Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Эффективность химиотерапии, не смотря на развитие новых химиотерапевтических агентов при раке толстой кишки (РТК), достигает не более 50%. Хеморезистентность опухолевых клеток только частично объясняет уровень эффективности химиотерапии. В настоящее время в международном научном сообществе существуют данные о том, что макрофаги опухолевого микроокружения могут как сотрудничать с химиотерапевтическими агентами, так и снижать эффективность их действия (Larionova I., et al., Oncoimmunology, 2019). В настоящее время опухолеассоциированные (ОАМ) рассматриваются как очень перспективная мишень для химиотерапии (Kzhyshkowska J., et al., Springer Nature, 2020). Актуальной является задача выяснить, какие субпопуляции ОАМ существуют при РТК, как они взаимодействуют с химиотерапией и влияют на течение и исход заболевания. Наиболее общепринятой является точка зрения, что опухолеассоциированные макрофаги поддерживают опухолевый рост и способствую эффективному метастазированию (Kzhyshkowska J., et al., J Immonology, 2019). В случае рака кишечника существуют противоречивые данные о способности ОАМ как поддерживать развитие опухоли, так и оказывать противоопухолевое действие. Чрезвычайно важным фактором, определяющим поведение ОАМ в опухолевом очаге, является состояние моноцитов крови, которые инфильтрируют в опухоль и являются главным пластическим ресурсом ОАМ (Patysheva M., et al., 2019). Однако, влияние программирования моноцитов на формирование ОАМ с про- и противоопухолевыми свойствами практически не изучено. В течение первого года проекта нами была сформирована уникальная коллекция образцов моноцитов периферической крови и опухолевой ткани пациентов с раком толстой кишки (РТК) для сравнительного анализа моноцитов и опухолеассоциированных макрофагов (ОАМ) для каждого отдельного пациента. Принципиальным моментом нашего проекта является то, что в ходе реализации из группы больных раком толстой кишки были сформированы 2 группы пациентов с опухолью прямой и ободочной кишки, что позволило впервые выявить различия в транскриптомном профиле моноцитов при разной локализации РТК. Нами была сформирована проспективная база данных пациентов с раком прямой и ободочной кишки. В течение всего проекта (до 2021) создается биобанк образцов, в котором образцы моноцитов пациентов получены А) для рака прямой кишки: 1)до лечения; 2)после завершения НАХТ (перед операцией); 3)на 7-10 сутки после операции; 4)через 3 месяца после операции; Б) для рака ободочной кишки: 1) 1)до лечения; 2)на 7-10 сутки после операции; 3)через 3 месяца после операции. На сегодняшний день в исследование включены 23 пациента, из них 8 получали НАХТ и 15 не получали НАХТ. На проспективном материале нами был проведен анализ субпопуляционного состава моноцитов периферической крови у пациентов с раком прямой кишки и ободочной кишки и здоровых доноров. Соотношение субпопуляций CD14+CD16-; CD14+CD16+ и CD14-CD16+ не отличалось в группах здоровых доноров и пациентов с раком толстого кишечника. Далее при помощи метода секвенирования следующего поколения был исследован транскриптомный профиль моноцитов периферической крови у пациентов с раком прямой и ободочной кишки до лечения и у здоровых доноров. Нами были выявлены основные функциональные биохимические и молекулярные сигнальные пути и, соответственно, группы дифференциально экспрессированных генов: 1) отличающих моноциты онкологических пациентов и здоровых доноров; 2) отличающих моноциты пациентов с опухолью прямой кишки и с опухолью ободочной кишки. Главные различия в транскрипционном профиле моноцитов наблюдались между больными РТК и здоровыми донорами с высокой степенью статистической достоверности и большим уровнем значимости, который выражался в показателях p-value и log2FoldChange (p