Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Исследования в рамках проекта в 2019 году проводились по 4-м основным направлениям – структурные работы для небольших пептидных фрагментов, определяющих взаимодействие лиганд-рецептор в отношении никотиновой холинергической системы, построение новых компьютерных моделей в рамках той же системы, продолжение работ по поиску новых соединений открытого нами нового семейства лигандов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) – олигоаргининов – и выяснению механизма их действия и участка связывания, а также продолжение работ по разработке противовоспалительных агентов на основе гипафорина. 1. ЯМР исследования пространственной структуры пептидных фрагментов, определяющих взаимодействие лиганд-холинорецептор. Были проведены структурные исследования методом 1Н-ЯМР для двух пептидных фрагментов, один из которых представлял собой фрагмент центральной петли эндогенного белка семейства Ly6 - Lynx1, для которого показана модулирующая роль в функционировании холинергической системы, и фрагмент лиганд-связывающего участка его «контрагента», в качестве которого был выбран ацетилхолин-связывющий белок (АХСБ) из Lymnaea stagnalis, являющийся универсальной структурной моделью всех нАХР. Для последнего получено большое количество рентгеноструктурных данных о структуре его комплекса с холинергическими лигандами разной природы, среди которых пока нет, однако, ни одного представителя семейства Ly6. Оба этих фрагмента были сконструированы с фланкированными остатками цистеина, чтобы получить их в виде двух форм – циклизованной (с замкнутой дисульфидной связью) и линейной. Исследование их биологической активности на разных подтипах нАХР показало, что далеко не во всех случаях циклизованная (и предположительно более структурированная) форма проявляет большее сродство рецептору. По этой причине на данном этапе были проведены полномасштабные структурные ЯМР-исследования обеих форм этих двух фрагментов, таким образом всего 4 объекта – пептид СTTRTYYTPTRMKVSKC (циклический и линейный) и пептид CSVTYSSSPEAYEDC (циклический и линейный). Для всех 4-х объектов были измерены гидродинамические радиусы, проведено отнесение сигналов, оценены индекс неупорядоченности, вероятность вторичной структуры, внутримолекулярная подвижность и стабильность участка молекулы и в результате предложена пространственная структура для наиболее структурированного пептида. ЯМР исследования показали, что оба циклизованных фрагмента по параметрам гидродинамического радиуса характеризуются компактной структурой подобной глобулярным белкам, а их линейные формы больше соответствуют неупорядоченным белкам. Благодаря полному отнесению сигналов 1Н,13С, 15N в спектрах ЯМР удалось показать для обоих циклизованных фрагментов наличие двух состояний, возникающих за счет цис-транс изомерии пептидной связи пептидной связи между 8-м и -9-м аминокислотными остатками (а.о.). При этом основное состояние соответствует транс изомеру. Для линейных пептидов минорное состояние не обнаружено. Оценка структурированности пептидов по индексу неупорядоченности показала, что циклизованный фрагмент Lynx1 обладает частичной структурированностью в центальной части молекулы, в отличие от линейной формы. Интересно, что обе формы фрагмента АХСБ (даже циклизованная) оказались полностью неупорядоченными. Вероятность образования для циклизованного фрагмента Lynx1 элементов вторичной структуры, оцененная по параметру SSP (secondary structure propensity), показала высокую вероятность образования β-структуры и ее стабильность, причем структура фрагмента частично соответствует его структуре в полноразмерном белке Lynx1. Это резко отличало данный пептид от циклизованного фрагмента АХСБ, для которого не было выявлено образования какой-либо вторичной структуры, в отличие от полностью структурированного этого же участка в составе полноразмерного АХСБ. Оценка внутримолекулярной подвижности и стабильности участков молекулы подтвердила очевидное предположение о большей подвижности линейных форм и о стабилизации молекул при замыкании дисульфидной связи, однако образования стабильных водородных связей при этом обнаружено не было. По результатам приведенных выше исследований наиболее структурированным оказался циклизованный фрагмент белка Lynx1, который и был проанализирован классическим методом по спектрам1Н/1Н ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) с