулы: остеокальцин, костная фракция и общая щелочная фосфатаза, матриксная металлопротеиназа-1. Также для данной модели нами установлена существенная зависимость показателей у животных различного возраста: у крыс-самцов стока Вистар в возрасте 7 месяцев под влиянием пробиотиков существенно увеличилась концентрация остеокальцина и матриксной металлопротеиназы-1 при сравнении с животными в возрасте 9 месяцев. При гистологическом исследовании толстой кишки при моделировании химически индуцированного воспалительного заболевания, отягощенного антибиотико-индуцированным дисбиозом, картина соответствует ярко выраженному колиту. Отмечается выраженная инфильтрация, некроз крипт более, чем на 2/3, обширные язвенные дефекты. Замещение слизистого и подслизистого слоев грануляционной тканью. Однако встречаются признаки регенерации. В краях язвенных дефектов отмечается реэпителизация язв однослойным кишечным эпителием. Также отмечается организация поверхностных слоев язвенных дефектов с формированием незрелой соединительной ткани на месте грануляционной, уменьшается воспалительная инфильтрация. По данным количественной и качественной оценки распространенность и тяжесть язвенного процесса в группе сравнения отличается от групп с введением пробиотических препаратов. В этих группах отмечаются обширные язвенные дефекты, однако присутствуют признаки регенерации ткани, реэпителизация с краев язвенных дефектов до 40%, преобладание фиброноидного компонента, восстановление гистоархитектоники мышечного и подслизистого слоев, отсутствие слизисто-гнойного экссудата. Исследование влияния пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus (LA-5) и Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB-12), Saccharomyces boulardii и Enterococcus Faecium L3 в поведенческих тестах с использованием АПК "Открытое поле", "Приподнятый крестообразный лабиринт", и "Ротарод" показали, что наиболее значимые результаты были обнаружены для крыс с введением смеси L.acidophilus (LA-5) и B.animalis subsp. lactis (BB-12) в тестах по изучению уровня эмоционально-поведенческой реактивности животного ("седацию-ажитацию"); стратегии исследовательского/оборонительного поведения; привыкания (habituation); запоминания обстановочных стимулов; симптомов неврологического дефицита; локомоторной стереотипии, уровня тревожности. С учетом наилучших показателей регенерации повреждённых тканей толстой кишки у крыс в данной группе, эти наблюдения могут быть объяснены более выраженным ранозаживлением. Наилучшие координационно-функциональные показатели (достоверное снижение числа падений с движущегося барабана) показаны моделями на установке "Ротарод" из группы с введением Saccharomyces boulardii, а лидерами в тестах на обучаемость и память при помощи АПК "Шелтер" (тёмная светлая камеры, свет, звук) стали крысы из группы с введением пробиотического штамма Enterococcus Faecium L3. При исследовании устойчивости миокарда к ИРП в эксперименте in vivo отмечены тенденции изменения площади некроза миокарда при моделировании ССВР и пробиотической терапии, характерные для опыта in vitro, однако с менее выраженной амплитудой, которая снижается при увеличении возраста экспериментальных животных, с увеличением средних значений во всех группах, что вероятно указывает на зависимость чувствительности макроорганизма к пробиотической терапии от возраста. Непатогенные дрожжи Saccharomyces Boulardii устойчивы ко всем группам антибиотиков, а также к кислой среде в желудке, не колонизируют кишечник и обладают прямым антимикробным действием в отношении широкого спектра микроорганизмов. В нашей работе, именно в группе с введением сахаромицетов отмечено достоверное снижение общего количества бактерий, а также B.fragilis, однако отсутствие существенного снижения показателя ИРП миокарда не позволяет рассматривать эти эффекты как потенциальные кардиопротективные механизмы данного пробиотика, несмотря на наличие тенденции. Также не приходится рассматривать кардиопротективного потенциала в данной модели бактерий Faecalibacterium prausnitzii и Akkermansia muciniphila, несмотря на признание их позитивной роли, учитывая отсутствие представительства этих микроорганизмов в составе кишечной микробиоты у крыс во всех группах с введением пробиотиков. Однако, существенные изменения уровня КЦКЖ бактериального происхождения, коррелирующее с показателями ИРП миокарда заставляет признать влияние качественных или количественных изменений кишечной микробиоты. Нами показано снижения концентрации, как КЦЖК бактериального происхождения, так и лактата в группах с пробиотической терапией и статистически значимой корреляцией этих метаболитов с размером ИРП миокарда. В исследовании на изолированном сердце в группе ССВР после ИРП после 30 минут глобальной ишемии площадь некроза достоверно увеличилась на 35% по отношению к контролю, с регистрацией эффективной пробиотической терапии, тогда как в опыте in vivo с окклюзией левой коронарной артерии этот показатель увеличился недостоверно, в связи с существенным разбросом значений, что требует выяснения их причины. Уменьшение площади некроза с наибольшим кардипротективным эффектом в обоих экспериментах отмечено у крыс с введением животным с ССВР смеси пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus (LA-5) и Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (BB-12). В экспериментах in vivo на крысиной модели ССВР установлено, что исходные гемодинамические параметры у наркотизированных крыс с ССВР в разной степени отличались от исходных параметров контрольной группы. У крыс в группах с введением пробиотических препаратов наблюдалось достоверное снижение ЧСС. Наибольшей силой корреляционной связи между концентрацией исследованных в данной работе маркеров и размером некроза миокарда являются уксусная кислота, IL-2 и BDNF, что определяет поиск непосредственных продуцентов КЦКЖ, либо их ингибиторов, а также выяснение молекулярных механизмов воздействия пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий на синтез провоспалительного цитокина IL-2 и нейротрофина BDNF с возможностью их регуляции с позиции кардиопротекции. Результаты исследования показали общие и специфические регуляторные механизмы активации и блокирования отдельных про- и противовоспалительных цитокинов в связи с защитой миокарда от ИРП. Нами предлагается новая стратегия профилактики или минимизации масштабов и последствий миокардиальной катастрофы в группе риска с помощью селективных пробиотических штаммов или их метаболитов для разработки про- и метабиотических лекарственных препаратов и продуктов функционального питания. Анализ полученных данных в серии экспериментов, выполненных в течение 2020-го года показывает, что в большинстве исследований статистически значимые изменения параметров при моделировании ССВР у мелких грызунов нормализуются в изученные сроки, благодаря введению пробиотических препаратов, с максимальным эффектом, в т.ч. кардиопротективного характера, в пользу смеси пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus (LA-5) и Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB-12), что подтверждает перспективность исследования пробиотических штаммов из национальной коллекции для разработки лекарственных препаратов и продуктов функционального питания.