value<0,000001, log2FC>2). Основные отличия в моноцитах пациентов с раком толстой кишки по сравнению со здоровыми донорами относились к активации программ, ответственных за эстрогеновый ответ, эпителиально-мезенхимальный переход, WNT-beta катениновый путь, NOTCH4 сигнальный путь, заживление ран (регенерация), деацитилирование гистонов, и подавлению программ, ответственных за оксидативное фосфорилирование, метаболизм жирных кислот, mTOR сигналинг, гипоксию, ROS сигнальный путь в фагоцитах, презентация антигена, метилирование ДНК. В моноцитах больных с раком прямой кишки и ободочной кишки наблюдаются дополнительные отличия. Так, в моноцитах крови больных раком прямой кишки дифференциально активировались следующие транскрипционные программы, отвечающие за скавенджинг и TGFb сигналинг, а в моноцитах больных раком ободочной кишки – интерферон гамма-зависимый путь, активация лейкоцитов, ангиогенез. Для дальнейшего анализа на следующем этапе проекта (2020-2021 гг) будет выбран набор генов, дифференциальная экспрессия которых достигала статистически достоверной разницы (p-value=1*10-5, log2FC=6-8) и которые были интересны в связи с их функциональной активностью в поляризации моноцитов и макрофагов, а также в прогрессии ряда опухолей, в том числе при РТК. Данные гены относятся к функциональным группам эпителиально-мезенхимального перехода, модификации гистонов, WNT-beta катенинового пути, NOTCH4 сигнального пути, mTOR сигналинга, ROS сигнального пути. Далее на ретроспективном материале в опухоли толстого кишечника при помощи иммуногистохимического анализа нами была показана прогностическая значимость CD8 и IL35 в отношении лимфогенного метастазирования и рецидивирования. Высокая экспрессия как CD8, так и IL35 ассоциировалась с низким уровнем лимфогенного метастазирования и рецидивирования у больных как общей группы с раком толстого кишечника, так и больных с локализацией опухоли в прямой кишке. Интересно, что у пациентов с раком прямой кишки экспрессия CD8 негативно коррелировала с экспрессией маркеров М2 макрофагов CD163 и стабилином-1, для которого показали новую функцию скавенджинга EGF (Larionova et al., Cells, submitted). Было также отмечено, что экспрессия стабилина-1 у больных с предоперационной химиотерапией была статистически значимо ниже по сравнению с группой пациентов без НАХТ. Стабилин-1 играет роль скавенджер-рецептора в опухолевом микроокружении, который поглощает различные компоненты микроокружения и регулирует гомеостатический баланс опухоли, и его снижение под влиянием химиотерапии может приводить, соответственно, к дисбалансу про- и противоопухолевых факторов. Более того, высокая экспрессия IL35 была ассоциирована с менее злокачественным фенотипом. Наоборот, экспрессия основного маркера М2 CD206 оказалась выше в группе с более злокачественным фенотипом (при 3 стадии заболевания по сравнению со 2 стадией). У больных раком ободочной кишки повышение уровня экспрессии CD206 было ассоциировано с наличием лимфогенного метастазирования. Эти результаты говорят о способности М2 макрофагов поддерживать прогрессию рака толстой кишки. Кроме того, при помощи конфокальной микроскопии образцов опухоли толстой кишки мы обнаружили потенциальный маркер противоопухолевой активности макрофагов при раке толстой кишки - IL35. Мы проанализировали иммунный статус опухолей толстого кишечника и установили, что снижение уровня СD8 и IL35 указывает на плохой прогноз и повышение вероятности лимфогенного, но не гематогенного метастазирования. Более того, нами было показано, что IL35 (признанный маркер регуляторных лимфоцитов) экпрессируется в опухолеассоциированных макрофагах в раке толстого кишечника. Таким образом, мы проанализировали иммунный статус опухолей толстого кишечника и установили, что снижение уровня СD8 и IL35 указывает на плохой прогноз