привлечением программы TALOS-N. Согласно предсказанию TALOS-N, во фрагменте присутствует два коротких β-тяжа на участках Y6-Y7 и М14-S15, а также изгиб в районе P9. Эти данные были подтверждены в спектре NOESY. С использованием нескольких контактов ЯЭО и ограничений на углы TALOS-N была получена пространственная структура циклического фрагмента центральной петли Lynx1 в программе CYANA 3.98, которая представляет собой подобие подвижной β-шпильки с изгибом на участке T8-M12. По результатам проведенным ЯМР-исследований было показано, что обе формы фрагмента АХСБ, а также линейная форма фрагмента Lynx1 неупорядочены и не принимают конформации, соответствующей структуре гомологичных участков в полноразмерных белках. Единственным условно упорядоченным пептидом оказался циклизованный фрагмент Lynx1, с высокой вероятностью образования β-шпильки с изгибом на участке T8-M12. Пептид имеет компактную структуру, но при этом стабильные водородные связи не образуются. По-видимому, его поведение соответствует случаю "расплавленной глобулы". При этом, часть времени структура данного пептида соответствует конформации центральной петли Lynx1. 2. Компьютерное моделирование взаимодействия пептидных соединений с нАХР В соответствии с заявленными планами было проведено моделирование взаимодействия центральных петель Ly6 белков с некоторыми подтипами нАХР. В качестве первого шага были созданы модели структур самих петель для последующей проверки возможности их взаимодействия с мишенями. В частности, был осуществлен дизайн циклопептида на основе белка SLURP-1, структура которого в моделях представляла собой пептидную “β-шпильку”. Данные молекулярной динамики подтвердили теоретическую возможность сохранения структуры “шпильки”, близкой к структуре нативного фрагмента полноразмерного белка SLURP-1. С полученными моделями пептидных фрагментов было проведено компьютерное моделирование возможности взаимодействия с некоторыми подтипами нАХР. В частности, были получены предположительные конформации комплекса циклического фрагмента белка SLURP-1 с α7 подтипом рецептора. Для оптимизаций условий расчета при молекулярном моделировании нами были проведены дополнительные исследования модельных структр нАХР с некоторыми α-конотоксинами, также представляющие собой небольшие пептиды с фиксированной двумя дисульфидами жесткой структурой. На данном этапе проекта для этой цели были выбраны различные мутантные варианты α-конотоксина LvIA, для которых ранее были получены экспериментальные данные по электрофизиологическому тестированию на α3β2 и α3β4 нАХР (диких типов и мутантных форм с одиночными точечными мутациями S104T или S168I). Были проведены молекулярно-динамические расчеты стуктур комплексов различных вариантов LvIA с мутантными вариантами нАХР и “базовым” рецептором дикого типа. В результате этих исследований предложены молекулярные детерминанты взаимодействия α-конотоксина LvIA с α3β2 нАХР. 3. Исследование взаимодействия олигоаргининовых пептидов с различными подтипами нАХР В 2019 году были продолжены работы с серией олигоаргининовых пептидов. При уточнении параметров связывания (за счет большего числа повторов) синтезированных на предыдущем этапе проекта ряда олигоаргининовых пептидов - R3, R6, R8, R16 – были получены новые значения IC50 для R16 и R8 по отношению к мышечному рецептору мыши и α9α10 нАХР человека, соответствено. Они отличались в два раза от ранее заявленных в сторону большего сродства ( IC50 = 157 и 44 нМ, соответственно). При выяснении механизма действия и участка связывания наиболее активного и селективного олигопептида R8 в отношении α9α10 нАХР человека были проведены дополнительные электрофизиологические эксперименты на ооцитах, экспрессирующих этот рецептор, методом двухэлектродной фиксации потенциала. Были получены графики зависимости трансмембранного тока, вызванного аппликацией ацетилхолина в присутствии и отсутствии 50 нМ пептида R8, а также было исследовано влияние мембранного потенциала на активность R8. Оказалось, что в первом случае пептид существенно снижал максимальную амплитуду тока до 20%, но при этом не влиял на расчетное значение ЕС50, что характерно для неконкурентных ингибиторов. Второе исследование показало, что степень ингибирования α9α10 нАХР человека сильно зависит от мембранного потенциала: при отрицательном поддерживающем потенциале (-120 и -60 mV) влияние R8 на амплитуда ионного тока максимально, а при положительном