Аннотация результатов, полученных в 2018 году
С использованием массового параллельного секвенирования клинического экзома (5300 генов) и последующего подтверждения выявленных мутаций методом секвенирования по Сэнгеру проведен генетический анализ 15 пациентов с диагнозом гипертрофическая кардиомиопатия. У 10 пациентов обнаружено 13 мутаций в 4 генах, ассоциированных с данным заболеванием (MYBPC3, MYH7, MYL2, TTR). У двух пациентов были выявлены патогенные мутации: p.Q1233X и p.N515del в гене MYBPC3. Пять пациентов являлись носителями нейтральных мутаций: p.V158M, p.V189I, p.S236G, p.R326Q в гене MYBPC3 и p.G26S в гене TTR. Три пациента имели мутации с неизвестной ролью в развитии гипертрофической кардиомиопатии (p.M659I в гене MYH7, p.S478W в гене MYBPC3 и p.R40K в гене MYL2). Мононуклеарные клетки пациентов с мутациями p.M659I в гене MYH7 (статус не известен) и p.R326Q в гене MYBPC3 (нейтральная мутация) были репрограммированы к плюрипотентному состоянию с помощью нуклеофекции эписомными векторами, экспрессирующими гены OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC и LIN28. Полученные клеточные линии имели характерную для плюрипотентных стволовых клеток человека морфологию, экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния (щелочную фосфатазу, транскрипционные факторы OCT4 и NANOG и поверхностные антигены SSEA-4 и TRA-1-60) и были способны дифференцироваться в производные различных зародышевых листков. В полученных клеточных линиях было подтверждено наличие мутаций p.M659I в гене MYH7 и p.R326Q в гене MYBPC3. Таким образом, были получены линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток двух пациентов с гипертрофической кардиомиопатией, являющихся носителями мутаций различного типа.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Из мононуклеарных клеток пациента с мутацией p.N515del в гене MYBPC3 (потенциальная патогенная мутация) и пациента с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 (роль в развитии гипертрофической кардиомиопатии не ясна) были получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Полученные клеточные линии имели характерную для плюрипотентных стволовых клеток человека морфологию, экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния (транскрипционные факторы OCT4 и NANOG и поверхностные антигены TRA-1-60 и SSEA-4) и были способны к спонтанной дифференцировке в производные трех зародышевых листков. Отработан протокол направленной дифференцировки в кардиомиоциты линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с мутациями p.M659I в гене MYH7; p.R326Q в гене MYBPC3; p.N515del в гене MYBPC3; p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1. Полученные в результате направленной дифференцировки клетки были способны спонтанно сокращаться и экспрессировали специфичные для кардиомиоцитов маркеры: кардиальный тропонин Т, саркомерный альфа-актинин, вентрикулярную форму регуляторной легкой цепи бета-миозина. Эффективность направленной дифференцировки пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты составила около 40%. Все типы пациент-специфичных кардиомиоцитов имели больший размер по сравнению с кардиомиоцитами здорового донора. Наибольшая степень гипертрофии была характерна для кардиомиоцитов с нейтральной мутацией p.R326Q в гене MYBPC3, наименьшая степень гипертрофии ‒ для кардиомиоцитов с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1, роль которых в развитии гипертрофической кардиомиопатии не известна. Различий в размерах между кардиомиоцитами с потенциальными патогенными мутациями p.M659I в гене MYH7 и p.N515del в гене MYBPC3 обнаружено не было. По сравнению с кардиомиоцитами здорового донора пациент-специфичные кардиомиоциты с мутациями p.M659I в гене MYH7 и p.R326Q в гене MYBPC3 демонстрировали нарушения в динамике потоков ионов кальция.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Анализ кардиомиоцитов, полученных при направленной дифференцировке индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (ГКМП) и здорового донора (контроль) показал, что все типы пациент-специфичных кардиомиоцитов имели большую площадь по сравнению с контрольными кардиомиоцитами как на 45-й, так и на 60-й дни дифференцировки. Пациент-специфичные кардиомиоциты были гетерогенны по размеру. Наименьшая степень гипертрофии была выявлена у кардиомиоцитов с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 с неясной ролью в развитии ГКМП. Кардиомиоциты с потенциальными патогенными мутациями p.M659I в гене MYH7 и p.N515del в гене MYBPC3 и нейтральной мутацией p.R326Q в гене MYBPC3 не имели значимых различий в размере и характеризовались большей площадью по сравнению с кардиомиоцитами с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1. Исследование динамики потоков ионов кальция в кардиомиоцитах с потенциально патогенной мутацией p.N515del в гене MYBPC3 и мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 с неясной ролью в развитии ГКМП выявило нарушения в регулярности чередования выбросов ионов кальция из саркоплазматического ретикулума и их обратного захвата. Данные нарушения были впервые обнаружены на 40-45-й дни дифференцировки кардиомиоцитов и наблюдались на последующих этапах дифференцировки. На 40-й день дифференцировки кардиомиоциты с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1, p.R326Q в гене MYBPC3 и p.N515del в гене MYBPC3 характеризовались более высокой внутриклеточной концентрацией ионов кальция на стадии покоя. Наиболее высокая внутриклеточная концентрация ионов кальция в состоянии покоя была обнаружена в кардиомиоцитах с нейтральной мутацией p.R326Q в гене MYBPC3, а наименьшая внутриклеточная концентрация ионов кальция в состоянии покоя – в кардиомиоцитах с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 с неясной ролью в развитии ГКМП. В пациент-специфичных кардиомиоцитах был повышен уровень экспрессии генов, ассоциированных с ГКМП (гены GATA4, MEF2C, NPPA), и генов саркомерных белков (гены MYH7, MYL2, TNNT2) по сравнению с кардиомиоцитами здорового донора. Однако был выявлен ряд различий в паттерне экспрессии этих генов между различными типами пациент-специфичных кардиомиоцитов. Между пациент-специфичными и контрольными кардиомиоцитами не было выявлено значимых различий по уровню экспрессии генов, участвующих в регуляции гомеостаза ионов кальция (гены RYR2, SERCA2, PLN), за исключением снижения уровня экспрессии гена PLN в кардиомиоцитах с потенциально патогенной мутацией p.N515del в гене MYBPC3.