Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В последние годы активно развиваются технологии для получения лазер-генерируемых ускоренных электронов. Лазер-генерируемые пучки ускоренных электронов отличаются сверхкороткими импульсами в диапазоне от фемто- до пикосекунд. Однако конструкторские разработки в этой области намного опережают радиобиологические исследования. Существуют лишь единичные публикации о биологических эффектах ультракоротких электронных импульсов. Мощность дозы излучения во время импульса достигает колоссальных значений (до десятков ГГр/с), а время самого импульса (от сотен фс до нескольких пс) несоизмеримо меньше времени полужизни (t1/2) свободных радикалов (для примера t1/2 гидроксил радикала ~ 1 нс). Это позволяет предположить, что при сверхкоротком импульсном излучении происходят ранее неизученные физико-химические процессы, которые могут повлиять на радиобиологическую эффективность излучения. В 2019 г. были проведены сравнительные исследования индукции критических повреждений ДНК и эффективности их репарации в культивируемых клетках человека, облученных субпикосекундным импульсным и квазинепрерывным излучением. Исследования были выполнены на культуре фибробластов легких человека MRC-5 и культурах опухолевых клеток человека HeLa (рак шейки матки) и A549 (аденокарцинома легких). Клетки культивировались в стандартных условиях СО2-инкубатора (5 % СO2, 37°C) с использованием сред и сывороток, рекомендованных ведущей глобальной организацией биологических материалов и стандартов (ATCC) для культивирования каждой конкретной клеточной линии. Облучение клеток субпикосекундными пучками электронов проводили на линейном ускорителе с лазерным фотокатодом АРЕАЛ (AREAL-Advanced Research Electron Accelerator Laboratory) в Институте Синхротронных Исследований “КЕНДЛ” (CANDLE -Center for the Advancement of Natural Discoveries using Light Emission) Республики Армения. Основные параметры электронного пучка: энергия электронов - 3.6 МэВ, заряд импульса - 30 пКл, длительность импульса - 450 фс, частота повтора импульсов – 2 Гц. Облучение клеток квазинепрерывным электронным излучением проводили на линейном ускорителе электронов Varian Trilogy (Varian Medical Systems, США). Характеристики: энергия электронов - 4 МэВ, мощность дозы 4 Гр/мин. В качестве источника квазинепрерывного фотонного излучения использовали рентгеновские установки РУСТ-М1 (Россия) и РУМ-17 (Россия), мощность дозы 0.85 и 0.24 Гр/мин, соответственно. Отдельно стоящей задачей проекта было изучение влияния лазерного фемтосекундного излучения на индукцию двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК). Облучение клеток проводили с использованием комплекса фемтосекундной лазерной нанохирургии, разработанный в лаборатории био- и нанофотоники ФИЦ ХФ РАН (лазер Mai-Tai Spectra-Physics, длина волны 795 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц). При малых значениях энергии одного импульса порядка 1-2 нДж, за счёт использования объективов с числовой апертурой 0.7 и выше достигается высокая плотность потока мощности порядка 10 ТВт/см^2, что и обеспечивает высокую эффективность многофотонных процессов. Результатом многофотонного поглощения фемтосекундного лазерного излучения является образование плазмы низкой плотности за счет процессов многофотонной ионизации и туннельной ионизации. Таким образом, фемтосекундное лазерное излучение можно рассматривать как ионизирующее излучение, обладающее при этом высокой степенью локализации. Оценку особенностей индукции и репарации двунитевых разрывов (ДР) проводили с использованием иммуноцитохимического окрашивания клеток антителами, специфичными к белкам, участвующих в процессах репарации ДР. Во время распознавания и репарации ДР ДНК происходит образование динамических микроструктур, получивших название foci и содержащих от сотен до тысяч копий различных белков, задействованных в этих процессах (гаммаН2АХ, фосфо-АТМ, 53BP1, RAD51 и др.). Количественный анализ фокусов белков репарации ДНК и их локализации/солокализации в пострадиационный период позволяет дать ответ не