потенциале (+40 mV и +60 mV) влияние или минимально или отсутствует. Эти результаты можно трактовать как свидетельствово о связывании R8 вблизи ионной поры или непосредственно в ней. Таким образом, на основании проведенных экспериментов, можно предположить смешанный (конкурентно/неконкурентный) способ ингибирования олигоаринином R8 α9α10 нАХР человека и предположить существование вспомогательного сайта связывания (вблизи ионной поры) в дополнение к ортостерическому сайту, выявленному в конкурентном анализе. В качестве новых положительно заряженных пептидов на данном этапе проекта в сотрудничестве с коллегами из Института химии и молекулярной инженерии (Тбилиси, Грузия) мы исследовали серию катионных полимеров (2ApdC, 8R3 и tES-ED-R(Me)), в том числе и содержащих остатки аргининов. Все три соединения были исследованы методами радиолигандного анализа, кальциевого имиджинга и электрофизиологии и показали способность эффективно взаимодействовать как с мышечным, так и нейрональным α7 нАХР со значениями IC50 в диапазоне 1.8 - 7.7 мг/л. Полученные нами данные говорят о том, что катионные полимеры, рассматриваемые как средства доставки различных лекарственных препаратов, могут проявлять свои собственные фармакологические эффекты через прямое действие на ряд ионных каналов. 4. Синтез и анализ биологической активности новых аналогов 6-бромгипафорина В 2019 году были продолжены работы также с серией низкомолекулярных соединений, в частности, с аналогами гипафорина. На данном этапе проекта мы решили проверить наше предположение (основанное на ранее проведенном компьютерном моделировании) о возможном улучшении аффинности производных гипафорина к α7 нАХР при замене брома в шестом положении на трифторметильную группу. В результате мы разработали схему синтеза искомой молекулы в виде метилового эфира D-6-трифторметил-гипафорина (CF3-Hyp-OCH3) и синтезировали этот продукт в количестве 1.5 г. В опытах по кальциевому имиджингу он показал себя достаточно эффективным агонистом по отношению к α7 подтипу нАХР на клетках линии SH-SY5Y со сродством ЕС50 = 5.0 ± 0.8 мкМ. Достаточно высокая аффинность нового аналога гипафорина как агониста α7 подтипа нАХР дает хорошие перспективы его использования в качестве противовоспалительного агента, поскольку целый ряд воспалительных процессов, согласно литературным данным, опосредуются через этот подтип рецептора. Поэтому на данном этапе проекта были начаты работы по разработке протоколов для применения этого соединения в противовоспалительных тестах на мышах.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В основе проекта лежат исследования взаимодействия пептидов и белков из различных животных ядов с рецепторами нервной и иммунной систем. Источниками пептидов и белков являются яды животных (змей, скорпионов, лягушек, ядовитых морских моллюсков Conus), тогда как рецепторы принадлежат к семейству лиганд-управляемых Cys-петельных ионных каналов: среди последних наши основные усилия были сфокусированы на различных типах никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР), но в ряде работ мы изучали также взаимодействие пептидов и белков с другими представителями семейства Cys-петельных рецепторов, а именно с рецепторами γ-аминомасляной кислоты (GABA-A, ионогенные рецепторы,) с 5HT-3-серотониновыми и глициновыми рецепторами. Характерной особенностью используемых нами пептидов и белков из ядов является наличие в них дисульфидных связей (от 1 до 5). Это значительно стабилизирует их структуру и позволяет во многих случаях сохранять их биологическую активность как при направленном мутагенезе с целью выхода на соединения с более высокой активностью, так и для введения необходимых меток (радиоактивных, флуоресцентных), позволяющих маркировать соответствующие рецепторы-мишени и при необходимости определять их содержание в тканях в норме и при различных патологиях. Наличие в пептидах и белках таких дисульфидов и лежало в основе тематики предложенного проекта. Дело в то, что природные токсины являются не только избирательными инструментами исследования рецепторов, в частности для получения детальной информации о центрах связывания рецепторов, необходимой для понимания механизмов их действия и последующего создания новых лекарств, но токсины в редких случаях сами могут выполнять роль лекарств, а их определенные структурные элементы могут быть использованы в конструировании лекарств. Так, у нас накоплен большой опыт