Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Исследование проблемы мастита коров, ассоциированной со стафилококками, остается актуальной на сегодняшний день. Решение этой проблемы носит значимый характер не только для РФ, но и для всего мира, так как мастит коров распространен повсеместно. На предыдущих этапах проекта было определено, что на территории центрального региона РФ субклиническая форма мастита связана именно с золотистым стафилококком. За отчетный период было проведено комплексное исследование S.aureus, ассоциированного с маститом у коров. Были выделены и охарактеризованы биохимическими методами изоляты S.aureus. Среди них 53,6% были резистентны к β-лактамным антибиотикам, а именно к бензилпенициллину, 80,4 % к макролидам (эритромицину), а 53,6% к линкозамидам (линкомицин) и фторхинолонам (ципрофлоксацину). Проведена работа по сравнительному генетическому анализу имеющихся изолятов S. aureus c использованием современных ресурсов биоинформатики. Проведено аннотирование 5 геномов S. aureus, выделеных из образцов молока коров Центрального региона РФ. Несмотря на то, что наши штаммы были выделены от клинически здоровых коров, в геномах исследованных изолятов были детектированы факторы вирулентности S. aureus, часто ассоциируемые с маститом. Также для выбранных нами штаммов S.aureus подтверждена экспрессия токсинов SEG, SEI, SEE и SEA. У отобранных в нашем исследовании животных также были взяты образцы смывов из носовой полости, репродуктивной системы и молока. На этом этапе работы проводили наращивание образцов смешанных бактериальных культур. Далее проводили анализ присутствия генов экзотоксинов в этой культуре микроорганизмов. Было установлено, что в исследованной выборке детектировались гены seg и sei. Таким образом, на данном этапе можно заключить, что гены энтеротоксинов G и I (seg/sei) являются наиболее распространенными у S. aureus, ассоциированных с маститом на территории РФ. Одним из важных направлений работы было изучение иммунного статуса животных с различными формами заболевания. Информация о гуморальном иммунном ответе у животных разных групп здоровья позволяет получить полную клиническую картину течения заболевания, даже если оно не выявлено существующими методами исследований. По результатам работы в образцах молока не было обнаружено антител класса G и A к основным экзотоксинам стафилококка. В сыворотках крови разных групп животных обнаружены IgG к энтеротоксинам SEB, SEC, SED, SEE. Наши исследования показывают, что даже при отсутствии клинических проявлений мастита, у животных развивается иммунный ответ на основные энтеротоксины, участвующие в развитии заболевания. Сыворотки крови коров были протестированы на нейтрализующий потенциал по отношению к перечисленным токсинам, однако сыворотки обладающие нейтрализующий активностью выявлены не были. Проведен ряд экспериментов по изучению токсического действия энтеротоксинов стафилококков на эпителиальные клетки молочной железы в культуре in vitro Исследование показало, что SEA и SEE оказались более токсичными для культивируемых эпителиальных клеток молочной железы. При изучении данных энтеротоксинов наблюдался выраженный дозозависимый эффект, токсичность препаратов возрастала пропорционально увеличению их концентрации. Также высокая токсичность на клетки молочной железы коров была установлена для энтеротоксинов SEG и TSST. В данном случае гибель значительной доли культивируемых клеток отмечалась даже при использовании препаратов в низкой концентрации. Важно отметить, что в работе исследовалась роль энтеротоксинов, наличие которых было показано у штаммов стафилококка золотистого, выделенного от животных больных субклинической формой мастита на предыдущих этапах проекта. Полученные в настоящем исследовании данные о токсичности энтеротоксинов стафилококков на клетки молочной железы коров значительно расширяют наши представления о возможных молекулярных механизмах инвазии стафилококка золотистого из молочного канала в ткань и далее в кровяное русло.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведено комплексное изучение стафилококков, ассоциированных с маститом коров на территории РФ. Доля обнаружения S. aureus в Центральном, Приволжском, Дальневосточном и Сибирском ФО составила 50.5%, 42.5%, 16.0%, 58.1%, при том, что распространенность мастита в этих регионах составила 31.2%, 26.3%, 24.0% и 38.4% соответственно. Из всех штаммов S. aureus 46.93% были резистентны к пенициллину, но по результатам комплексного исследования отнесены к MSSA. Из всех штаммов CNS аналогичный процент был устойчив к пенициллину (48.9%), при этом были обнаружены штаммы, устойчивые к оксациллину (5,77%) и ванкомицину (1,37%). По результатам фенотипической оценки, множественная устойчивость штаммов S. aureus отмечена в Центральном ФО у 58,3% , Приволжском ФО у 27,03%; Дальневосточном ФО у 44,12%; Сибирском ФО в 48,12%, что свидетельствует о развитии мультирезистентных штаммов на всей территории РФ. С помощью полногеномного секвенирования (WGS) был оценен токсикогенный потенциал золотистого стафилококка, ассоциированного с маститом коров. Все исследованные изоляты обладали широким арсеналом факторов вирулентности. Наиболее распространенными оказались гены цитотоксинов (гемолизинов и лейкоцидинов), так же стафилококки несли гены энтеротоксинов. На сегодняшний день для исследованных регионов были характерны гены (seg и sei) энтеротоксинов G и I. Все исследованные изоляты стафилококка золотистого отнесены к категории MSSA, кроме того идентифицированы изоляты с множественной антибиотикорезистентностью. Данный факт может быть связан с предыдущей терапией мастита на фермах с помощью антибиотиков, за счет чего стафилококки приобретали устойчивость к ним, а инфекция переходила в вялотекущую субклиническую форму. В результате проведенного исследования не было выявлено связи между токсикогенным потенциалом изученных штаммов и гуморальным иммунитетом у животных. Для животных с субклинической формой мастита был установлен титр к токсинам SEB, SEC, SED, SEE он составил 1/8000-1/16000. У животных с клинической формой мастита сохранялся высокий титр относительно здоровых животных к токсинам SEA, SEC, SEH. Он находился на уровне 1/8000. Исследование действия энтеротоксинов на эпителий молочной железы показало снижение количества жизнеспособных клеток в среднем на 45%. Также исследовалась способность антител блокировать цитотоксический эффект. Для энтеротоксина G была показана такая способность у одного из 5 исследуемых антител.