и повышение вероятности лимфатического, но не гематогенного метастазирования. Далее мы установили, что транскрипционный профиль циркулирующих моноцитов пациентов с раком толстого кишечника имеет значительные функциональные отличия от моноцитов здоровых доноров. В моноцитах больных активируются транскрипционные программы, связанные с гормональной регуляцией, ремоделированием тканей, клеточной дифференцировкой и миграцией. Основным отличием между двумя локализациями рака толстого кишечника: раком прямой и ободочной кишки, являются активация противооспалительных программ, отвечающих за скавенджинг и TGFb сигналинг, в моноцитах пациентов с раком прямой кишки, а в моноцитах больных раком ободочной кишки – провоспалительных программ интерферон гамма-зависимого пути и активации лейкоцитов. 1) Kzhyshkowska J., Larionova I., Liu T. YKL-39 as a potential new target for anti-angiogenic therapy in cancer Frontiers in Immunology (принята в печать, 2019 г.). 2) Kzhyshkowska J., Grigoryeva E., Larionova I. Targeting the tumor-associated macrophages for ‘normalizing’ cancer. Network-based Pharmacology and Personalized Systems Approach in Bio-medicine: Approaching Human Complex Diseases (Springer Nature, принята в печать, 2020 г.) 3) I. Larionova, N. Cherdyntseva, T. Liu, M. Patysheva, M. Rakina, J. Kzhyshkowska. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy // Oncoimmunology. – 2019. – V.8, № 7. 4) Patysheva M., Stakheyeva M., Larionova I., Fedorov A., Kzhyshkowska J., Cherdyntseva N. Cytostatic cancer therapy modulates monocyte-macrophage cell functions: how it impacts on treatment outcomes. Experimental oncology. - 2019. - 41 (3). - P. 248-253. 5) Irina Larionova, Tengfei Liu, Marina Patysheva, Alexey Sergushichev, Dieuwertje M. Mossel, Vladimir Riabov, Artem Kiselev, Elena Kazakova, Evgeny Denisov, Nikolai Litviakov, Nadezhda Cherdyntseva, Julia Kzhyshkowska. Stabilin-1 mediated clearance of EGF by tumor-associated macrophage is suppressed by chemotherapeutic agent cisplatin (подана в журнал Cells, 2020). 6) Larionova I.V., Liu T., Riabov V., Mossel D.M.,Patysheva M.R.,Kiselev A.M.,Kazakova E.O.,Cherdyntseva N.V., Kzhyshkowska J. The clearance of EGF by tumor-associated macrophages is suppressed by chemotherapeutic agent cisplatin. Annals of Oncology, Volume 30, Issue Supplement_5, October 2019, mdz269.043, https://doi.org/10.1093/annonc/mdz269.043 7) Larionova I., Kiselev A., Cherdyntseva N., Kzhyshkowska J. Differences in the effect of cisplatin on the transcriptional profile of tumor-associated macrophages of breast cancer and colon cancer in vitro. EMDS 2019. 8) Patysheva M., Larionova I., Zavyalova M., Grigorieva E., Cherdyntseva N., Kzhyshkowska J. The association of chitinase-like protein YKL-39 with locoregional and distant metastases in human colorectal cancer. EMDS 2019.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Терапевтическая чувствительность опухолей существенно зависит от сложного взаимодействия раковых клеток с различными компонентами микроокружения опухоли (TME), особенно с опухолеассоциированными макрофагами (ОАМ) (Larionova I., et al., Cancers, 2020). Химиотерапия может стимулировать противоопухолевый иммунитет, тем самым увеличивая полный патологический ответ на лечение. С другой стороны, ОАМ могут накапливаться в опухоли после химиотерапии и обеспечивать устойчивость к лечению и способствовать прогрессии опухоли путем подавления Т-клеточного иммунитета, поддержания выживания опухолевых клеток и стимуляции реваскуляризации опухоли (Larionova I., et al., Oncoimmunology, 2019). Однако для достижения максимальной эффективности химиотерапии необходимо исследовать молекулярные механизмы взаимодействия химиотерапевтического агента с ОАМ, что позволит разработать стратегии программирования противоопухолевой активности