Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В соответствие с планом работа по проекту в отчетный период проводилась в четырех направлениях, по которым были получены следующие основные результаты. I. Изучение механизма зависимости экспрессии гена MMP3 от размеров эмбриона. С помощью репортерного делеционного анализа промоторной области гена ММР3 в этой области был локализован фрагмент в 200 нуклеотидов, ответственный за регуляцию экспрессии в зависимости от размера эмбриона. В результате анализа нуклеотидной последовательности этого фрагмента в нем были выявлены потенциальные сайты связывания для ряда транскрипционных факторов. Кроме того, с помощью мутационного анализа была изучена роль найденного ранее в промоторной области ММР3 сайта связывания эффектора бета-катенинового сигнального пути в размер-зависимой регуляции экспрессии ММР3. В результате было установлено, что данный сайт не имеет отношения к такой регуляции. II. В отчетный период работы по проекту был также изучен механизм ингибирования функции ингибитора эмбрионального индуктора Chordin - протеиназы Tolloid - протеиназой ММР3. Было установлено, что MMP3, связываясь с Tolloid, блокирует отщепление от Tolloid продомена. В результате Tolloid остается не активным и не может разрушать Chordin. Как мы показали в ходе При уменьшении размера эмбриона экспрессия ММР3 резко снижается. В результате Tolloid оказывается блокирован в меньшей степени и, соответственно, он более активно режет Chordin. В результате дорсо-вентральный градиент Chordin сокращается, что приводит к уменьшению индуцируемых Chordin структур осевого комплекса органов. III. Изучение молекулярных функций и роли в сейлинге идентифицированного ранее потенциального скейлера - гена, кодирующего трансмембранный транспортный белок из семейства solute carrier, SLC16A6, и в отличие от MMP3, резко усиливающего свою экспрессию в уменьшенных эмбрионах. В результате было установлено, что оверэкспессия SLC16A6 в эмбрионах шпорцевой лягушки, имитирующая возрастание его экспрессии в уменьшенных эмбрионах, вызывает сужение территорий экспрессии головных маркерных генов и последующее уменьшение головных структур. На основании этого эффекта было высказано предположение, что возможно SLC16A6 усиливает активность сигнальных путей, связанных с ретиноевой кислотой и ее производными. Как известно, эти метаболиты вызывают аналогичные эффекты и в нормальном развитии регулируют размеры головных структур. В соответствие с планом работ, была клонирована в люциферазный репортерный вектор NanoLuc промоторная область гена SLC16A6 размером в 2.2 кб. Были проведены эксперименты по исследованию влияния изменения размеров эмбриона на экспрессию этой конструкции. К сожалению, не было выявлено эффекта изменения экспрессии в зависимости от размеров эмбриона. IV. Поиск скейлеров - генов с экспрессией зависимой от размеров эмбриона - на стадии ранней гаструлы у шпорцевой лягушки, а также у эмбрионов организмов, эволюционно далеких от лягушки - у морского ежа и у гидроида Nematostella. В рамках этого направления была проведена экспедиция на Беломорскую Биологическую Станцию МГУ, где были собраны нормальные и половинные эмбрионы морского ежа Strongilocentrotus pallidus на стадии поздней бластулы. Образцы РНК из собранных эмбрионов были переданы для последующего танскриптомного секвенирования. Проведенный в компанию Евроген. VI. Математическое моделирование процессов эмбрионального скейлинга у эмбрионов шпорцевой лягушки на основе наших собственных и литературных данных. Обнаружено явление активного антискейлинга хордомезодермы, когда у эмбрионов различного размера изначально различные по размеру зачатки в итоге развиваются в одинаковые по размеру структуры презумптивной хорды. Для изменения размеров эмбрионального зачатка, дифференцировка которого регулируется за счет конкурентных механизмов, предложена компактная феноменологическая модель, имеющее решение в виде бегущей волны. Для явления антискейлинга хорды предложен механизм, основанный на регуляции размеро-зависимым белком MMP3 бегущей волны разрастания/сужения области хордомезодермы.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном году проводились работы, направленные на экспериментальное и теоретическое обоснование выдвинутой нами ранее гипотезы о скейлерах – специальных генах, ответственных за зависящую от размеров эмбрионов регуляцию градиентных систем морфогенов, которые обеспечивают ранний эмбриональный паттернинг. Главным достижением отчетного периода можно считать завершение работы по изучению роли протеиназы MMP3 в регуляции градиентов Chordin, Noggin1 и Noggin2 в процессе формировании дорсзо-вентрального паттерна у эмбриона шпорцевой лягушки. Было установлено, что ММР3 деградирует эмбриональные индукторы Noggin1 и Noggin2, а также зрелую форму протеиназы Tolloid, которая является ингибитором другого известного эмбрионального индуктора - Chordin. Таким образом, ММP3, с одной стороны, проявляет себя как ингибитор эмбриональных индукторов Noggin1 и Noggin2, а с другой, как активатор эмбрионального индуктора Chordin. С учетом этих данных, с помощью математического моделирования было показано, что при резком снижении концентрации