Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью проекта является создание молекулярных моделей фенотипов для выявления функциональных факторов, отличающих многофакторные патофенотипы с обратной коморбидностью, онкологические и психические заболевания. Основными задачами первого этапа выполнения проекта стали разработка методологической базы для предварительной подготовки образцов крови, проведение ВЭЖХ-МС/МС измерений молекулярных компонентов в образцах крови, а также биоинформатический сравнительный анализ результатов экспериментальных измерений, доступных в молекулярно-биологических базах данных или вновь полученных на первом этапе. В настоящем отчетном году были решены все поставленные задачи. Был выполнен аналитический обзор научно-методических реферируемых источников, целью которого стал анализ молекулярно-генетических исследований патогенеза онкологических и психических заболеваний. Анализ литературных данных позволил выявить группу генов, общих для исследуемых патологий с обратной коморбидностью, которые сопровождают развитие психических и онкологических заболеваний. Однако, механизм функционирования таких генов и их биологическая роль отлична для исследуемых заболеваний. Была дополнена аннотированная коллекция клинических образцов плазмы/сыворотки крови, полученных от больных 4 типами онкологических патологий, а также от пациентов, страдающих шизофренией и здоровых добровольцев. С целью создания базы белково-пептидных и метаболитных масс-спектрометрических профилей, а также перечней «top-Proteins», «top-Metabolites» и «top-Genes», специфичных исследуемым фенотипам были решены следующие задачи. (1) Разработаны алгоритмы сбора, экстракции и постаналитического этапа для белково-пептидных и метаболитных масс-спектрометрических данных. (2) Выполнен сбор и анализ доступных в интернет результатов экспериментальных измерений для молекулярных компонентов крови (генетические полиморфизмы, белки и метаболиты) с использованием баз данных EMBL-EBI PRIDE, NHGRI-EBI GWAS Catalog, HMDB, и др., а также библиотек Pubmed (www.pubmed.com) и Mendeley. Выполнен сравнительный информационный анализ молекулярных профилей образцов крови для исследуемых патологий, детализированы результаты сравнительных экспериментальных исследований, экстрагированных из молекулярно-биологических баз данных, для белков, метаболитов, и генетических полиморфизмов. Были сформированы перечни для белков, метаболитов, генов, ассоциированных с развитием онкологических патологий и психических заболеваний. Экспериментальная составляющая на текущем этапе включала выполнение предварительной подготовки клинических образцов плазмы крови для последующего проведения хромато-масс-спектрометрических измерений высокого разрешения. Был выполнен сравнительный панорамный анализ белкового и метаболитного состава в образцах крови для онкологических заболеваний (рак яичников, рак груди, рак почки, колоректальный рак), шизофрении и РАС. Предложены алгоритмы проведения ВЭЖХ-МС/МС измерений белков и метаболитов в образцах плазмы/сыворотки крови. В результате выполнения сравнительного панорамного ВЭЖХ-МС/МС анализа белкового состава в образцах крови для исследуемых патологий были аннотированы перечни белков «List A» – белки, идентифицированные в серии образцов «case» и не выявленные в контрольной серии образцов и «List B» – дифференциально экспрессируемые белки для серий сравнения. В результате выполнения сравнительного панорамного анализа метаболитного состава в образцах крови для исследуемых патологий были получены перечни метаболитов, в том числе «List A», содержащий компоненты, идентифицированные в серии образцов «case» и не выявленные в контрольной серии образцов, и «List B», включающий метаболиты с дифференциальным содержанием между двумя сериями сравнения. Был проведен полногеномный поиск ассоциаций для образцов крови на базе организации ООО «ГЕНОТЕК ИТ» на микрочипах высокой плотности с получением 652 297 однонуклеотидных генетических полиморфизмов на каждый образец. Проведена биоинформатическая и статистическая обработка результатов измерений для 248 фенотипов, в том числе 48 образцов крови, полученных от больных шизофренией, и 200 образцов крови условно-здоровых добровольцев (контрольная серия). Выявлены 214 полиморфизмов, для которых планируется на втором этапе проекта выполнить биоинформатический анализ и оценку статистической значимости. По итогам выполнения запланированных задач опубликованы 2 научные статьи (Q1 и Q2), одна статья принята в печать (Q3) и будет опубликована в конце декабря 2019 года, результаты были представлены для обсуждения конференциях в виде устных и постерных докладов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году выполнены следующие виды работ в соответствии с планом. Инициированы работы по созданию цифрового репозитория с веб-интерфейсом для коллекций клинических образцов, полученных от больных онкологическими и психическими