только о количестве ДР, но и об эффективности и механизмах их репарации. Визуализацию, документирование и обработку иммуноцитохимических микроизображений осуществляли на люминесцентном микроскопе Nikon Eclipse Ni-U (“Nikon”, Япония), оснащенном видеокамерой высокого разрешения ProgRes MFcool (“Jenoptik AG”, Германия). Анализировали не менее 200 клеток на точку. Для автоматического анализа фокусов белков репарации ДНК использовали программные пакеты DARFI (Озеров, 2014, https://github.com/varnivey/darfi) и FociCounter (http://focicounter.sourceforge.net/). На первом этапе исследований был проведен сравнительный анализ кривых «доза-эффект» образования фокусов белков-маркеров двунитевых разрывов ДНК (γH2AX/53BP1) в клетках линий MRC-5, HeLa и А549, облученных субпикосекундным импульсным (ускоритель AREAL) и квазинепрерывным излучением (ускоритель Varian Trilogy). Было показано, что через 60 мин после облучения, вне зависимости от типа излучения, дозовые зависимости изменений количества фокусов γH2AX/53BP1 в облученных клетках хорошо аппроксимируются линейными уравнениями. Количественный выход фокусов, в пересчете на единицу дозы, был на 7-15 % выше в клетках, облученных импульсным излучением. Однако эти различия не были статистически достоверными (р>0,05). Не было также отмечено различий при сравнении линейных угловых коэффициентов. В целом, проведенные исследования показали, что количественный выход двунитевых разрывов ДНК в облученных клетках существенно не зависит от режима облучения: субпикосекундное импульсное или квазинепрерывное. Также не было отмечено статистически достоверных различий выхода двунитевых разрывов ДНК при облучении клеток электронным или рентгеновским излучением. Результаты исследований влияния лазерного фемтосекундного излучения показали, что после облучения клеток фемтосекундными импульсами с энергией 1.0 и 1.5 нДж и общей экспозицией до 180 мс в клеточных ядрах отмечаются выстроенные в ряд одиночные фокусы белков гаммаН2AX и 53BP1. Увеличение энергии импульсов до 2.0 нДж с сокращением времени экспозиции до 60 мс приводит к образованию треков, состоящих из фокусов белков гаммаН2AX и 53BP1, локализованных строго в местах прохождения луча лазера по клеточным ядрам. Визуально треки очень похожи на треки, образующиеся после облучения клеток корпускулярным ионизирующим излучением с высокой линейной передачей энергии (ЛПЭ). Можно полагать, что фемтосекундное лазерное излучение можно использовать для моделирования процессов повреждения ДНК плотноионизирующим излучением в живых клетках. Дальнейшее увеличение энергии импульсов до 2.5-3.0 нДж приводило к локальному вскипанию (абляции) клеток. На следующем этапе работы по проекту были проведены исследования кинетики репарации двунитевых разрывов ДНК в опухолевых и нормальных клетках человека, облученных импульсным и квазинепрерывным ионизирующим излучением. Было показано, что в клетках, облученных импульсным излучением, эффективность репарации ДР ДНК значительно ниже по сравнению с репарацией ДР ДНК, индуцированных квазинепрерывным ионизирующим излучением. Так, в клетках, облучённых квазинепрерывным ионизирующим излучением, через 4-6 ч после воздействия количество фокусов снижалось ~ на 60-70 % по сравнению с количеством фокусов гаммаН2AX, регистрируемых в точке максимума (1ч после облучения), а через 24-48 ч после облучения ~ на 90-95 %. Через 4-6 ч после воздействия субпикосекундного импульсного излучения отмечалось снижение количества фокусов всего лишь на 40-50 %, а через 24-48 ч на 70-80 %. Низкая эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК, индуцированных импульсным излучением, наблюдалась как в нормальных, так и в опухолевых клетках, что не позволяет на данном этапе исследований сделать заключение о большей противоопухолевой эффективности действия импульсного излучения. На следующем этапе работы были проведены исследования вклада гомологичной рекомбинации в репарацию двунитевых разрывов ДНК в клетках, облученных импульсным и квазинепрерывным ионизирующим излучением. Было обнаружено, что вклад гомологичной рекомбинации