ОАМ. Чрезвычайно важным фактором, определяющим функциональное программирование ОАМ в опухолевом очаге является программирование моноцитов крови, которые инфильтрируют в опухоль и являются главным пластическим ресурсом ОАМ. Вопрос о влиянии программирования моноцитов крови (предшественников макрофагов) на развитие последующей про- либо противоопухолевую активности ОАМ является наиболее актуальным и практически не исследован. При различных типах рака ОАМ имеют специфичные фенотипы и могут быть представлены специфическими гетерогенными популяциями (Larionova I., Frontiers in Oncology, 2020). Отдельные фенотипы ОАМ определяются набором маркеров, которые не обязательно дают четкую классификацию на M1 и M2 субпопуляции. В случае рака кишечника, существуют противоречивые данные о способности ОАМ как поддерживать развитие опухоли, так и оказывать противоопухолевое действие (Larionova I., Frontiers in Oncology, 2020). В течение первого и второго года проекта нами была сформирована уникальная коллекция образцов моноцитов периферической крови и опухолевой ткани пациентов с раком толстой кишки (РТК) для сравнительного анализа моноцитов и опухолеассоциированных макрофагов (ОАМ) для каждого отдельного пациента. Принципиальным моментом нашего проекта является то, что из группы больных раком толстой кишки были сформированы 2 группы пациентов с опухолью прямой и ободочной кишки, что дает возможность впервые проанализировать различия в транскриптомном профиле моноцитов при разной локализации РТК. В течение второго года проекта нами выявлены основные функциональные группы дифференциально экспрессированных генов: 1) отличающих моноциты онкологических пациентов и здоровых доноров; 2) отличающих моноциты пациентов с опухолью прямой кишки и с опухолью ободочной кишки; 3) отличающих моноциты пациентов с раком прямой кишки до и после химиотерапии; 4) отличающих моноциты пациентов с раком прямой кишки до и после операции; 5) отличающих моноциты пациентов с раком ободочной кишки до и после операции. Сравнение транскриптомного профиля моноцитов здоровых доноров и больных колоректальным раком (рак прямой кишки и рак сигмовидной кишки) было проведено при помощи высокопроизводительного полнотранскриптомного секвенирования (на платформе Illumina NextSeq500). Было установлено, что в моноцитах больных активируются следующие программы: транспорт железа, IL-4-зависимый ответ, INFgamma-зависимый ответ, ангиогенез, клеточная адгезия, миграция, хемотаксис, формирование коллагена. В моноцитах пациентов с КРР подавлялись программы ацетилирования гистонов и хроматиновой перестройки. Бионформатический анализ транскрипционного профиля моноцитов пациентов с раком прямой кишки или раком сигмовидной кишки при независимом сравнении этих групп с моноцитами здоровых доноров выявил аналогичные группы дифференциально экспрессированных генов. Профиль моноцитов больных раком прямой кишки до и после неоадъювантной химиотерапии имел четкие отличия, что говорит о том, что химиотерапия может влиять на программирование моноцитов крови. Так, у пациентов с раком прямой кишки в моноцитах после НАХТ по сравнению с моноцитами до НАХТ подавляются программы: эндоцитоз, гипоксия, MTORC1-сигналинг, эпителиально-мезенхимальный переход, апоптоз, метаболизм жирных кислот, ангиогенез, транспорт железа, IL-10 сигналинг, IL-4-зависимый ответ. В то же время после НХАТ активируются программы – WNT-beta-катенинновый сигналинг, NOTCH сигналинг и ДНК репарация. Наши данные показали, что моноциты после операции имеют аналогичные с моноцитами после НАХТ изменения экспрессии функциональных групп генов. Анализ фенотипических особенностей моноцитов при КРР с помощью проточной цитометрии выявил, что клетки, экспрессирующие СD163+ и CCR2+, наиболее информативны для изучения роли моноцитов в патогенезе КРР и