заболеваниями. При научно-практическом центре ИБМХ создается веб-сервис «Цифровой биобанк», целью которого является обеспечение доступности по запросу пользователей аннотированных биологических образцов для исследовательских и коммерческих целей. Для развития сервиса биоколлекций был проведено исследование условий хранения и транспортировки образцов плазмы крови типа сухое пятно (DBS, dry blood spot) в краткосрочном периоде до 35 дней. Результаты представляют интерес для исследователей и фармацевтических компаний, использующих в своей научной деятельности ресурсы биобанков, для планирования продолжительности и температурного режима транспортировки биообразцов. Опубликована статья «Stability of Plasma Protein Composition in Dried Blood Spot during Storage» Malsagova K., et al. Processes 2020, 8(11), 1500. Продолжились работы по формированию коллекций образцов крови больных онкологическими патологиями и шизофренией, выполнена: паспортизация коллекции биообразцов и статистический анализ клинических данных образцов для формирования когорт сравнения. Проведен сравнительный ВЭЖХ-МС/МС анализ белковых и метаболитных компонентов в образцах крови больных онкологическими и психическими заболеваниями. На основе анализа экспериментальных результатов сформированы перечни молекулярных компонентов, ассоциированных с развитием патологии. По результатам протеомного анализа образцов крови больных колоректальным рабом опубликована статья «Revelation of Proteomic Indicators for Colorectal Cancer in Initial Stages of Development». Kopylov A, et. al. Molecules. 2020;25(3):619. Проведено важное по своей значимости исследование пост-трансляционных модификаций, обладающих высоким онкогенным потенциалом. Показано, что в патогенезе онкологических заболеваний значимую роль могут играть не только концентрационные эффекты, связанные со вторичным эффектом развития опухоли и её малигнизации, но и пост-трансляционные модификации, которые могут запускать развитие клеточного цикла по онкогенному сценарию. По результатам работы опубликована статья «Super Secondary Structures of Proteins with Post-Translational Modifications in Colon Cancer» Tikhonov D et al. Molecules. 2020;25(14):3144, которая была отмечена редакцией журнала, как одна из наиболее посещаемых и интересных тематических публикаций второго полугодия (июль-декабрь) 2020 года. Выполнена корректировка состава перечней молекулярных компонентов («top-genes», «top-proteins» и «top-metabolites»), ассоциированных с развитием патологий. Перечни были скорректированы в соответствии с экспериментальными результатами ВЭЖХ-МС/МС измерений и с учетом литературных данных. Экспериментальные протеомные данные позволили выявить обобщённый протеом для каждой группы сравнения. Экспериментальные данные для эндогенных метаболитов позволили выявить компоненты общие для всех групп сравнения, а также специфичные онкопатологиям и шизофрении. Протемно-метаболомный анализ образцов крови больных заболеваниями, характеризующихся обратной коморбидностью, позволил определить биологические процессы, которые ассоциированы с развитием психических и онкологических заболеваний, механизм регуляции которых противоположен. В образах крови, полученных от онкологических больных, выявлено повышения уровня содержания молекулярных факторов активации системы комплемента по классическому пути, тогда как в группе пациентов с шизофренией их уровень сравним с контрольной группой условно-здоровых участников. Было выявлено, что содержание аполипопротеинов, которые участвуют в обмене липидов и углеводов, в модуляции и структуризации архитектуры внеклеточного матрикса и клеточной мембраны, значимо отличается в образцах крови больных онкологическими заболеваниями и шизофренией. Наблюдается значительное снижение концентрации кластера аполипопротеинов у больных шизофренией. Напротив, в образцах крови больных онкологическими заболеваниями, выявлена положительная регуляция их содержания. Выявлены значимые отличия между содержанием эндогенных метаболитов у больных онкозаболеваниями и шизофренией. У онкобольных наблюдается повышение содержания в образцах крови низкомолекулярных компонентов, участвующих в биосинтезе жирных кислот и ацилов, метаболизме сфинголипидов и линоленовой кислоты. У больных шизофренией повышается уровень компонентов, участвующих в синтезе стероидных гормонов и понижается уровень метаболитов синтеза и метаболизма сфинголипидов и аминокислот. В отчетном этапе мы объединили в единую цепь биологических процессов идентифицированные белки и метаболиты из перечней онкопатологий и шизофрении. Разработан алгоритм (R-программирование) с использованием библиотек для статистического анализа многомерных омикс-данных для последующего создания единой коннективной карты для онкологических и психических заболеваний. Алгоритм определяет процедуры работы с результатами экспериментальных измерений, позволяющие: – стандартизовать в виде ранжированных