Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Был проведен дизайн ДНК-зондов для определения ферментативной активности рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов CRISPR/Cas9. Проанализированы недавние труды, посвященные ДНК зондам – субстратам для системы CRISPR/Cas, а также работы описывающие структуру и динамику взаимодействия РНП комплекса с дцДНК мишенью. Исходя из анализа литературы очевидна важность конформационной подвижности эндонуклеазы Cas9 относительно ДНК субстрата и гидовой РНК. Важно сказать, что, по-видимому, в предыдущих работах авторы не учитывали трехмерную структуру РНП комплекса при дизайне последовательностей зондов и положения флуоресцентного маркера, в некоторых случаях и вовсе вводя метки в участок комплементарный непосредственно гидовой РНК. Исходя из анализа, были предложены структуры ДНК-зондов. Все зонды содержат двухцепочечный ДНК участок комплементарный последовательности гена зеленого флуоресцентного белка egfp (46 п.о.), включающий PAM (protospacer adjacent motif) участком (GGG) и участок комплементарный гидовой РНК (20 п.о.). Зонды синтезированы в двухцепочечных вариантах (H/R probes 1-3) и одноцепочечном шпилечном (ssH/R probe) для сравнения эффективности двумолекулярной структуры зондов типа «Yin-Yang» и одномолекулярного зонда типа «molecular beacon». Также были синтезированы зонды с удлиненными последовательностями (extH/R probes 1-3), включающими ненуклеотидную вставку – гексаэтиленгликолевый линкер, не участвующий в гибридизации олигонуклеотидной цепи. Для оценки неспецифической активность комплекса CRISPR/Cas9 в отношении дцДНК-мишени (“off-target” эффекты) был синтезирован зонд (ssH Scr probe) с вырожденной последовательностью (20 п.о.) не комплементарной/частично комплементарной гидовой РНК. Для увеличения чувствительности флуоресцентного анализа были выбраны красители сульфо-Су3 и сульфо-Су5, обладающие высокой яркостью флуоресценции. В первом варианте сульфо-Су5 комбинирован с тушителем флуоресценции - BHQ2, так, при деградации зондов происходит увеличение флуоресценции сульфо-Су5. Также была использована FRET пара красителей: сульфо-Су3 в качестве донора и сульфо-Су5 в качестве акцептора флуоресценции. Кроме того, в качестве донорно-акцепторной пары были выбраны флуорофоры на основе эксимер-образующей пиреновой метки P1P1 в качестве донора и сульфо-Су3 – акцептор. Мы показали, что пиреновый эксимер в качестве флуоресцентного донора способен с высокой эффективностью возбуждать цианиновый краситель сульфо-Су3 при том, что последний практически не возбуждается на длине волны возбуждения пирена (350 нм), т.о. достигается разница между максимумом возбуждения донора и испусканием акцептора более 200 нм. Суммарно эти два эффекта обуславливают высокую чувствительность зондов на основе данной FRET пары в гибридизационном анализе, на основании чего мы ожидали снижения предела обнаружения (LOD) для определения активности CRISPR/Cas9. Кроме того, был проведен дизайн и синтез библиотеки модифицированных гидовых РНК, состоящих из CRISPR-ассоциированной РНК (crRNA) и транс-кодирующуей РНК (tracrRNA). Модифицированые РНК содержат 2'-F и 2'-OMe дезоксирибонуклеотидные вставки и тиофосфатные группы (PS) в основной цепи для придания стабильности к нуклеазам. Для гидовых РНК была выбрана последовательность комплементарная участку гена egfp в составе системы Traffic Light Reporter - TLR конструкции. Набор модификаций был выбран после сравнительного анализа последовательностей модифицированных гидовых РНК использованных ранее в литературных источниках. Мы подобрали положения для модификации остова олигонуклеотидов. Мы руководствовались целью выбрать наиболее модифицированную структуру гидовой РНК при этом сохраняющую свою активность вместе с эндонуклеазой Cas9 по отношению к дцДНК-мишени. Кроме того, были получены немодифицированные crispr и tracr РНК и содержащие только по три тиофосфатных группы на 3’- и 5’-концах последовательности для предания стабильности в отношении экзонуклеаз. Таким образом, была синтезирована библиотека гидовых РНК для последующего тестирования активности на клеточных линиях, а также с участием ДНК-зондов. Было получено несколько рекомбинантных белков эндонуклеазы Cas9 содержащих последовательности NLS пептидов (Nuclear Localization Sequence) на обоих N- и C-концах: Cas9 дикого типа из Streptococcus pyogenes (SpCas9), и два мутантных варианта Sniper-Cas9 и HiFi-Cas9. Белки были предоставлены сотрудниками Сколковского Института Науки и Технологии. Вкратце белки Cas9 были экспрессированы в E.coli c полигистидиновой меткой (His-tag), выделены