Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Цитотоксические лимфоциты врожденной и адаптивной иммунной системы – CD8-экспрессирующие Т-клетки и NK-клетки – играют важную роль как в противовирусных, так и в противоопухолевых защитных реакциях организма. Экспансия CD8+ Т-клеток и NK-клеток в периферической крови часто наблюдается при цитомегаловирусной инфекции (HCMV). Формирующийся при этой инфекции пул так называемых адаптивных NK-клеток можно выделить по наличию, наряду с маркером терминальной клеточной дифференцировки CD57, активирующего рецептора NKG2C, взаимодействующего с молекулой HLA-E. Этот же рецептор может быть найден на поверхности эффекторных Т-клеток памяти. Данный проект направлен на многоуровневую характеристику пулов NKG2C-позитивных цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток, исследование механизмов их формирования, оценку функциональной значимости этих пулов и взаимосвязи NK- и T-клеточного ответа при цитомегаловирусной инфекции. За отчетный период нами выполнен анализ ex vivo распределения NKG2C-экспрессирующих клеток в мало и высоко дифференцированных субпопуляциях NK-клеток и Т-лимфоцитов, включая NKT-подобные клетки. Продемонстрирован ряд корреляций, свидетельствующих о тесной взаимосвязи формирования пула NKG2C+ T-клеток и развитием фракции NKT-подобных (CD56-позитивных) клеток, а также о значительной скоординированности NK-клеточного и Т-клеточного иммунного ответа. Большинство NKG2C-экспрессирующих Т-клеток имело фенотип высокодифференцированных TEMRA-клеток (CCR7–CD45RA+CD45RO–CD28–), было позитивно по CD8 и CD57 и экспрессировало NK-клеточные рецепторы NKG2D, CD16 и KIR. При этом, во фракции CD56+ таких клеток было больше, по сравнению с фракцией CD56–. C помощью клеточной сортировки были выделены фракции CD56+/– T-клеток, экспрессирующих NKG2C, либо негативных по этому маркеру. В этих фракциях, а также в цельной популяции Т-лимфоцитов был проанализирован клональный состав с помощью метода реконструкции репертуара участков CDR3 β-цепей T-клеточного рецептора c использованием метода высокопроизводительного секвенирования. Для клеточной фракции CD3+CD56+NKG2C+ было выявлено преобладание одного клонотипа, что указывает на предшествующую клональную экспансию клеток, экспрессирующих данный вариант TCR. Клоны, преобладающие во фракции CD3+CD56+NKG2C+, в большинстве случаев были идентифицированы в полной фракции Т-клеток с наиболее высокими частотами встречаемости. Интересно, что преобладающая экспансия одного клонотипа была выявлена и у HCMV-серонегативного индивида, что свидетельствует о том, что такая экспансия необязательно ассоциирована с инфекцией HCMV. Таким образом, экспрессия NKG2C во фракции CD56+ Т-клеток маркировала наиболее широко представленные клеточные клоны. Примечательно, что данные клонотипы могли быть обнаружены в NKG2C-негативных фракциях с различными частотами, что указывает на то, что целые клоны не являются полностью NKG2C-позитивными. Т-лимфоциты, экспрессирующие CD56 и NKG2C, проявляли характерную для NK-клеток натуральную и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность. Однако, в предварительных экспериментах нам не удалось выявить HCMV-специфическую продукцию IFN-γ в NKG2C+ T-клетках. При исследовании мало и высокодифференцированных субпопуляций NK-клеток ex vivo (CD56bright, CD56dimCD57‒ и CD56dimCD57+) было выявлено, что на всех рассмотренных стадиях дифференцировки величина экспрессии рецепторов KIR (KIR2DL2/DL3 и KIR2DL1) в NKG2C-позитивных NK-клеток была выше, чем в соответствующих NKG2C-негативных клетках. В NKG2C-позитивных NK-клетках на всех стадиях дифференцировки было меньше NKG2A-позитивных, что также характеризует их как более зрелые по отношению к соответствующим NKG2C-негативным субпопуляциям. В субпопуляции CD56dim NKG2C-позитивные