в репарацию двунитевых разрывов ДНК, индуцированных импульсным излучением, был выше по сравнению с репарацией разрывов, индуцированных квазинепрерывным излучением. Аналогичные закономерности были выявлены и при облучении фемтосекундным лазерным излучением. Однако необходимо отметить, что существенная вариабельность этого показателя не позволяет сделать однозначное заключение и требует проведения дополнительных исследований. На заключительном этапе работы проводили сравнительные исследования количества остаточных фокусов репарации ДНК в опухолевых и нормальных клетках человека, облученных импульсным субпикосекундным и квазинепрерывным ионизирующим излучением. Результаты работы показали, что количество остаточных фокусов γH2AX/53BP1, регистрируемых через 24-48 ч после воздействия импульсного излучения выше, чем после воздействия квазинепрерывного излучения. Повышенный выход остаточных фокусов подтверждает вывод о низкой эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК, индуцированных импульсным субпикосекундным излучением. Дополнительно на клетках линии MRC-5 были проведены исследования цитогенетических эффектов с помощью микроядерного теста и клеточной гибели по механизму апоптоза с помощью проточно-цитометрического анализа Annexin-V позитивных клеток. Показано, что биологическое действие импульсного субпикосекундного излучения характеризуется выраженной индукцией апоптоза и низким выходом клеток с микроядрами вследствие элиминации поврежденных клеток по сравнению с эффектами квазинепрерывного излучения. В целом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что импульсное субпикосекундное излучение приводит к образованию более сложных и труднорепарируемых повреждений ДНК, по сравнению с квазинепрерывным. Необходимо продолжать исследования механизмов биологического действия импульсного субпикосекундного излучения.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Лазер-генерируемые пучки ускоренных электронов отличаются от обычных квазинепрерывных сверхкороткими импульсами в диапазоне от фемто- до пикосекунд. Преимуществом лазер-генерируемых ультракоротких электронных пучков для применения в клинической практике является то, что они имеют моноэнергетический спектральный профиль и обладают меньшим боковым рассеиванием. Возможность создания направленных ультракоротких импульсов с пиковой мощностью до десятков ГГр/с на импульс, при малой дозе за 1 импульс, дает возможность ювелирно-дозированного локального воздействия на солидные опухоли с минимальным облучением нормальных тканей. Однако, прежде чем использовать ускорители лазер-генерируемых сверхбыстрых электронов в клинической практике, необходимо доказать радиобиологическую эффективность ультракороткого импульсного излучения по сравнению с квазинепрерывным электронным излучением медицинских линейных ускорителей. В ходе выполнения первого этапа проекта было показано, что двунитевые разрывы (ДР) ДНК, индуцированные импульсным субпикосекундным излучением, репарируются более медленно по сравнению с ДР ДНК, возникших при воздействии квазинепрерывного излучения. Труднорепарируемые повреждения приводят к аресту клеточного цикла, снижению пролиферативной активности и клеточной гибели, поэтому в 2020 году основной акцент был сделан на изучение клеточных эффектов субпикосекундного излучения. Исследования были выполнены на культуре фибробластов легких человека MRC-5 и культурах опухолевых клеток человека HeLa (рак шейки матки) и A549 (аденокарцинома легких). Клетки культивировались в стандартных условиях СО2-инкубатора (5 % СO2, 37°C) с использованием сред и сывороток, рекомендованных ATCC для культивирования каждой конкретной клеточной линии. Клетки облучали в фазе экспоненциального роста (плотность клеточной популяции ~70%). Облучение клеток субпикосекундными пучками электронов проводили на линейном ускорителе с лазерным фотокатодом АРЕАЛ (AREAL-Advanced Research Electron Accelerator Laboratory) в Институте Синхротронных Исследований “КЕНДЛ” (CANDLE -Center for the Advancement of Natural Discoveries using Light Emission) Республики