КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 15-16-00020

НазваниеИзучение молекулярных и генетических аспектов заболеваемости маститом высокопродуктивных молочных коров как основа разработки новых подходов к предотвращению заболевания

РуководительБровко Федор Александрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста", Московская обл

Года выполнения при поддержке РНФ2018 - 2019

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-204 - Животноводство

Ключевые словаМастит коров, стафилококки, экзотоксины стафилококков, энтеротоксины, фенолрастворимые модулины, порообразующие токсины, антитела к токсинам стафилококков, гены резистентности к маститу.

Код ГРНТИ68.41.35


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Мастит коров повсеместно распространенное заболевание и одна из важных проблем ветеринарии и сельского хозяйства. Его значение связано как с влиянием воспаления молочной железы на общее состояние здоровья животного, так и на его репродуктивные способности. Золотистый стафилококк является одним из наиболее распространенных участников патологического процесса при мастите. Неконтролируемое и использование антибиотиков, а также горизонтальный перенос генов антибиотикоустойчивости приводит к росту антибиотикоустойчивых штаммов. Проведение детальных исследований S.aureus, включающих антибиотикорезистентность, токсикогенность, уровень и спектр продукции экзотоксинов является актуальным на сегодняшний день. Значительный вклад в понимание развития патологии мастита и ее распространенность может дать исследование геномов стафилококков, выделенных от коров больных маститом. Анализ геномов даст разъяснение патологического потенциала патогена. В свою очередь исследование состояния иммунной системы животного, в ответ на действие патогена, включая выработку факторов защиты даст более глубинное рассмотрение проблемы мастита. Одним из важных направлений проекта будет исследование механизмов инвазии стафилококка, а также роли эпителия молочной железы как фактора защиты от патогенов. На предыдущем этапе проекта было проведена характеристика штаммов, исследована антибиотикоустойчивость, определены гены антибиотикоустойивости. Показано гены каких токсинов наиболее характерны для стафилококков выделяемых от животных больных маститом. Основной массив животных, на которых проведена работа, из центрального региона РФ. Были определены уровни продукции энтеротоксинов и гены токсинов стафилококков, выделенных из молока, что играет основополагающую роль для успешного развития производства молока и профилактики мастита. Экзотоксины являются главными факторами стафилококков, используемые ими для индукции апоптоза клеток эпителия молочной железы. Также представляет несомненный интерес определить способность антител к экзотоксинам подавлять их влияние на клетки эпителия. На сегодняшний день описаны антитела, способные усиливать действие бактериальных токсинов на клетки. Таким образом целью проекта является: исследование роли S. aureus, анализ геномов исследуемых стафилококков, выделяемых из разных регионов РФ, изучение факторов патогенности, продуцируемых бактерией, изучение развития иммунного ответа животного.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта будут выяснены причины и механизмы развития маститов у коров, связанные со стафилококковой природой, включая региональную специфику штаммов и их ассоциацию с различными отделами животного организма. Полученные результаты будут носить передовой характер и внесут значительный вклад в понимание и решение проблемы характерной не только для территории РФ, но и для всего мира. Будет оценен вклад стафилококка золотистого в развитие маститов в разных регионах страны. Исследование геномов стафилококков позволит установить определенные генетические закономерности, характерные для стафилококков, ассоциированных с маститом коров и их региональную зависимость. Будет исследована токсикогенность стафилококков в зависимости от нахождения в разных отделах организма и определена взаимосвязь с развитием гуморального ответа животных. Исследование у животных генов экзотоксинов в смывах из разных физиологических полостей и молока позволит оценить значение органов в индукции антител против экзотоксинов. Кроме того, в работе будут исследована роль вакцинации животных в индукции защитных механизмов. Это позволит оценить способность антител животных регулировать функцию экзотоксинов стафилококков. Будут получены данные о способности антител влиять на активность токсина. Еще одним важным результатом проекта будет исследование способности экзотоксинов индуцировать апоптоз клеток эпителия молочной железы коров. Будут получены новые данные о кооперативном действии экзотоксинов в индукции апоптоза. Учитывая полученные нами ранее данные о наличии в молозиве антител к энтеротоксинам, будут получены данные о способности антител влиять на процесс апоптоза клеток эпителия молочной железы.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Исследование проблемы мастита коров, ассоциированной со стафилококками, остается актуальной на сегодняшний день. Решение этой проблемы носит значимый характер не только для РФ, но и для всего мира, так как мастит коров распространен повсеместно. На предыдущих этапах проекта было определено, что на территории центрального региона РФ субклиническая форма мастита связана именно с золотистым стафилококком. За отчетный период было проведено комплексное исследование S.aureus, ассоциированного с маститом у коров. Были выделены и охарактеризованы биохимическими методами изоляты S.aureus. Среди них 53,6% были резистентны к β-лактамным антибиотикам, а именно к бензилпенициллину, 80,4 % к макролидам (эритромицину), а 53,6% к линкозамидам (линкомицин) и фторхинолонам (ципрофлоксацину). Проведена работа по сравнительному генетическому анализу имеющихся изолятов S. aureus c использованием современных ресурсов биоинформатики. Проведено аннотирование 5 геномов S. aureus, выделеных из образцов молока коров Центрального региона РФ. Несмотря на то, что наши штаммы были выделены от клинически здоровых коров, в геномах исследованных изолятов были детектированы факторы вирулентности S. aureus, часто ассоциируемые с маститом. Также для выбранных нами штаммов S.aureus подтверждена экспрессия токсинов SEG, SEI, SEE и SEA. У отобранных в нашем исследовании животных также были взяты образцы смывов из носовой полости, репродуктивной системы и молока. На этом этапе работы проводили наращивание образцов смешанных бактериальных культур. Далее проводили анализ присутствия генов экзотоксинов в этой культуре микроорганизмов. Было установлено, что в исследованной выборке детектировались гены seg и sei. Таким образом, на данном этапе можно заключить, что гены энтеротоксинов G и I (seg/sei) являются наиболее распространенными у S. aureus, ассоциированных с маститом на территории РФ. Одним из важных направлений работы было изучение иммунного статуса животных с различными формами заболевания. Информация о гуморальном иммунном ответе у животных разных групп здоровья позволяет получить полную клиническую картину течения заболевания, даже если оно не выявлено существующими методами исследований. По результатам работы в образцах молока не было обнаружено антител класса G и A к основным экзотоксинам стафилококка. В сыворотках крови разных групп животных обнаружены IgG к энтеротоксинам SEB, SEC, SED, SEE. Наши исследования показывают, что даже при отсутствии клинических проявлений мастита, у животных развивается иммунный ответ на основные энтеротоксины, участвующие в развитии заболевания. Сыворотки крови коров были протестированы на нейтрализующий потенциал по отношению к перечисленным токсинам, однако сыворотки обладающие нейтрализующий активностью выявлены не были. Проведен ряд экспериментов по изучению токсического действия энтеротоксинов стафилококков на эпителиальные клетки молочной железы в культуре in vitro Исследование показало, что SEA и SEE оказались более токсичными для культивируемых эпителиальных клеток молочной железы. При изучении данных энтеротоксинов наблюдался выраженный дозозависимый эффект, токсичность препаратов возрастала пропорционально увеличению их концентрации. Также высокая токсичность на клетки молочной железы коров была установлена для энтеротоксинов SEG и TSST. В данном случае гибель значительной доли культивируемых клеток отмечалась даже при использовании препаратов в низкой концентрации. Важно отметить, что в работе исследовалась роль энтеротоксинов, наличие которых было показано у штаммов стафилококка золотистого, выделенного от животных больных субклинической формой мастита на предыдущих этапах проекта. Полученные в настоящем исследовании данные о токсичности энтеротоксинов стафилококков на клетки молочной железы коров значительно расширяют наши представления о возможных молекулярных механизмах инвазии стафилококка золотистого из молочного канала в ткань и далее в кровяное русло.

