Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Показано, что сочетание центрифугирования, ультрацентрифугирования, ультрафильтрации и гель-фильтрации позволяет выделять из молока препараты везикул, соответствующие экзосомам по данным электронной микроскопии и проточной цитометрии. Показано, что последующая аффинная хроматография на сорбентах, содержащих иммобилизованные поликлональные антитела против тетраспанинов позволяет специфически выделять экзосомы, содержащие данные маркеры на поверхности. 2. Разработан и верифицирован на образцах молока человека, лошади, козы метод выделения экзосом из полупрепаративных объемов (из объема 400 мл), включающий стадии центрифугирования, ультрацентрифугирования и ультрафильтрации, гель-фильтрации и аффинной хроматографии. Определены условия получения препаратов экзосом молока без примесей совыделяющихся белков. 3. Определены белки, совыделяющиеся с экзосомами молока человека, лошади, козы, отделяемые при гель-фильтрации и аффинной хроматографии. Показано, что фракция совыделяющихся белков содержит казеины, отсутствие которых может являться одним из критериев чистоты экзосом молока. 4. Показано, что препараты экзосом молока человека, лошади, козы не оказывают цитотоксического влияния на культуры клеток. Таким образом, высокоочищенные препараты экзосом молока могут быть использованы для доставки в культуры клеток. Публикации в сети Интернет 1. "Новосибирские ученые получили 15 млн рублей на исследование нанопузырьков в организме животных и человека" http://www.nsktv.ru/news/obshchestvo/novosibirskie_uchenye_poluchili_15_mln_rubley_na_issledovanie_nanopuzyrkov_v_organizme_zhivotnykh_i_chelovek_080820181031/

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Проведен количественный анализ содержания экзосом в образцах молока человека, лошади, коровы с использованием просвечивающей электронной микроскопии, проточной цитофлуориметрии, нанотрекингового анализа и ПЦР в реальном времени. Определено содержание на поверхности экзосом молока тетраспанинов CD9, CD63 и CD81, а также из относительное содержание в образцах экзосом молока на разных стадиях выделения. При помощи аффинной хроматографии и проточной цитофлуоримерии показано, что препараты экзосом молока могут одновременно содержать как минимум два тетраспанина. Методом нанотрекингового анализа определена концентрация экзосом в препаратах 2. Получены результаты анализа белков и пептидов экзосом молока. Показано, что препараты экзосом, очищенные гель-фильтрацией и аффинной хроматографией на сорбентах, содержащих антитела против тетраспанниов CD9, CD63, CD81, содержат короткие белки и пептиды с молекулярной массой 2-10 кДа, доказана их полипептидная природа. Показано, что препараты экзосом молока отличаются по белковому составу от стабильного надмолекулярного комплекса молока и плаценты человека. Проведен анализ содержания белков на поверхности экзосом. 3. Из препаратов экзосом на разных стадиях выделения из молока различными методами выделены препараты нуклеиновых кислот. Показано, что наиболее эффективно происходит выделение на магнитных частицах и кремниевых колонках из лизата, полученного аналогом TRIzol, причем выделение на колонках позволяет получить в несколько раз больше РНК, чем с использованием магнитных частиц. Определена длина РНК, выделенной разными методами, показано, что использование колонок с кремниевой мембраной позволяет выделить более длинные РНК. Проведен анализ содержания более 20 микроРНК в молоке, липидной фракции, клеточном осадке и осадке, полученном после второго ультрацентрифугирования 100000×g, методом ОТ-ПЦР-РВ с использованием stem-loop праймеров. Показано, что липидная фракция содержит микроРНК примерно в тех же соотношениях, что и осадок, полученный после двух ультрацентрифугирований. Высокопроизводительное секвенирование препарата экзосом молока человека показало наличие более 600 микроРНК (более 30 прочтений), 34 из которых прочитаны более 1000 раз.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Предлагаемый протокол, сочетающий ультрафильтрацию через фильтр 0,22 мкм, два ультрацентрифугирования на 100000×g, гель-фильтрацию и аффинную хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами против тетраспанинов, является высоко специфичным методом выделения согласно рекомендациям MISEV 2018. Используемые методы количественного анализа и анализа индивидуальных везикул: нанотрекинговый анализ (NTA) и просвечивающая электронная микроскопия, а также анализ белковых маркеров (CD9, CD63, CD81, аннексины, ALIX) – позволяют отнести выделяемые из молока везикулы к экзосомам. Использование масс-спектрометрического анализа для идентификации «отрицательных» белковых маркеров – казеины, структурные элементы иммуноглобулинов, лактальбумин, лактоферрин, а также микроРНК позволяет дополнить критерии MISEV 2018 специфическими для экзосом молока характеристиками. 2. В экзосомах молока лошади до и после гель-фильтрации, а также аффинной хроматографии на сефарозе, содержащей поликлональные антитела кролика против тетраспанинов CD9, CD63 и CD81, идентифицированы белки и пептиды. Показано, что гель-фильтрация и аффинная хроматография на сефарозе, содержащей антитела против тетраспанинов, позволяет получить препараты экзосом, не содержащие примесей совыделяющихся белков. Показано, что белки: казеины, лактоглобулин, структурные компоненты антител, лактоферрин – являются «отрицательными» маркерами экзосом молока, а белки жировых глобул, бутирофилин, синтетаза жирных кислот, аннексин, ксантиндегидрогеназа – характерны для высокоочищенных экзосом молока. Определены молекулярные массы пептидов до 10 кДа, которые по-видимому, являются неотъемлемыми компонентами экзосом молока (и плаценты человека); обработкой протеазами подтверждена их полипептидная природа. Полученные результаты подтверждают высказанную нами ранее предположение о том, что данные о наличии в экзосомах молока сотен различных белков, в том числе, казеина и других компонентов творожистого осадка – являются следствием анализа другими научными группами недостаточно чистых препаратов экзосом молока. Наличие в препаратах экзосом молока пептидов может объяснять результаты обнаружения отсутствующих белков современными сверхчувствительными методами, такими как LC-MS/MS, так как эти подходы не позволяют определить, являлся ли полученный при трипсинолизе пептид продуктом гидролиза целого белка, или более короткого пептида. 3. Разработан протокол анализа микроРНК в препаратах нуклеиновых кислот, выделенных из экзосом молока, позволяющий определить количество молекул микроРНК в образце методом Stem-loop ОТ-ПЦР-РВ, разработан зонд, аналогичный UPL21 (Roche). Определено содержание двадцати микроРНК в препаратах экзосом молока человека, лошади, коровы. Определены мишени микроРНК, содержащихся в экзосомах молока. Проведен анализ нуклеиновых кислот стабильного высокомолекулярного белкового комплекса молока человека, сопоставление его с содержимым экзосом молока человека. Показано, что совместное введение доксорубицина, тамоксифена, циклофосфамида и докитаксела с препаратами экзосом молока после гель-фильтрации к культуре клеток опухоли молочной железы Mcf7 позволяет увеличить цитотоксичность данных препаратов на 10–30%.