Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В соответствии с планом работ, в первый год выполнения проекта проведен эксперимент in vivo на модели канцероматоза у крыс с последующей оценкой циркадианных ритмов у животных с опухолью и циркадианных ритмов пролиферации опухолевых клеток. Эксперимент проводился в два этапа. В первой серии опытов на 24 крысах - самках линии Вистар была проведена оценка суточных ритмов активности крыс (интактных и с опухолью яичников), основой для которой послужили видеозаписи дневной и ночной активности животных в стандартных условиях содержания. Получены данные об фрагментации ритма локомоторной активности у крыс с опухолью яичника по сравнению с животными без опухоли. Ночная активность преобладала над дневной у всех животных, в период «субъективных сумерек» наблюдался рост активности, а в период «субъективного рассвета» – спад активности. Вторая серия опытов выполнялась на 36 крысах - самках линии Вистар в возрасте 4 месяцев для оценки циркадианных ритмов экспрессии в опухолях и нормальных тканях генов и белков, ответственных за регуляцию суточных ритмов на клеточном уровне. Выявлено, что ритм пролиферации в опухолевых клетках отсутствует, в то время как в клетках кишечного эпителия здоровых животных максимум митотической активности приходится на ночное и утреннее время, а минимум – на вечер. У крыс с опухолью обнаружено нарушение ритма пролиферации кишечного эпителия. Проведена оценка суточного ритма экспрессии часовых генов в нормальных тканях яичника и в опухолях. Обнаружено, что среднесуточный уровень экспрессии часовых генов существенно снижен в опухоли по сравнению с нормальной тканью. Возможной причиной является повышенная экспрессия в опухоли онкогена C-myc, который активирует экспрессию репрессора часовых генов REV-ERB alpha. Продолжается оценка уровня экспрессии генов, регулирующих репарацию ДНК, для последующей оценки суточной динамики чувствительности опухолей и нормальных тканей к повреждающему действию цитостатика. На основании полученных данных по локомоторной активности и ритму пролиферации кишечного эпителия у здоровых животных, выбраны 2 временные точки для проведения химиотерапии в экспериментах in vivo, запланированных на второй и третий год реализации проекта. Экспериментальное воздействие будет проводится в период «субъективных сумерек», когда наблюдался рост локомоторной активности и минимум митотической активности в клетках кишечника, и в период «субъективного рассвета» - спад локомоторной активности и пик пролиферативной активности в клетках крипт кишечника. По результатам исследования первого года подготовлены 2 статьи: 1. Киреева Г.С., Беляева О.А., Сенчик К.Ю., Беспалов В.Г., Стуков А.Н., Губарева Е.А., Майдин М.А. Асцитная опухоль яичников у крыс – адекватная доклиническая модель канцероматоза для изучения интраперитонеального химиоперфузионного лечения. Современное состояние вопроса. Сибирский онкологический журнал. 2019; 18 (1): 71–78. – doi: 10.21294/1814-4861-2019-18-1-71-78. (Индексируется Scopus). 2. Kireeva G.S., Gubareva E.A., Tyndyk M.L., Maydin M.A., Panchenko A.V., Anisimov V.N. Does tumor development affect circadian rhythms in the tumor bearing animals – experimental study in two animal models (Подана в журнал Chronobiology International. Индексируется WoS, IF 2.64) Научно-популярная информация о ходе выполнения проекта “Помогут ли часовые гены вылечить рак, выясняют петербургские ученые” доступна на сайте сетевого издания “Доктор Питер”: http://doctorpiter.ru/articles/20448/?fbclid=IwAR0OoXWGGF1mSjoFMXMEuWb2A26PJtUiM0XylK0cXzoSl9oTc1BqwgqlC7Q

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В соответствии с планом работ, проведен эксперимент in vitro с синхронизацией клеточных культур дексаметазоном. В расширение изначального плана, использовано три клеточные линии рака яичника и три линии рака легкого человека. Использовали клеточный анализатор xCELLigence и автоматический клеточный анализатор Cell-IQ . В качестве синхронизирующего агента применяли дексаметазон в концентрации 200 нМ. Показано, что синхронизация клеточных культур дексаметазоном увеличивает их чувствительность к цисплатину. Такой эффект наблюдался в том числе и в резистентных к цисплатину культурах. При этом использование только дексаметазона стимулировало пролиферацию. Таким образом, доказана целесообразность применения препаратов-хронобиотиков для модификации чувствительности опухоли к химиотерапии. Эксперимент in vivo был выполнен на 36 крысах-самках линии Wistar, которые получали локорегиональное (химиоперфузию) или внутривенное введение цисплатина в начале световой и в начале темновой