 

Публикации

1. Артемьева О.А., Никанова Д.А., Фурсова К.К., Бровко Ф.А.,Зиновьева Н.А. Study of S. aureus strains, isolated from different biotopes of the cows’ organism. American Society of Animal Science, Volume 96, Issue suppl_3, 7 December 2018, Pages 40–41 (год публикации - 2018).

2. Никанова Д.А., Артемьева О.А., Колодина Е.Н., Зиновьева Н.А. ISOLATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF S. AUREUS STRAINS ISOLATED FROM COW MILK IN DIFFERENT REGIONS OF RUSSIA John Wiley & Sons, Inc., 53, S2 (год публикации - 2018).

3. Фурсова К.К., Артемьева О.А., Никанова Д.А., Ларин А.К., Зиновьева Н.А., Бровко Ф.А. Draft Genome Sequences of Five Staphylococcus aureus Strains Isolated from Clinically Healthy Cows in the Russian Federation. American Society for Microbiology, Genome Announc. 2018 Apr 19;6(16). pii: e00275-18. (год публикации - 2018).

4. Фурсова К.К., Щанникова М.П., Лоскутова И.В., Шепеляковская А.О., Ламан А.Г., Бутанаев А.М., Соколов С.Л., Артемьева О.А., Никанова Д.А., Зиновьева Н.А., Бровко Ф.А. Exotoxin diversity of Staphylococcus aureus isolated from milk of cows with subclinical mastitis in Central Russia Elsevier Ltd, J Dairy Sci. 2018 May;101(5):4325-4331. (год публикации - 2018).