Армения. Основные параметры электронного пучка: энергия электронов - 3.6 МэВ, заряд импульса - 30 пКл, длительность импульса - 450 фс, разброс по энергии ~ 2 %, частота повтора импульсов от 2 до 20 Гц, поперечные размеры пучка электронов – 15 мм. Получаемый для экспериментальных исследований электронный пучок имел воспроизводимые характеризующие параметры, измеряемые и сверяемые перед каждым экспериментом. Облучение клеток квазинепрерывным электронным излучением проводили на линейном ускорителе электронов Varian Trilogy (Varian Medical Systems, США). Характеристики: энергия электронов - 4 МэВ, мощность дозы 5.6 Гр/мин, поперечные размеры пучка электронов 250*250 мм. В качестве референтного излучения использовали рентгеновское излучение. Облучение проводили на рентгеновской биологической установке РУСТ-М1 (Россия), оснащенной двумя рентгеновскими излучателями. Характеристики: мощность дозы 0.85 Гр/мин, напряжение 200 кВ, ток 2.5 мА, фильтр 1.5 мм Al. Выбор рентгеновского излучения в качестве референтного обусловлен хорошей изученностью его радиобиологических эффектов. Корректность такого подхода подтверждается его использованием в уже имеющихся публикациях по оценке общей биологической эффективности импульсного облучения ускоренными электронами (Laschinsky et al., 2012). Отдельно стоящей задачей проекта было изучение влияния лазерного фемтосекундного излучения на индукцию двунитевых разрывов ДНК. Основным процессом, лежащим в основе применения фемтосекундных лазерных импульсов ближнего ИК диапазона (700-1000 нм) в качестве микрохирургического инструмента, является многофотонное поглощение. Даже при малых значениях энергии одного импульса порядка 1-2 нДж, за счёт использования объективов с числовой апертурой 0.7 и выше достигается высокая плотность потока мощности порядка 10 ТВт/см^2, что и обеспечивает высокую эффективность многофотонных процессов. Стоит отметить, что в силу нелинейной зависимости поглощённой энергии от интенсивности лазерного излучения, достигается высокая степень локализации воздействия – многофотонные процессы поглощения протекают эффективно только лишь в области максимальной плотности потока мощности. Результатом многофотонного поглощения фемтосекундного лазерного излучения является образование плазмы низкой плотности за счет процессов многофотонной ионизации и туннельной ионизации. Таким образом, фемтосекундное лазерное излучение можно рассматривать как ионизирующее излучение, обладающее при этом высокой степенью локализации. Для исследования воздействия фемтосекундного лазерного излучения использовали комплекс фемтосекундной лазерной нанохирургии, разработанный в лаборатории био- и нанофотоники ФИЦ ХФ РАН. Для облучения использовалось фемтосекундное лазерное излучение (лазер Mai-Tai Spectra-Physics, диапазон длин волн от 700 до 1000 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц), совмещённое с оптической осью инвертированного микроскопа Olympus IX 71 и сфокусированное на объект исследования объективом Olympus 60x, N.A. 0,7. Для контроля экспозиции облучения использовался механический прерыватель SH05 Thorlabs (минимальная экспозиция 10 мс). Прерыватель использовали в двух режимах: 1) одиночные экспозиции выбранного объекта; 2) автоматическая модуляция фемтосекундного лазерного излучения с заданной экспозицией и скважностью. В обоих случаях механический прерыватель выделял из лазерного излучения цуги фемтосекундных импульсов заданной длительности. В ходе исследований влияния импульсного и квазинепрерывного излучения на пролиферативную активность клеток было показано, что импульсное излучение более эффективно снижает пролиферативную активность опухолевых и нормальных клеток по сравнению с квазинепрерывным, однако эти различия не являются статистически достоверными. Одним из основных методов для изучения эффективности биологического действия ионизирующего излучения является анализ репродуктивной гибели клеток (клоногенный тест). Именно потеря репродуктивной способности является наиболее общей характеристикой клеточной популяции. Так, клетка, сохраняющая способность к