клетки имели повышенный уровень экспрессии HLA-DR, что указывает на их активированный статус. Полученные данные предполагают, что уже на стадии CD56bright и в особенности на стадии CD56dimCD57‒ начавшие экспрессировать NKG2C NK-клетки приобретают черты, сходные с терминально-дифференцированными, адаптивными NK-клетками CD56dimCD57+NKG2C+, и, вероятно, являются их предшественниками. Расшифровка механизмов формирования иммунного ответа на цитомегаловирус, которым заражено более половины населения, и который является причиной повышенной смертности людей с угнетеной иммуной системой, поможет разработать новые стратегии профилактики, мониторинга и лечения иммуноскомпрометированных пациентов, таких как, например, онкологические больные, реципиенты трансплантата и инфицированные HIV индивиды.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основными эффекторами как противовирусного, так и противооопухолевого иммунитета в организме человека являются цитотоксические лимфоциты – CD8-экспрессирующие Т-клетки и NK-клетки, объединяющие усилия врожденной и адаптивной иммунной системы. Цитомегаловирусная инфекция (HCMV) вызывает значительное перераспределение репертуара NK-клеток с накоплением NKG2C+CD57+ так называемых адаптивных NK-клеток. Инфекция HCMV вызывает также накопление высокодифференцированных Т-клеток, часть из которых также экспрессируют рецептор NKG2C, называемое Т-клеточной инфляцией. В нашей работе с помощью анализа клонального состава фракций Т-клеток c использованием метода реконструкции репертуара TCR-beta показано, что большинство клеток NKG2C+ в субпопуляции CD56+ Т-клеток, или NKT-подобных клеток, принадлежит одному или нескольким клонам CD8+ αβТ-клеток, при этом часто составляя значительную часть общей фракции Т-клеток CD8+. Большинство NKG2C+ Т-клеток экспрессировали другие рецепторы, типичные для NK-клеток, такие как NKG2D, KIR и CD16, и были позитивны по маркеру CD57 и демонстрировали признаки активации. Была проанализирована продукция IFN-γ в ответ на HCMV-специфическую стимуляцию с помощью набора пептидов из белка pp65 в NKG2C-негативных и NKG2C-позитивных CD8+ Т-клетках. Продуцентов IFN-γ практически не было в субпопуляции CD8+CD56+NKG2C+, что демонстрирует отсутствие pp65-специфического ответа в этой фракции клеток. Клетки NKG2C–, в отличие от клеток NKG2C+, демонстрировали значительный уровень продукции IFN-γ в ответ на данную стимуляцию. Было показано, что клетки CD45RA+CD57+ продуцировали меньше IFN-γ в ответ на pp65 по сравнению со всеми CD8+ Т-клетками. С другой стороны, в то время как клетки CD45RA+CD57+NKG2C-, по-видимому, все-таки сохраняли определенный уровень антиген-специфической продукции IFN-γ, Т-клетки NKG2C+, большинство из которых были положительными по CD45RA и CD57, почти не вырабатывали IFN-γ. Полученные данные указывают на то, что дифференцировка Т-клеток связана со снижением продукции антиген-специфичного IFN-γ с минимальной продукцией в клетках, экспрессирующих NKG2C. Экспрессия NKG2C указывает на рост и «старение» индивидуальных клонов Т-клеток. Однако остается неясным, являются ли такие клоны специфичными в отношении антигенов HCMV. Показано, что клетки фракции CD3+CD56+NKG2C+ обладают существенной активностью в тестах натуральной и антителозависимой клеточной цитотоксичности. Этот факт, наряду с повышенной экспрессией рецепторов NK-клеток, свидетельствует об определенном сходстве этой субпопуляции Т-клеток с NK-клетками. Нами продемонстрирована положительная корреляция NKG2C+ T-клеток и NKG2C+ NK-клеток, что косвенно указывает на скоординированное образование этих подмножеств. За отчетный период также получены данные о функциональной активности фракций NKG2C-позитивных и негативных NK-клеток, отличающихся по степени дифференцированности и экспрессии рецепторов KIR. По результатам