КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 16-14-10364
НазваниеФлуоресцентные метки для сверхразрешающей микроскопии
РуководительМишин Александр Сергеевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2019 г. - 2020 г. |
Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология
Ключевые словаФлуоресцентные белки; мечение белков; флуоресцентная микроскопия сверх-высокого разрешения; детекция флуоресценции одиночных молекул; фотоконверсия; фотостабильность; флуорогенные красители;
Код ГРНТИ34.17.09
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Несовершенство систем флуоресцентного мечения является главным лимитирующим фактором в применении методов сверхразрешающей флуоресцентной микроскопии для прижизненного изучения белок-белковых взаимодействий и применения генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов. Из-за ограничений, прежде всего, в плотности мечения, а также неадаптированности большинства генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов к наноскопии, проведение функциональных исследований со сверхразрешением крайне затруднено.
Ранее, в ходе выполнения проекта 2016 года, были созданы принципиально новые системы мечения, специально адаптированные для прижизненной наноскопии, и основанные на обратимом взаимодействии флуорогенов и специфически связывающих их белков, а также на транзиентом взаимодействии K/E-спиралей. В ходе выполнения Проекта будут применены три основных подхода, развивающие созданные системы мечения и использующие их преимущества для функциональной наноскопии: (1) Создание модулируемых акцепторов FRET на основе обратимого взаимодействия липокалина и хромофоров, свободно проникающих через клеточную мембрану, для применения в условиях микроскопии сверхвысокого разрешения; (2) Улучшение динамического диапазона уже существующих генетически кодируемых индикаторов, основанных на FRET, за счет применения транзиентно взаимодействующих K/E- спиралей; (3) Создание системы изучения белок-белковых взаимодействий, основанных на бимолекулярной флуоресцентной комплементации липокалина, а также взаимодействии К/E спиралей. В результате выполнения проекта впервые будут созданы подходы для адаптации генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов и систем изучения белок-белковых взаимодействий к условиям прижизненной флуоресцентной наноскопии.
Ожидаемые результаты
В результате выполнения Проекта будут созданы модулируемые акцепторы FRET на основе обратимого взаимодействия липокалина и хромофоров, свободно проникающих через клеточную мембрану, улучшен динамический диапазон ряда уже существующих генетически кодируемых индикаторов, за счет применения транзиентно взаимодействующих K/E-спиралей, а также созданы системы изучения белок-белковых взаимодействий, основанные на бимолекулярной флуоресцентной комплементации липокалина. В результате выполнения проекта впервые будут созданы подходы для адаптации многих генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов (основанных на FRET) и систем изучения белок-белковых взаимодействий к условиям прижизненной флуоресцентной наноскопии. Создание модулируемых акцепторов FRET, систем бимолекулярной флуоресцентной комплементации на основе липокалинов, обратимо связывающих флуорогены, позволит преодолеть ограничения, препятствующие проведению функциональных исследований со сверхвысоким разрешением.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Созданы FRET пары с модулируемым акцептором на основе липокалина DiB1 и связывающихся с ним хромофоров. Выявлена пара c высокой эффективностью FRET (60%). Данная пара была протестирована в культуре клеток млекопитающих и продемонстрировала возможность детекции FRET на уровне одиночных молекул.
Также была создана система бимолекулярной комплементации на основе мутантов липокалина. Сплит-системы были протестированы с хромофором M739. Выявлена эффективная сплит-система на основе сплит-варианта липокалина DiB. Данная сплит-система была протестирована в культуре живых клеток, в том числе, в режиме микроскопии сверхвысокого разрешения.
Созданы модификации сенсоров на активность каспазы-3 и на активность малой ГТФазы, содержащие K-спираль на N-конце и С-спираль на C-конце. С использованием полученных сенсоров показано увеличение диапазона изменения FRET-сигнала при использовании K/E-спиралей по сравнению с исходными сенсорами. Такое увеличение динамического диапазона FRET позволит с большей чувствительностью детектировать внутриклеточные процессы.
Для изучения взаимодействий между белками были созданы генно-инженерные конструкции, кодирующие пары целевых белков с известной способностью к взаимодействию. При этом оба белка содержат K- или E-спираль, а один из пары был дополнительно помечен флуоресцентным белком. Также были созданы генно-инженерные конструкции, кодирующие генетические кодируемые хромобелки а также липокалин DiB1, также содержащие K/E-спирали. В результате проверки полученных конструкций в условиях моно- и котрансфекции видимых изменений в локализации целевых белков, связанных с добавлением K/E-спиралей, не выявлено.