исследования их диагностической и предсказательной ценности. Минорные субпопуляции моноцитов отличаются большей чувствительностью к распространению опухолевого процесса. Резекция опухоли и оперативное вмешательство активировали миграционный потенциал моноцитов за счет повышения CD14+CD16-CCR2+ субпопуляции. Было показано, что миграционная способность моноцитов больных с КРР выше по сравнению с моноцитами здоровых доноров, как в случае базовой миграционной активности, так и в случае индуцированной хемокинами миграции. Полученные данные совместно с данными РНК секвенирования позволят нам выявить механизмы программирования функций моноцитов самой опухолью у пациентов с КРР и механизмы программирования под влиянием противоопухолевой терапии. В свою очередь, установление данных механизмов позволить выявить терапевтические мишени для программирования противоопухолевой активности ОАМ. При помощи ИГХ анализа опухолевой ткани рака толстой кишки было обнаружено, что SPP1 является негативным прогностическим маркером в отношении лимфогенного и гематогенного метастазирования у пациентов с раком прямой кишки. В то время как, наоборот, экспрессия S100A4 оказалась благоприятным прогностическим фактором в отношении рецидивирования и гематогенного метастазирования в группах пациентов с раком ободочной кишки, раком прямой кишки и раком поперечно-ободочной кишки. При помощи конфокальной микроскопии мы выявили, что основным источником этих белков являлись опухолеассоциированные макрофаги вне зависимости от их дальнейшей поляризации (М1 или М2). Также полученные при помощи ПЦР в режиме реального времени данные указывают на негативную роль IL-12А в отношении гематогенного метастазирования у больных с КРР. В прошлом году нами на ретроспективной выборке пациентов с раком кишки было показано, что снижение уровня белковой экспрессии СD8 и IL35 (IL-12A) указывает на плохой прогноз и повышение вероятности лимфатического, но не гематогенного метастазирования. Таким образом, при помощи полностранскриптомного секвенирования моноцитов периферической крови мы выявили функционально значимые различия в профиле моноцитов больных КРР и здоровых доноров. Также мы показали, что химиотерапия и резекция опухоли изменяют транскриптомный профиль моноцитов у больных с раком прямой кишки, однако профиль моноцитов скорее всего не зависит от локализации опухоли в кишечнике. На гистологическом материале от больных КРР нам удалось выявить новые маркеры прогноза в отношении лимфогенного и гематогенного метастазирования при КРР. В течение третьего года проекта мы установим механизмы эпигенетического программирования моноцитов больных КРР на уровне гистонового кода. Мы завершим валидацию результатов полнотранскриптомного секвенирования, полученных в 2020 году, как на проспективной независимой выборке с использованием моноцитов периферической крови больных КРР, так и на ретроспективной выборке больных КРР с использованием операционного опухолевого материала.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Моноциты – клетки врожденного иммунитета, принадлежащие к системе мононуклеарных фагоцитов, которые служат важными регуляторами развития и прогрессирования рака. Они являются главным пластическим ресурсом опухолеассоциированных макрофагов [Larionova I., et al., Cancers., 2020]. Моноциты человека представляют собой высоко гетерогенную популяцию клеток, которую можно идентифицировать с помощью различных маркеров, таких как HLA-DR, CX3CR1, CCR2, CD62L, Tie2, CD86, CD206 и др. В рамках отчета 2021 года используя проточную цитометрию, мы исследовали распределение экспрессии CCR2 и CD163 на классических (CD14+16-), промежуточных (CD14+16+) и неклассических (CD14+16++) субпопуляциях моноцитов. Хемокин CCL2, главный хемоаттрактант моноцитов, определяет мобилизацию моноцитов из костного