биосинтезу белков и ДНК, а также способная митотически поделиться один или два раза, но не образующая большого количества потомства, считается погибшей как репродуктивная единица в популяции клеток. Именно на основе данных клоногенного анализа строят кривые выживаемости клеток, что являются основой количественной радиобиологии. Согласно полученным данным, квазинепрерывное электронное излучение оказалось наименее эффективным по сравнению с рентгеновским и импульсным излучением для всех линий клеток. Параметр α оказался наиболее высоким для кривых выживаемости клеток линий MRC5 и A549 после импульсного облучения, тогда как для клеток линии HeLa он соответствовал показателю для рентгеновского излучения. Причем, наиболее эффективным оказалось импульсное излучение для неопухолевых клеток линии MRC5. Принимая во внимание тот факт, что длительность ультракороткого импульса электронов намного короче длительности первичных физико-химических процессов в облученных клетках и высокую вероятность межтрековых взаимодействий вследствие огромной пиковой мощности, можно предположить повышенную вероятность образования сложных труднорепарируемых повреждений ДНК, ведущих в дальнейшем к гибели клетки. Это подтверждается результатами первого этапа выполнения проекта. В пользу этого выступает и высокие значения параметра α кривых выживаемости, который характеризует начальный наклон кривой выживаемости и соответствует одномишенной одноударной модели гибели клеток. Действительно, для кривых выживаемости клеток линий MRC5 и A549 характерна практически линейная зависимость фракций выживших клеток от дозы импульсного излучения. Таким образом, наиболее эффективным для индукции репродуктивной гибели клеток линий MRC5 и A549 оказалось лазер-генерируемое ультракороткое импульсное облучение электронами, где соотношение α/β(Гр-1) имеет самые высокие значения (36.7 и 28.0, соответственно). Дополнительно проводили исследования клеточной гибели по механизмам апоптоза и аутофагии. Было показано, что через 4 ч после облучения отмечается дозозависимое увеличение доли аутофагических клеток и клеток в стадии раннего апоптоза. Через 24 ч после облучения регистрировалось дозозависимое увеличение доли клеток в стадии раннего и позднего апоптоза. Однако, в целом соотношение клеток, гибнущих по механизмам апоптоза и аутофагии, в большей степени зависела от типа клеток и дозы излучения, чем от режима облучения (квазинепрерывное или импульсное). Взаимодействие фемтосекундного лазерного излучения ближнего ИК-диапазона (700 -1000 нм) с биологическими объектами основано на эффекте многофотонного поглощения, т.к. в данном диапазоне однофотонное поглощение органическими соединениями практически отсутствует. Для обеспечения необходимой эффективности многофотонного поглощения с целью проведения локальной деструкции биологического материала пиковая плотность потока мощности фемтосекундного лазерного излучения должна составлять 10^12 Вт/см^2. При использовании 100 фс лазерных импульсов и объективов с числовой апертурой 0,7-1,0 энергия импульса должна составлять порядка 1 нДж. При этом фемтосекундный лазерный осциллятор генерирует импульсы с частотой повторения 80 МГц. При описанных условиях проведения эксперимента энергия импульса 1нДж является пороговой для образования парогазового пузыря, который, в свою очередь, является индикатором протекания локальных термических эффектов. Более того, наши исследования демонстрируют образование локальных светопоглощающих центров в области облучения биологического материала фемтосекундным лазерным излучением. В результате, биологический материал в области облучения начинает поглощать излучение в однофотонном режиме, что приводит к резкому увеличению поглощённой энергии с последующим резким локальным скачком температуры и давления. Это и приводит к наблюдению парогазового пузыря при облучении биологических объектов фемтосекундным лазерным излучением с плотностью потока мощности выше 10^12 Вт/см^2. Используя облучение с плотностью мощности ниже порога образования парогазового пузыря, можно добиться сильно локализованной