работы с так называемыми трех-петельными α-нейротоксинами из яда змей: их пространственная структура включает три β-структурные петли, а конформация стабилизирована 4 или 5 дисульфидными связями. В литературе имеются данные о том, что синтетическая центральная петля токсинов, стабилизированная дисудьфидной связью благодаря введенным по N- и C-концам остаткам цистеина и последующему замыканию дисульфида между ними, обладала заметной активностью исходного полноразмерного нейротоксина, что могла послужить основой для разработки лекарственных средств. Мы решили воспользоваться эти подходом, но не для токсинов, а для другого класса белков - а именно для Ly6 белков. Эти белки встречаются в самых разных организмах – от насекомых до человека – и их особенностью является наличие того же типа пространственной структуры, что и в α-нейротоксинах змей, а именно трех-петельной структуры, фиксированной 5 или большим числом дисульфидных связей. Для некоторых Ly6 белков была установлена локализация вблизи нАХР, влияние на сборку нАХР из различных субъединиц, а также на эффективность взаимодействия рецепторов с различными агонистами и антагонистами. Пионерские исследования таких Ly6 белков как Lynx1 (связанный с мембранами) и SLURP 1 (секретируемый) были выполнены в ИБХ РАН (в том числе и с нашим участием) - в частности, водорастворимый Lynx1 и SLURP 1 были получены гетерологической экспрессией в E.coli, а их пространственная структура впервые была установлена методом 1Н-ЯМР. В связи с этим одной из задач проекта было применение того подхода, который был успешен в случае трех-петельных нейротоксинов из яда змей: а именно синтезировать центральные петли этих белков, фиксировать их структуру дисульфидом между остатками Cys, введенными по C- и N-концам, и проверить, обладают ли такие петли активностью исходных полноразмерных белков. Соответствующий пептид SLURP 1 в отношении большинства подтипов нАХР был практически неактивен. Интересный результат был получен для фиксированного дисульфидной связью фрагмента белка SSS. Этот мембранно-связанный белок имеется в дрозофиле и его взаимодействие с нейрональными нАХР, а также с определенными К-каналами регулирует сон дрозофилы. В исследованной нами серии этот белок был наиболее активен в отношении как мышечного, так и нейрональных рецепторов. Такая активность служит поддержкой использованного нами подхода, поскольку это согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что активностью обладает не только гетерологически экспрессированный белок, но и его центральная петля. Для нас наибольший интерес представляла активность фрагментов wsLynx1: в отношении нейрональных нАХР они были значительно менее активны, чем цельный wsLynx1, но ситуация с мышечным нАХР была совершенно иная: линейный пептид без добавленных Cys имел невысокую активность, тогда как пептид с введенной дисульфидной связью на рецепторе Torpedo californica, был даже более активен, чем цельный wsLynx1. 1Н ЯМР показал, что фиксированный дисульфидной связью пептид имеет достаточно стабильную пространственную структуру, которая в значительной степени сходна со структурой центральной петли в цельном wsLynx1. С одной стороны, это подтверждает роль пространственной структуры во взаимодействии с рецептором. Однако, петля с введенными свободными цистеинами имела не меньшую активность, что указывает на возможность дополнительных контактов с группировками рецептора. Во всяком случае, полученные нами впервые синтетические фрагменты Ly6 белков, анализ их пространственной структуры и исследование взаимодействия с различными нАХР свидетельствуют о перспективности выбранного направления. Как уже отмечалось, другое направление проекта было сфокусировано на α-конотоксинах. Эти пептиды с двумя дисульфидными связями являются наиболее избирательными инструментами, позволяющими различать индивидуальные подтипы нАХР. В настоящее время имеется большое число кристаллических структур конотоксинов с ацетилхолин-связывающими белками (АХБ). Эти белки являются прекрасными моделями лиганд-связывающих доменов не только всех типов нАХР, но и всех Cys-петельных рецепторов. Первая структура α-конотоксина в комплексе с АХБ Aplysia californica была установлена с нашим участием 15 лет назад, сейчас имеется большое число структур различных α-конотоксинов с АХБ, которые могут объяснить почему данный α-конотоксин имеет высокое сродство к данному АХБ, но получить нормальное