перечней биологических процессов (KEGG) данные ВЭЖХ-МС/МС масс-спектрометрического анализа (протеомные и метаболомные), а также GWAS анализа (секвенирование на чипах); – выявить биологические процессы, обеспечивающие межслойные молекулярные взаимодействия. Результатом реализации алгоритма является планарный граф, отражающий кросс-слойные на молекулярном уровне (гены, белки и метаболиты) биологические процессы для каждой исследуемой патологии. Были созданы коннективные карты взаимодействия молекулярных компонентов фенотипа «онкология» и «шизофрения» на основе анализа полученных нами экспериментальных многомерных данных (полиморфизмы генов для шизофрении, белки и метаболиты). Выполнен литературный анализ математических моделей для описания молекулярного межслойного взаимодействия путем вертикальной интеграции знаний. Исследование биологических процессов требует системного подхода для интеграции результатов мульти-омиксного анализа, выявления взаимосвязи биомолекул и их роли в реализации процесса. Для интеграции и интерпретации многомерных омикс-данных созданы специализированные инструменты и сервисы. Омикс-данные включают результаты анализа генома, протеома, транскриптома, метаболома и эпигенома. Набор омикс-данных может быть расширен за счет других биологических данных, таких как липидом, фосфопротеом и гликопротеом. Многомерные омикс-данные, полученные для одного и того же набора образцов, предоставляют информацию о потоке биологической информации на нескольких молекулярных уровнях и, таким образом, могут помочь в изучении механизмов, лежащих в основе биологического состояния. Инструменты, которые позволяют интегрировать наборы омикс-данных, могут применяться для решения следующих медико-биологических задач: – выявление подтипов заболеваний и их классификация на основе мультиомных профилей; – прогнозирование биомаркеров заболеваний, в том числе для развития диагностических систем; – изучение молекулярных основ развития заболевания. Большая часть инструментов создана на языке программирования R и Python и использует байесовский и сетевой подход.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На заключительном этапе выполнения проекта были получены запланированные научные результаты в полном объеме. Разработан и организован на сервере ИБМХ биорепозиторий «Цифровой Биобанк», который содержит аннотации образцов плазмы и сыворотки крови, полученные от пациентов с онкологическими заболеваниями (рак предстательной железы, рак почки, рак яичников, колоректальный рак, рак молочной железы) и шизофренией. Для формирования контрольной группы в коллекцию были включены образцы, полученные от условно-здоровых участников исследования и спортсменов. За отчетный период было собрано свыше 1000 аннотированных образцов. Результаты протеомных и метаболомных измерений для исследуемых фенотипов (массив «омикс» данных составил 700 MGF файлов) были организованы в спектральные библиотеки эндогенных метаболитов и серологических белков. Спектральные библиотеки были количественно проанализированы. Было выявлено 134 белка, общих для всех исследуемых фенотипов и белки, характеризующие групповую патологическую специфичность. Аналогичный сравнительный анализ был проведен для эндогенных метаболитов, среди которых обнаружены 209 метаболитов, общих для всех фенотипов, и небольшие фракции метаболитов, обеспечивающие групповую патологическую специфичность. Выполнен анализ главных компонент (PCA, от англ. «Principal component analysis»), результаты которого показали недостаточный вклад количественной нагрузки в вариабельность между различными фенотипами. Выполнен анализ биологических процессов и молекулярных функций, связанных со значимыми межгрупповыми количественными изменениями молекулярных компонентов (белки и метаболиты) для исследуемых фенотипов (p<0,001, изменение содержания компонента с кратностью не менее двух). Уточнены перечни молекулярных факторов (белки и метаболиты), специфичные для исследуемых фенотипов «онкология» и «шизофрения». Белки, обеспечивающие групповую специфичность, являются участниками иммунного ответа, активации системы комплемента, метаболизма липидов и внутриклеточной передачи сигналов. Мы обнаружили, что факторы классического пути активации комплемента и некоторые ингибиторы активации альтернативного пути (CFI и CFH) наиболее распространены в фенотипе «онкология». Напротив, для фенотипа «шизофрения» содержание компонентов системы комплемента наиболее близко к таковому для группы «условно-здоровые участники». Кроме того, для фенотипа «онкология» мы выявили повышение содержания белка кластерина (CLU), который участвует в активации провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и IL-10) и клеточной дифференцировке раковых неоплазий. В фенотипе «шизофрения» уровень CLU соответствовал уровню условно-здорового фенотипа. Уровни белков семейства аполипопротеинов APOL, APOD, APOM, APOH, APOA2, APOC1 и APOA4 были умеренно или