модификации биологического материала. В ходе наших исследований было показано, что через 24 ч после микролокального облучения клеток фемтосекундными импульсами с энергией 0.5 нДж регистрируется практически полная потеря пролиферативной активности как опухолевых, так и нормальных клеток. В то время как микролокальное облучения клеток фемтосекундными импульсами с энергией 1.0-2.0 нДж индуцирует гибель нормальных и опухолевых клеток по механизму апоптоза. Дальнейшее увеличение энергии импульсов до 2.5-3.0 нДж приводит к локальному вскипанию (абляции) клеток, при этом отмечается увеличение частоты апоптотических клеток в областях прилегающих к траектории прохождения луча лазера. Таким образом, проведенные исследования показали, что импульсное субпикосекундное излучение по своей противоопухолевой эффективности не уступает классическому квазинепрерывному. В ходе выполнения предыдущего этапа проекта было показано, что импульсное субпикосекундное излучение приводит к образованию более сложных и труднорепарируемых повреждений ДНК, по сравнению с квазинепрерывным. Результаты анализа кривых выживания облученных клеток подтверждают этот феномен. Можно предположить, что при субпикосекундном облучении с колоссальной пиковой мощностью увеличивается вероятность межтрековых взаимодействий. Однако для окончательного заключения необходимы детальные исследования физико-химических механизмов биологического действия импульсного субпикосекундного излучения.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Лазер-генерируемые пучки ускоренных частиц характеризуются сверхкороткой длительностью (от фемто- до пикосекунд), высокой мощностью дозы во время импульса (до десятков ГГр/c), моноэнергетическим спектральным профилем и низким боковым рассеиванием. Примером такой установки может служить лазерный ускоритель электронов AREAL (Advanced Research Electron Accelerator Laboratory, Армения). Активно обсуждается возможность использования лазерных ускорителей в медицине. С одной стороны, возможность создания направленных ультракоротких импульсов, дает возможность ювелирно-дозированного локального воздействия на солидные опухоли с минимальным облучением нормальных тканей. С другой, механизмы биологического действия ультракороткого импульсного пока мало изучены. Так, длительность облучения ультракороткими пучками несоизмеримо меньше времени полужизни (t1/2) свободных радикалов (для примера t1/2 гидроксил радикала ~ 1 нс (10^-9), что позволяет предположить возникновение неизученных ранее физико-химических процессов, которые могут повлиять на радиобиологическую эффективность импульсного излучения. В ходе исследований 2021 г была проведена оценка относительной биологической эффективности (ОБЭ) субпикосекундного импульсного электронного излучения c разной частотой импульсов по сравнению с эффектами референтного рентгеновского излучения для опухолевых клеток человека HeLa (карцинома шейки матки) и A549 (аденокарцинома легкого с р53 дикого типа), а также фибробластов легкого эмбриона человека MRC-5. Было показано, что ОБЭ импульсного электронного излучения с энергией электронов 3.6 МэВ и частотой 2 Гц в зависимости от клеточных линий варьирует от 1.07 до 1.41 (MRC-5 – 1.41; HeLa – 1.07; А549 – 1.18). В то время как ОБЭ импульсного электронного излучения с энергией электронов 3.6 МэВ и частотой 20 Гц варьирует от 1.16 до 1.5 (MRC-5 – 1.50; HeLa – 1.16; А549 – 1.40). В целом, результаты исследований показали, что ОБЭ импульсного электронного излучения несколько выше (в 1.1-1.5 раза) по сравнению с референтным рентгеновским излучением, однако этот показатель существенно варьирует от типа клеток. В ходе работы был также проведён подбор оптимального режима облучения электронными импульсами, вызывающего наиболее выраженный эффект в культурах опухолевых клеток. Для подбора оптимального режима облучения клетки линий А549 и HeLa облучали электронными импульсами с частотой 2 и 20 Гц и мощностью дозы от 1.17 ± 0.02 Гр/мин до 11.70 ± 0.98 Гр/мин в дозах от 0.25 до 10 Гр. Было показано, что в изученном диапазоне частот, режим облучения