Публикации
1. Гавриков А.С., Баранов М.С., Мишин А.С. Live-cell nanoscopy with spontaneous blinking of conventional green fluorescent proteins Biochemical and Biophysical Research Communications, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.11.163
2. Зайцева Э.Р., Смирнов А.Ю., Мишин А.С., Баранов М.С. Cинтез и оптические свойства нового ацетиленового аналога хромофора белка Kaede Биоорганическая химия, - (год публикации - 2019)
3. Перфилов М.М., Гурская Н.Г., Серебровская Е.О., Мельников П.А., Харитонов С.Л., Льюис Т.Р., Аршавский В.Ю., Баклаушев В.П., Мишин А.С., Лукьянов К.А Highly photostable fluorescent labeling of proteins in live cells using exchangeable coiled coils heterodimerization Cellular and Molecular Life Sciences, - (год публикации - 2019)
4. Гавриков А.С., Лукьянов К.А., Мишин А.С. Переключаемые акцепторы индуктивно-резонансного переноса энергии на основе двухкомпонентной системы липокалин-флуороген XXXI Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", сборник тезисов, с.9 (год публикации - 2019)
5. Гарвиков А.С., Перфилов М.М., Балеева Н.С., Баранов М.С., Мишин А.С. Live-cell smFRET with transient protein-labeling tags S3IC Book of abstacts, p.102 (год публикации - 2019)
6. Перфилов М.М., Гурская Н.Г., Баклаушев В.П., Мельников П.А., Лукьянов К.А., Мишин А.С. Фотостабильное флуоресцентное мечение белков в живых клетках, опосредованное coiled coil гетеродимеризацией XXXI Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", сборник тезисов, с. 25 (год публикации - 2019)
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
C использованием химически модулируемого акцептора FRET на основе липокалина DiB1 cоздан генетически кодируемый сенсор посттрансляционной модификации гистона H3. Была показана работоспособность сенсора в условиях флуоресцентной микроскопии и наноскопии.
Cоздан генетически кодируемый механочувстительный сенсор на основе винкулина. В составе сенсора использованы донор (mNeonGreen) и акцептора FRET (модулируемый, DiB1), адаптированные для сверхразрешающей локализационной микроскопии. Показана работоспособность сенсора
На основе сплит-версии липокалина DiB2 разработана система оценки взаимодействия целевых белков, совместимая с флуоресцентной наноскопией.
Разработаны и тестированы в условиях наноскопии улучшенные варианты липокалина DiB3/F53L и DiB3/F74V, образующего с хромофором M739 более яркие комплексы, по сравнению с опубликованными ранее. На основе анализа кристаллической структуры комплекса DiB1:M739 выбраны и тестированы в клетках млекопитающих нефлуоресцентные лиганды DiB1, среди которых отобраны перспективные для использования в качестве модулируемых акцепторов FRET
Создан ряд модельных генетически кодируемых FRET-сенсоров активности киназ, амплитуда ответа которых увеличена за счет внутримолекулярного взаимодействия K/E-спиралей.
Разработана система оценки взаимодействия между парой целевых белков с использованием FRET и конкурентного взаимодействия с K/E-спиралями.
Публикации
1. Божанова Н.Г., Гавриков А.С., Мишин А.С., Мейлер Й. DiB-splits: nature-guided design of a novel fluorescent labeling split system Scientific Reports, Volume 10, Issue 1, Article number 11049 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41598-020-67095-2
2. Муслинкина Л., Гавриков А.C., Божанова Н.Г., Мишин А.C., Баранов М.С., Мейлер Й., Плетнева Н.В., Плетнев В.З., Плетнев С. Structure-Based Rational Design of Two Enhanced Bacterial Lipocalin Blc Tags for Protein-PAINT Super-resolution Microscopy ACS Chemical Biology, 15, 9, 2456–2465 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00440
3. Смирнов А.Ю., Перфилов М.М., Зайцева Э.Р., Загудайлова М.Б., Зайцева С.О., Мишин А.C., Баранов М.С. Design of red-shifted and environment-sensitive fluorogens based on GFP chromophore core Dyes and Pigments, Volume 177, 108258 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.dyepig.2020.108258
4. Мишин А.C., Перфилов М.М., Гавриков А.С. Small low-affinity protein-labeling tags for live-cell nanoscopy Single-Molecule Sensors and NanoSystems International Conference 2020 - Book of abstracts, - (год публикации - 2020)
Возможность практического использования результатов
не указано