мозга в кровь и их привлечение в ткань из кровотока [Olingy, C.E. et al., 2019]. ОАМ, рекрутируемые CCR2-зависимым образом, вносят вклад в развитие опухоли [Loyher, P.L, et al., 2018]. Накопление CD163+ моноцитов считается маркером высокой злокачественности при колоректальном раке (КРР), однако уровень экспрессии CD163 на моноцитах не был связан с клиническим исходом [Larionova I., et al., F oncology, 2020; Krijgsman, D., et al., 2020]. В рамках отчетного периода при помощи проточной цитометрии мы выявили биологические достоверные различия в распределении экспрессии CCR2 и CD163 среди пациентов с раком прямой и ободочной кишки. Как НАХТ, так и хирургическое вмешательство влияют на пропорцию CCR2+ и CD163+ моноцитов в неклассических субпопуляциях CD14-CD16+ и CD14+ CD16+ у пациентов с КРР (Larionova I., et al.,2021, submitted in Gut, IF= 23.059, см. приложение рисунок 13). Эти эффекты специфичны для пациентов с раком прямой и толстой кишки. Мы продемонстрировали, что у пациентов с раком прямой кишки повышенный процент CCR2+ моноцитов свидетельствует об отсутствии как лимфогенного, так и гематогенного метастазирования. У пациентов с раком толстой кишки популяция CD163+ моноцитов была показателем развития лимфатических метастазов. Результаты хроматиновой иммунопреципитации, полученные нами в рамках проекта, не обнаружили статистической значимости на уровне гистонового кода. Эти данные говорят о том, что дифференциальная экспрессия выбранных генов не регулируется стандартными эпигенетическими механизмами на уровне ацетилирования гистонов. В перспективе, исследования более уникальных активирующих гистоновых маркеров необходимо для выяснения специфических для моноцитов пациентов с колоректальным раком вариантов эпигенетической регуляции структуры хроматина. Также мы показали, что способность М0 ОАМ к эндоцитозу acLDL в группе пациентов превышала показатель контрольной группы. Интересно, что поглощение acLDL М0 макрофагами было больше, чем М2 макрофагами. В отношении опухолеспецифического лиганда EGF наблюдалось статистически значимое повышение способности к эндоцитозу в моноцитах больных КРР как для М0, так и для М2 макрофагов. Ранее, в рамках проекта РНФ 14-15-00350 нами было показано, что химиотерапевтический препарат платинового ряда цисплатин ингибирует клиренс-функцию ОАМ в отношении эндоцитоза про-опухолевого лиганда EGF. Накопление опухолевых медиаторов в опухолевом микроокружении может быть причиной ОАМ-опосредованной химирезистентности. Биоинформатические методы и подходы, используемые в данном исследовании, были улучшены в рамках данного проекта в 2021 году (Larionova I., et al.,2021, submitted to Cancer cell, IF= 31.743, см. приложение, рисунок 14). Данные полученные в процессе RNAseq и RT-PCR позволили нам впервые идентифицировать специфическую повышенную регуляцию гликолитического активатора PFKFB3 у пациентов с раком ободочной кишки по сравнению со здоровыми донорами и пациентами с раком прямой кишки. Наши данные впервые демонстрируют, что рак ободочной кишки влияет на транскриптом циркулирующих моноцитов и вызывает повышение экспрессии PFKFB3 (Larionova I., et al.,2021, submitted to Gut, IF= 23.059, см. приложение рисунок 13). Более того, конфокальная микроскопия показала, что PFKFB3-положительные моноциты, которые являются предшественниками ОАМ, массово инфильтрируют опухолевую массу. Учитывая, что повышенное количество ОАМ при раке толстой кишки указывают на хороший прогноз, и что самые последние результаты показывают, что ОАМ при раке толстой кишки сохраняют противораковую активность, PFKFB3, который может поддерживать гликолитическую активность ОАМ, также может быть полезен для пациента в противораковом иммунитете. Этот факт необходимо учитывать при разработке противораковой терапии и планировании клинических испытаний.