существенно не влияет на выраженность исследованных радиобиологических эффектов (эффективность репарации двунитевых разрывов (ДР) ДНК, пролиферативная активность, интерфазная и репродуктивная клеточная гибель) . Возможно, что различия будут проявляться при более существенных разбросах в частотах импульсов (от нескольких Гц до кГц). Однако технические параметры установки AREAL пока не позволяют провести такие исследования. В ходе выполнения работы был проведен полногеномный транскриптомный анализ и созданы библиотеки мРНК клеток линий A549, H1299 (p53 дефицитная аденокарцинома легкого), HeLa и MRC5, облученных импульсным или квазинепрерывным электронным излучением. С помощью алгоритма iPanda (Ozerov et al. In silico Pathway Activation Network Decomposition Analysis (iPANDA) as a method for biomarker development. Nat Commun., 2016) был проведен сравнительный анализ изменения активности сигнальных путей клеток через 4 и 24 часа после облучения в дозе 2 Гр. Для анализа были выбраны основные пути, важные в контексте радиационно-индуцированных эффектов: различные механизмы репарации ДНК и клеточной гибели, основные пути рецепции и передачи сигнала о повреждениях ДНК и регулирования контрольных точек клеточного цикла. Изменение активации сигнальных путей через 4 часа после воздействия не является значимым для большинства рассмотренных путей. Такой эффект является ожидаемым, поскольку клеточный ответ на воздействие излучения на транскрипционном уровне запаздывает по сравнению с ответом на уровне протеома и метаболома. В то же время через 24 часа после воздействия наблюдаются значительные изменения на уровне транскрипции, которые наблюдаются во всех исследованных типах клеток при обоих режимах облучения. Тем не менее, видны значимые различия на уровне отдельных сигнальных путей между клетками разных линий после воздействия импульсным и квазинепрерывного излучения. Полученные данные свидетельствуют о том, что на транскрипционном уровне ответ нормальных клеток MRC5 на облучение при разных режимах существенно отличается от ответа опухолевых клеток A549, H1299 и HeLa, для которых отмечаются более выраженные различия между эффектами квазинепрерывного и импульсного режимов облучения. Исследования механизмов ДНК-повреждающего действия сфокусированного фемтосекундного инфракрасного импульсного излучения показали, что воздействие сфокусированным фемтосекундным лазерным излучением (λ=794 нм, длительность 100 фс, энергия импульсов 1-2 нДж) приводит к образованию в облученных клеточных ядрах треков, состоящих из белков XRCC1 и γH2AX. Интересно, что эффект наблюдается только в узком диапазоне энергий импульсов. При энергии от 0.5 нДж и меньше образование треков не происходит, при энергии больше 2 нДж происходит локальная абляция клеточных структур. Известно, что XRCC1 является одним из ключевых белков эксцизионной репарации ДНК. Т.е. направленное фемтосекундное лазерное излучение с исследованными характеристиками индуцирует множественные повреждения ДНК, предположительно — окисленные основания и однонитевые разрывы ДНК, которые активируют механизмы эксцизионной репарации. С фосфорилированным коровым гистоном H2AX (γH2AX) ситуация менее однозначная. С одной стороны, γH2AX является общепринятым маркером двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК), а с другой — фосфорилирование Н2АХ может осуществляться киназой ATR, которая активируется в ответ на появление участков однонитевой ДНК, возникших в результате эксцизионной репарации нуклеотидов. Для заключения о том, что фемтосекундное лазерное излучение может индуцировать ДР ДНК необходимо использование более специфичного белка-маркера. В качестве такого белка-маркера была выбрана фосфорилированная киназа AТМ (фосфо-АТМ). Фосфо-АТМ является основной киназой, фосфорилирующей гистон Н2AX в ответ на появление "истинных" радиационно-индуцированных ДР ДНК. Активность АТМ в ответ на одноцепочечную ДНК и одноцепочечный разрыв существенно не изменяется, а спонтанное фосфорилирование АТМ наблюдается редко. В связи с этим фосфо-АТМ является более специфическим биологическим