существенно повышены для фенотипа «онкология», и большей частью понижены для фенотипа «шизофрения». Основным эндогенным метаболитом, уровень которого повышен у пациентов с раком молочной железы и яичников, является предшественник биотина 7,8-диаминононаноат (KEGG C01037). В соответствие с центральной ролью биотина в синтезе и утилизации ацетил-КоА и синтезе жирных кислот в эксперименте наблюдается повышение содержания жирных кислот со средней длиной цепи в образцах фенотипа «онкология». В тоже время, содержание аминов жирных кислот, сфинголипидов и арахидоновой кислоты было подавлено. Большинство эндогенных метаболитов, значимо отличающихся между фенотипами, являются участниками стероидогенеза. Нарушения стероидогенеза обусловливают наличие петли иммунной стимуляции, сопровождающей образование АФК (активные формы кислорода) и воспалительную реакцию, связанную с активностью факторов системы комплемента и некоторых PPAR-зависимых аполипопротеинов (APOA1, APOA2, APOA4 и APOC1). Взаимосвязь между метаболизмом липидов, реактивацией иммунного ответа и сигнальными путями стимуляции иммунного ответа является важным результатом для сравнения патогенеза онкологических заболевании и шизофрении. В своем исследовании мы обращаем внимание на то, что стандартные поисковые системы позволяют идентифицировать лишь 30% тандемных спектров и соотнести их с белками и метаболитами. Мы предположили, что такая часть данных может содержать важную информацию для классификации исследуемых фенотипов. Предложена одномерная модель 1D-CNN для классификации шести исследуемых фенотипов с использованием «омикс» данных о протеомном и метаболомном составе образцов плазмы крови, полученных от 350 участников. Модель классификации продемонстрировала устойчивость к шуму и достигла высокой точности (0,89 и 0,93) и чувствительности (0,88 и 0,93) для протеомных и метаболомных данных, соответственно. Обученная нейронная сеть позволяет классифицировать фенотипы «шизофрения» и «онкология» с точностью 0,88 по протеомным спектральным данным, и с точностью 0,85 по метаболомным спектральным данным. Предложенная модель также позволяет эффективно классифицировать близкие по этиологии и патогенезу нозологии внутри фенотипа «онкология». Результаты исследования опубликованы в отчетной статье: Kopylov A.T., et al. Convolutional neural network in proteomics and metabolomics for determination of comorbidity between cancer and schizophrenia. J. Biomed. Inform. 2021. Doi: 10.1016/j.jbi.2021.103890. Следует отметить, что гендерно-специфические фенотипы, такие как рак яичников и рак молочной железы, наиболее близки по протеомным и метаболомным данным. В тоже время, фенотип рака простаты является наиболее удаленным по отношению к женским типам онкологий. Мы обнаружили, что расстояние между фенотипом "шизофрения" и контрольной группой является одним из самых больших по протеомным данным. Это наблюдение открывает перспективу дальнейших исследований серологических маркеров шизофрении. На заключительном этапе были обобщены экспериментальные результаты о молекулярном патогенезе шизофрении, включая количественные данные для протеома и метаболома, общегеномного исследования ассоциаций полиморфизмов (GWAS). Были выявлены и валидированы на независимой когорте пациентов 20 дифференциально-экспрессируемых белков, вероятно, вносящих вклад в патогенез шизофрении (ALS, A1AG1, PEDF, VTDB, CERU, APOB, APOH, FASN, GPX3 и др.). Метаболомное исследование позволило выявить 18 эндогенных соединений, большинство из которых являются компонентами метаболизма тирозина и стероидов (андростерон сульфат, тиролиберин, тироксин, дигидротестостерон, андростендион, сульфат холестерина, метанефрин, допахинон), также ассоциированных с шизофренией. Анализ GWAS выявил 52 локуса генетических полиморфизмов, которые могут быть успешно интегрированы с релевантными шизофрении биологическими путями, определенными на уровне протеома и/или метаболома. Кандидатные белки, метаболиты и наиболее вероятные генетические полиморфизмы, полученные в нашем исследовании, охватывают 68 биологических процессов, которые могут быть связаны с этиологией и прогрессированием шизофрении. Два биологических пути - взаимодействие нейроактивного лиганда с рецептором (hsa04080) и метаболизм витаминов и абсорбция (hsa04977), характеризуются пересечением всех трех слоев (протеомного, метаболомного, геномного). Некоторые межслойные ассоциации чрезвычайно важны для гипотезы возникновения и прогрессирования шизофрении, в том числе повышение содержания серотонина и дофамина и связанные полиморфизмы генов (GRM8, PTGS1, GABBR2), охватывающие глутаматергические, серотонинергические, ГАМКергические и дофаминергические синапсы передачи сигнала. Следует отметить, что локусы PTGS1 характеризовались двумя типами однонуклеотдных полиморфизмов (SNP) - rs8046 и rs10306166, а соответствующие белки являются участниками передачи серотонинергических синапсов (hsa04726).