сравнительного анализа была выбрана субпопуляция CD56dimCD57-NKG2C+ KIR2DL2/DL3+, которая по-нашему мнению является наиболее функционально активной, так как способна отвечать на любой представленный стимул на довольно высоком уровне. Эта же субпопуляция NK-клеток, наряду с субпопуляцией CD56brightNKG2C+KIR2DL2/3+ обладала наибольшей пролиферативной активностью. Эти данные подтверждают нашу гипотезу, что менее дифференцированные NKG2C+ NK-клетки могут являться предшественниками адаптивных NK-клеток. Анализ данных РНК-секвенирования, так же, как и подробный фенотипический анализ субпопуляций NK-клеток, свидетельствуют о том, что процессы дифференцировки NK-клеток и формирования пула адаптивных NK-клеток, хотя и взаимосвязаны, но частично отличаются, о чем свидетельствует изменения в экспрессии ряда поверхностных и внутриклеточных молекул, в частности, транскрипционного фактора PLZF, сигнальных молекул SYK, EAT-2 и FcεRγ. В заключение, нами получены генномодифицированные клетки К562, экспрессирующие молекулу HLA-E, которые будут использованы в последующей работе для изучения возможности получения адаптивных NK-клеток in vitro.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период были выявлены новые характеристики клональной активности субпопуляций NK-клеток: тенденция к образованию большего количества клонов наблюдалась для менее дифференцированных NK-клеток CD57–KIR2DL2/3– независимо от экспрессии на них рецептора NKG2C, однако наиболее многочисленные клональные культуры (с наибольшим количеством клеток на 1 клон) в большинстве случаев были получены из более дифференцированных клеток CD57–KIR2DL2/3+NKG2C+. Сравнительный анализ показал, что на начальных стадиях культивирования наименее дифференцированные NK-клетки (CD56brightKIR2DL2/3–) пролиферируют более интенсивно по сравнению с более дифференцированными NK-клетками (CD56bright KIR2DL2/3+), однако на более поздних этапах наблюдается более выраженная экспансия во фракции CD56brightKIR2DL2/3+. Таким образом, субпопуляция CD57–KIR2DL2/3+ обладает пролиферативным потенциалом, который более выражен на более поздних этапах культивирования из-за вклада пролиферирующих клеток, полученных из более крупных клонов (doi: 10.3390/ijms222413326). Было продемонстрировано, что среди менее зрелых CD56bright CD57– и более зрелых CD56dimCD57– NK-клеток распределение субпопуляций с фенотипом KIR2DL2/3+NKG2C+/– различается: более высокое содержание клеток с фенотипом KIR2DL2/3+ наблюдается среди NK-клеток CD56dim по сравнению с NK-клетками CD56bright, тогда как большая часть клеток, негативных по KIR2DL2/3 характеризуют менее дифференцированные CD56bright NK-клетки. Были получены новые данные по экспрессии CD57+ de novo, которая значительно отличается в NK-клеточных фракциях: наибольшая доля экспрессирующих CD57+ de novo зарегистрирована в высокодифференцированной подгруппе CD57–KIR2DL2/3+NKG2C+ и наименьшая - в менее дифференцированной подгруппе CD57–KIR2DL2/3–NKG2C– NK-клеток. Было продемонстрировано, что субпопуляция наиболее дифференцированных с фенотипом KIR2DL2/3 +NKG2C+ среди CD57– NK-клеток обладает повышенной чувствительностью к ретровирусной генетической модификации, что ассоциировано с повышенным пролиферативным потенциалом при длительном культивировании, а также экспериментально была подтверждена положительная взаимосвязь между уровнем экспрессии маркера активации HLA-DR и восприимчивостью NK-клеток к трансдукции. Функциональная роль NK-клеток, экспрессирующих HLA-DR, была исследована также в иммунном ответе на M. tuberculosis. Показано, что доля как NK-, так и NKT-клеток (CD56+ Т-лимфоцитов), экспрессирующих HLA-DR, достоверно выше у больных туберкулезом (ТБ) по сравнению со здоровыми добровольцами. Показано, что HLA-DR-позитивные NK-клетки при ТБ отличались более высокой продукцией