маркером для количественной оценки радиационно-индуцированных ДР ДНК, чем γH2AX. Иммуноцитохимический анализ показал, что через 30 мин после облучения клеток фемтосекундными импульсами с энергией 1 и 2 нДж (плотность мощности излучения 2×10^11 и 4×10^11 Вт×см^-2 соответственно) наблюдается образование треков, состоящих из белков фосфо-АТМ и γН2AX, локализованных в местах прохождения луча лазера по клеточным ядрам. Наличие треков фосфо-АТМ, солокализованных с γН2AX, позволяет сделать заключение о том, что воздействие сфокусированным фемтосекундным инфракрасным лазерным излучением с энергией импульсов 1-2 нДж приводит к образованию ДР ДНК в облученных клетках. По всей видимости локальная концентрация оксидативных повреждений ДНК, индуцированных сфокусированным фемтосекундным лазерным излучением с энергией 1-2 нДж столь высока, что при этом образуется довольно большое количество ДР ДНК, что обычно характерно для ионизующего излучения. Можно полагать, что фемтосекундное лазерное излучение с определёнными характеристиками можно использовать для моделирования процессов повреждения ДНК ионизирующим излучением в живых клетках. Предполагается, что сфокусированное фемтосекундное инфракрасное лазерное излучение индуцирует образование плазмы низкой плотности в области поглощения фемтосекундного лазерного импульса. По-видимому, воздействие этой плазмы на биологический материал приводит к локальной ионизации атомов и молекул внутри облучаемого объёма и индуцирует множественные повреждения ДНК, в том числе и исследуемые нами ДР ДНК. Дополнительно были проведены эксперименты по оценке влияния субпикосекундного импульсного электронного излучения в дозе 2 Гр на систему кроветворения крыс. Результаты показали, что на 1-3 сутки после облучения у животных наблюдается лимфопения со сдвигом лейкоцитарной формулы влево, после чего к 14-28 суткам наблюдается частичное или полное восстановление исследуемых показателей. Изменения в картине крови сопровождались количественными и качественными изменениями в костном мозге, тимусе и селезенке облученных животных. Как известно, ионизирующее излучение приводит к изменению соотношения провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, скорость восстановления которого до исходного уровня зависят от времени и индивидуальной реакции организма на радиацию. Цитокиновый шторм наблюдается как ответ на все типы стрессов и воспалений, он запускает многие ростовые, гемопоэз-стимулирующие и воспалительные сигнальные каскады. В наших исследованиях повышение концентрации провоспалительного интерлекина-1β в плазме крови было зарегистрировано на 1-е сутки после облучения, тогда как снижение его концентрации наблюдалось после начала восстановления лимфоидной популяции (начиная с 7 суток). С 7-го дня после облучения также происходит снижение концентрации противовоспалительного интерлейкина -10, который подавляет экспрессию молекул эндотелиальной адгезии и предотвращает экстравазацию лейкоцитов, тем самым предотвращая лейкопению. Анализ повреждений ДНК с помощью метода ДНК-комет в клетках селезенки, тимуса и костного мозга облученных животных через 1, 3, 7, 14 и 28 суток показал, что максимальное количество повреждений в этих клетках наблюдалось на 3-е сутки после облучения, что, по всей видимости, обусловлено пострадиационной гибелью поврежденных клеток и сопутствующей деградацией хроматина, а также увеличением количества повреждений ДНК вследствие оксидативного стресса. Начиная с 7-14 суток наблюдается восстановление исследованных показателей до контрольных значений. Обращает на себя внимание феномен снижения количества повреждений ДНК в клетках тимуса и костного мозга ниже контрольных значений на 28-е сутки после облучения вследствие гибели поврежденных и стареющих клеток. В ходе исследования получена ценная информация о влиянии субпикосекундного импульсного излучения на систему кроветворения крыс, которую можно использовать в качестве базовой для дальнейших, более детальных экспериментов по изучению эффектов субпикосекундного импульсного излучения на тканевом и организменном уровне.