фазы суток. За 6 животными в каждой группе вели динамическое наблюдение, 3 животных были выведены из эксперимента для отбора тканей и органов. Локорегиональное введение цисплатина обеспечивало преимущества в выживании по сравнению с внутривенным введением, а введение в утренние часы – по сравнению с вечерним. Кроме этого, пролиферативная активность опухолей была наименьшей у крыс с химиоперфузией утром и наибольшей – при внутривенном введении вечером. У крыс после химиоперфузии в начале световой фазы наблюдался наименьший уровень поражения почек, печени и кишечного эпителия по сравнению с группами животных с перфузией вечером или при внутривенном введении цисплатина. В свою очередь, внутривенное введение цисплатина утром оказывало меньший токсический эффект по сравнению с введением вечером. Дополнительно к изначальному плану работ, был проведен опыт по изучению фармакокинетики цисплатина при химиоперфузии и внутривенном введении с использованием 18 крыс-самок. У 6 животных из группы отбирали кровь по временным точкам, 3 крысам была проведена эвтаназия для забора образцов. Для определения платины в образцах крови и органов использовали метод масс-спекткрометрии с индуктивно связанной плазмой. У животных, получавших внутривенные инъекции препарата, отмечено большее накопление платины в почках, а также большая концентрация не связанной с белками платины в крови. Таким образом, доказано преимущество химиоперфузионного лечения над внутривенным введением, а также большая эффективность химиотерапии в обоих режимах в утренние часы по сравнению с вечерними. По результатам исследования второго года было опубликовано или принято в печать 4 статьи.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе реализации работ третьего года были проведены все запланированные исследования in vitro и in vivo, а также дополнительное исследование влияния хронобиотика (дексаметазона) на ритмы пролиферации опухолевых клеток и экспрессии в них изучаемых генов in vivo. Исследования на клеточных культурах показало разнонаправленное действие мелатонина и ингибитора мелатониновых рецепторов лузиндола при их комбинации с цитостатиком (цисплатином) на пролиферацию клеток. Установлено, что мелатонин, также как и дексаметазон в более ранних опытах, способствует повышению чувствительности опухолевых клеток к цитостатику, в то время как лузиндол оказывает протекторное действие. Собственный антипролиферативный эффект у препаратов при их использовании in vitro отсутствовал. Исследование in vivo было проведено на модели канцероматоза с использованием 90 крыс-самок линии Вистар. Были сформированы контрольные группы с опухолью, а также группы животных, получавших системную или локорегиональную терапию цисплатином. Каждая группа была разделена на варианты, получавшие мелатонин или плацебо. Исследования показали, что использование мелатонина в качестве хронобиотика при локорегиональной или системной терапии обеспечивает некоторые преимущества в выживаемости экспериментальных животных, которые могут быть отнесены за счет наблюдаемого снижения пролиферативной активности опухолевых клеток, а также снижения повреждающего воздействия цитостатика на кишечный эпителий и почки. Дополнительно, использование хронобиотика полностью нивелировало различи между терапией, проводимой в утренние или вечерние часы, что будет способствовать улучшению результатов лечения в клинической практике. Молекулярно-генетические исследования третьего года подтвердили ранее наблюдаемый феномен снижения уровня экспрессии часовых генов Per2 и Bmal1 в опухолевых тканях животных по сравнению с нормальными, а также сниженную экспрессию онкогена c-Myc в используемой опухоли яичника, что, по-видимому, связано с ее особенностями. Также выявлено, что применение цисплатина приводило к некоторому увеличению экспрессии p21 (Cdkn1a), который кодирует ингибитор циклин-зависимых киназ и часто рассматривается как ген-супрессор опухолевого роста, а также к снижению уровня экспрессии в яичниках Xpa, одного из ключевых генов репарации ДНК. Дополнительно проведенные молекулярно-генетические исследования динамики часовых генов in vivo у животных, получавших хронобиотик дексаметазон, показали, что используемая опухоль яичника не восстанавливает суточные ритмы даже при воздействии синхронизирующих агентов, что свидетельствует о глубине нарушений осцилляции системы часовых генов в опухолевых тканях. По результатам работ третьего года реализации проекта были опубликованы или приняты в печать 5 работ, в том числе 2 – в журналах 1 квартиля (всего 7). Таким образом, проект завершен с превышением заявленного плана работ и достигнутых результатов.