ММР3, наблюдаемом при уменьшении размеров эмбрионов, происходит увеличение амплитуды и небольшое расширение дорсо-внтральных градиентов медленно диффундирующих Noggin1 и Noggin2, но, в то же время, сокращение аналогичного градиента сравнительно хорошо диффундирующего Chordin. Учитывая, что градиент Chordin в основном определяет размер сомитной мезодермы, в то время, как градиенты Noggin1 и Noggin2 задают размер хорды, можно заключить, что полученные предсказания модели хорошо объясняют наблюдаемые при уменьшении размеров эмбриона явления скейлинга сомитной мезодермы и антискейлинга хорды. Важным результатом работы в отчетный период была локализация короткого участка промоторной области гена ММР3, в которой были обнаружены сайты связывания трех транскрипционных факторов, способных изменять свою локализацию между клеточным ядром и цитоплазмой в зависимости от механических напряжений, испытываемых клеткой. Наши независимые косвенные данные указывают, что в основе механизма, обеспечивающего размер-зависимую регуляцию экспрессии Ммр3, может лежать ее чувствительность к механическим напряжений в эмбриональных тканях, которые могут отличаться в эмбрионах разных размеров, выполняя, таким образом, роль датчика геометрических размеров эмбриона. Соответственно, мы предполагаем, что разница в экспрессии Ммр3 в нормальных и половинных эмбрионах может быть обусловлена разным распределением одного или нескольких из вышеуказанных транскрипционных регуляторов между ядром и цитоплазмой. Еще одним важным результатом работы стало выявление нескольких генов, потенциально способных выполнять роль скейлеров, у двух других модельных объектов, значительно удаленных друг от друга на эволюционном дереве: у морского ежа Strongylocentrotus pallidus и у актинии Nematostella vectenesis. Было показано, что на стадии поздней бластулы-ранней гаструлы экспрессия этих генов резко изменяется в половинных эмбрионах указанных модельных животных по сравнению с эмбрионами нормального размера. В целом, результаты, полученные в ходе работы по проекту в отчетном году, хорошо подтверждают гипотезу о регуляции эмбрионального паттернинга в эмбрионах разны размеров особыми генами, важной характеристикой которых является не пропорциональное изменение экспрессии при изменении размеров эмбриона. Основные результаты работы были оформлены в виде статьи, которая в настоящее время находится на рецензии в высоко рейтинговом журнале Developmental Cell. Ряд методик и подходов, разработанных в ходе работы над проектом, были с успехом использованы в работах по другим темам, что позволило выпустить несколько публикаций с указанием поддержки из средств текущего гранта РНФ, в том числе, две из них в журналах квартиля Q1

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном году проводились работы, направленные на обоснование выдвинутой нами ранее гипотезы о скейлерах – специальных генах, ответственных за зависящую от размеров эмбрионов регуляцию градиентных систем морфогенов, обеспечивающих ранний эмбриональный паттернинг. Основным достижением отчетного периода можно считать локализацию в составе промоторной области гена металлопротеиназы mmp3 лягушки Xenopus laevis сайтов связывания факторов, ответственных за регуляцию экспрессии этого гена на стадии гаструляции в зависимости от размера эмбриона. Было показано, что мутации этих сайтов приводят к блокированию реакции изученного фрагмента промотора mmp3 на изменение размера эмбриона. Ранее мы продемонстрировали роль резкого снижения экспрессии протеиназы mmp3 у эмбрионов половинного размера в скейлинге градиентов морфоненных белков Chordin, Noggin1 и Noggin2. Однако механизмы такого резкого снижения экспрессии mmp3 у эмбрионов половинного размера оставались не известным. Выявление в промоторе гена mmp3 сайтов связывания транскрипционных факторов, регулирующих его экспрессию в зависимости от размера эмбриона открывает путь к выяснению этих механизмов. Также важным результатом работы в отчетный период было выявление нескольких потенциальных генов-скейлеров у морского ежа Strongilocentrotus droebachiensis и актинии Nemstostella vectenesis. Было показано, что секретируемая металлопротеиназа SpAN10, кодируемая одним из таких генов морского ежа, способна разрушать морфогенный белок Chordin. Учитывая, что согласно полученным нами данным экспрессия SpAN10 резко возрастает у эмбрионов половинного размера, можно предположить, что эта металлопротеиназа действительно играет роль скейлера, способствуя правильному скейлингу дорсо-венетрального градиента Chordin в период гаструляции у морского ежа. Примечательно, что среди потенциальных скейлеров, выявленных в отчетный период у актинии Nemstostella vectenesis и экспрессирующихся в период гаструляции так же было найдено несколько секретируемых металлопротеиназ. В связи с этим логично предположить, что секретируемые металлопротеиназы, возможно, играют роль универсальных регуляторов скейлинга морфогенетических градиентов в эмбриогенезе организмов, принадлежащих к самым разным типам многоклеточных животных. За отчетный период было опубликовано две статьи в журналах квартиля Q1, одна из них в самом высокорейтинговом журнале по биологии развития - Developmental Cell.