объяснение, используя кристаллическую структуру данного комплекса с АХБ и компьютерное моделирование, высокой специфичности этого конотоксина к конкретному подтипу рецептора как правило не удавалось. Пространственные структуры конотоксинов в комплексе с цельными рецепторами пока отсутствуют (в отличие от опубликованной в этом году американскими исследователями криоэлектронно-микроскопической структуры α-бунгаротоксина, связанного с нАХР Torpedo) и промежуточным шагом мог бы быть рентгеноструктурный анализ комплексов α-конотоксинов с лиганд-связывающими доменами индивидуальных субъединиц. Такая работа была выполнена нами ранее совместно с греческими кристаллографами для комплекса α-конотоксина RgIA c лиганд-связывающим доменом α9 субъединицы нАХР. Однако такой гетерологически экспрессированный домен существует в виде мономера, в отличие от цельных пентамерных рецепторов, что затрудняет интерпретацию полученных результатов. Значительный шаг вперед нам удалось сделать в рамках выполнения данного проекта. В совместной работе с китайскими учеными было проведено исследование α-конотоксина LvIA. Этот токсин ингибирует два подтипа нАХР, а именно α3β2 и α3β4, имея к первому из них сродство в 17 раз более высокое. Было проведено комплексное исследование, где в результате аланинового сканирования данного токсина была синтезирована серия аналогов и после их тестирования против этих рецепторов были идентифицированы два наиболее активных соединения, при этом одно из них имело в 2000 раз более высокую специфичность в отношении α3β2 рецептора. Следующим шагом был рентгеноструктурный анализ комплексов этих соединений с АХБ и гипотезы о контактах этих соединений с теми остатками в АХБ и, соответственно, в рецепторах, взаимодействие с которыми и отвечает за полученную высокую специфичность. Выбор вероятно важных остатков осуществлялся с помощью компьютерного моделирования комплексов конотоксинов с рецепторами, исходя из установленных кристаллических структур. При этом с помощью мутаций субъединицы β2 удалось экспериментально подтвердить роль именно этих остатков в высокоселективном взаимодействии с α-конотоксином LvIA. Поскольку нАХР участвуют в самых разнообразных процессах – от мышечного сокращения и регуляции деятельности иммунной системы до формирования сознания, мы не могли ограничиться только ролью дисульфидных связей в рассмотренных выше лигандах. Среди мишеней последних мы главным образом испытывали два основных типа нАХР - рецептора мышечного типа и нейрональный α7 нАХР, который достаточно хорошо представлен как в мозге, так и на клетках иммунной системы. Для поиска потенциальных лекарственных средств для нас важно было получение информации о новых лигандах таких рецепторов, а также детализация механизмов активности таких рецепторов. Поскольку среди новых эндогенных каннабиноидов были обнаружены холины, ацилированные остатками ненасыщенных жирных кислот, мы решили проверить, способны ли эти соединения служить лигандами нАХР (тем более, что сам холин является агонистом α7 нАХР). Было установлено, что эти соединения в микромольном диапазоне конкурируют с радиоактивным α-бунгаротоксином за связывание с рецептором мышечного типа (нАХР Torpedo), с α7 нАХР в клетках GH4C1, а также с АХБ. О том, что эти соединения являются ингибиторами можно судить по тому, что в соответствующих клеточных линиях, экспрессирующих нейрональные нАХР, они ингибировали Са токи, индуцированные активацией соответствующих рецепторов. Выяснение механизмов действия нАХР было сфокусировано на роли α7 нАХР в иммунной системе. Достаточно давно было известно, что их активация влияет на регуляцию воспалительных процессов, в частности благодаря снижению экспрессии TNF. Мы решили более детально исследовать этот процесс, воспользовавшись для активации рецептора этого подтипа селективным его агонистом, а именно соединением PNU 282,987. Поскольку в последнее время появляются работы, в которых α7 нАХР функционирует по метаботропному механизму, с помощью электрофизиологии мы показали, что на макрофагах ответ на активацию α7 нАХР приводит к ионному току. В дополнение к известной ранее активации α7 нАХР, приводящей к изменению экспрессии ряда цитокинов, нами впервые было показано изменение экспрессии ряда мембранных белков: увеличение экспрессии HLA-DR, CD54, и CD11b молекул, но уменьшение экспрессии CD14 рецептора. Эти результаты имеют важное значение для предотвращения иммуносупрессии.