IFN-g, по сравнению с HLA-DR-негативными. Более того, HLA-DR-позитивные NK-клетки после предварительной инкубации с антигенами M. tuberculosis были способны инициировать активацию CD4+ Т-клеток (doi: 10.3389/fimmu.2021.662128). Дополнительно было показано, что HLA-DR-экспрессирующие клетки из терминально дифференцированной субпопуляции CD56dimCD57+NKG2C+ обладают повышенной экспрессией всего антиген-презентирующего комплекса на фоне повышенной экспрессии целого ряда ингибирующих рецепторов, что позволяет предположить возможность осуществления антигенпрезентации данными клетками, под «контролем» ингибирующих цитотоксическую активность рецепторов во избежание аутореактивности. Данные, полученные при анализе транскриптома разной степени дифференцированных (CD57+ и СD57– ) CD56dim NK-клеток c фенотипом NKG2C+ выявил измененный уровень экспрессии ряда генов в этих субпопуляциях по сравнению с NKG2C-негативными аналогами, что позволяет рассматривать эти клетки в качестве предшественников адаптивных клеток. По результатам анализа транскриптома NK-клеток ex vivo на разных стадиях дифференцировки, экспрессирующих и не экспрессирующих NKG2C, было выявлено, что менее дифференцированная субпопуляция CD56dimCD57-NKG2C+ и терминально диффетенцированная адаптивная субпопуляция CD56dimCD57+NKG2C+ имеют общие черты, однако вместе с этим демонстрируют определенные различия в функциональном потенциале. Обе субпопуляции характерно отличались от соответствующих NKG2C-негативных NK-клеток увеличенной экспрессией другого HLA-E-распознающего рецептора NKG2E, а также сниженной экспрессией активирующего ко-рецептора CD161. В то же время, непосредственный дифференциальный анализ между субпопуляциями CD57-NKG2C+ и CD57+NKG2C+ показал, что клетки из менее дифференцированной фракции демонстрируют бОльший функциональный потенциал за счет увеличенной экспрессии гранзима К, IFN-g и CSF2, активирующих ко-рецепторов, рецепторов цитокинов. Вероятно, терминально дифференцированные NKG2C+ NK-клетки находятся в более анергичном состоянии. Учитывая полученные ранее в проекте экспериментальные данные об увеличенном пролиферативном потенциале в клеточных культурах менее дифференцированной CD56dimCD57-NKG2C+ фракции, можно утверждать, что эти клетки более способны отвечать на различные стимуляции, в том числе через HLA-E, представляя из себя более активную стадию развития «адаптивно-подобных» NK-клеток. Таким образом, данная субпопуляция может рассматриваться в качестве предшественников адаптивных клеток. Было показано, что клеточные линии, модифицированные геном HLA-E, без инкубации с НCMV-пептидом не экспрессировали HLA-E на клеточной поверхности. Были получены HLA-E-модифицированные клеточные линии и оценены их модулирующие эффекты на NK-клетки. Сравнительный анализ пролиферативного потенциала NK-клеток в присутствии фидерных клеточных линий выявил, что использование K562-mbIL21, K562-mbIL21-HLA-E, Raji способствует увеличению пролиферации NK-клеток, интенсивность которого сильно зависит от исходных индивидуальных особенностей доноров, которые могут быть связаны с исходным количеством NKG2С-позитивных NK-клеток в крови. При разных типах стимуляции был проанализирован моделирующий эффект на поверхностную экспрессию основных NK-клеточных маркеров, ингибирующих и активирующих рецепторов. Показано, что стимуляция различными фидерными клетками приводят к увеличению процента позитивных клеток по маркерам дифференцировки (CD57) и активации (HLA-DR). Совокупность полученных данных свидетельствует в пользу того, что на фоне выраженной пролиферативной индукции NK-клеток, HLA-E-модифицированные клеточные линии не оказывают модулирующего эффекта на уровень натуральной и АТ-зависимой цитотоксичности, не изменяют уровень экспрессии FcεRγ цепи, характерный для адаптивных NK-клеток.