из лизированных клеток и очищены последовательно аффинной и ионообменной хроматографией на Ni-сефарозе и SP-сефарозе. Анализ SpCas9 и двух его мутантных форм Sniper-Cas9 и HiFi-Cas9 проводили гель-электрофорезом после денатурации белков по Лэммли. Белки были разделены по аликвотам и заморожены (-20⁰С) в буфере NEB с 50% (v/v) содержанием глицерина. Одна из значимых проблем с которой мы столкнулись на начальном этапе выполнениия проекта, оказалась невоспроизводимость результатов экспериментов in vitro, которая могла быть обусловлена потерей активности компонент комплекса CRISPR/Cas9 из-за возможной инактивация ферментов Cas9 при его хранении или деградация рибоолигонуклеотидов – гидовых РНК. В этой связи нами были проверены буферы, реагенты и компоненты комплекса CRISPR/Cas9 на наличие РНКаз, посредством их инкубации с тотальной РНК лизированных клеток мышиной печени AML12. После инкубации смеси проводили электрофорез в агарозном геле в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием Sybr Green II. Поскольку нуклеазной активности в реагентах не было выявлено, мы проанализировали работу ферментов Cas9 в различных буферных смесях. Для этого также проводили инкубацию трех вариантов ферментов Cas9 с линеаризованной плазмидой TLR и гидовыми РНК как описано ниже. В результате действительно было выявлено снижение активности ферментов при длительном хранении, однако лучшие результаты показал буфер NEBuffer™ 3.1, в котором снижения активности ферментов со временем выявлено не было. Для подбора и оптимизации условий проведения экспериментов с флуоресцентными зондами предварительно было определено оптимальное соотношение эндонуклеазы Cas9, гидовой РНК и ДНК мишени. Дальнейшие эксперименты проводились с ферментом SpCas9 выделенным из Streptococcus pyogenes. Модельные эксперименты проводили с предорганизованным РНП комплексом Cas9, гидовой РНК (eGFP crRNA-0/tracrRNA-0) и лианеризованной с помощью рестриктазы EcoRI плазмиды TLR (Addgene 31482). Для этого инкубировали tracrRNA-0 (0.8 пмоль), crRNA-0 (0.8 пмоль) и эндонуклеазу Cas9 (0.8 пмоль) в течение 10 минут, затем добавляли ленеаризованную плазмиду и инкубировали смесь при +37⁰С. После обработки протеиназой К для расщепления белков, для анализа смесь наносили на агарозный гель и проводили электрофорез в неденатурирующих условиях. Для экспериментов использовали мольное соотношение ДНК мишени к РНП комплексу: 1:1, 1:10 1:20, 1:50, 1:100. Оптимальным оказалось соотношение, при котором CRISPR/Cas9 берется в 20-кратном избытке по отношению к мишени, при увеличении этого значения эффективность внесения разрывов увеличивается незначительно. Для анализа смеси после электрофореза гель прокрашивали Sybr Green I и анализировали с помощью сканера Chemidoc BIORAD и проводили обсчет при помощи программного обеспечения Image Lab. Для расчёта учитывали интенсивность флуоресценции полос исходной ДНК (иДНК) (8кб) и суммарных продуктов рестрикции (ПР) (3кб и 5кб). Эффективность разрезания рассчитывалась как соотношение интенсивности флуоресценции полос продуктов разрезания плазмиды к общей сумме интенсивностей свечения полос (ПР/(ПР+иДНК))*100%. Кроме того, была получена клеточная линия HEK-293T ATCC (http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx?geo_country=ru) экспрессирующая систему флуоресцентных белков TLR (https://www.addgene.org/31482/).[13] Для этого были выделены псевдотипированные лентивирусы загруженные плазмидами TLR 1.1 также на клеточной линии HEK-293T посредством совместной трансфекции трех плазмид: таргетной (TLR 1.1) и двух упаковочных psPAX2 (https://www.addgene.org/12260/) и pCMV-VSV-G (https://www.addgene.org/8454/). Подбирались условия для трансфекции клеточной линии HEK-293T плазмидами, при этом отбор производили по устойчивости к антибиотику пуромицину. Оптимизировались условия по созданию клеточных линий для производства лентивирусов. Подбирались условия для трансфекции клеток плазмидами, клонирования и выделения плазмид, т.о. выращивали эукариотические клетки, оптимизировали количество плазмид и реагентов для первичной трансфекции (lipofectamine 2000) клеточной линии, проверяли плазмиды на агарозном геле, проверяли эффективности заражения клеток полученными вирусами. Изначально при трансфекции и культивировании клеточной линии мы столкнулись с ключевой проблемой – недостаточным уровнем экспрессии системы флуоресцентных белков клетками. В результате клеточная линия была выведена повторно, учитывая предыдущий опыт с подходящим уровнем флуоресцентного сигнала. Далее будет проводиться параллельное тестирование предорганизованного РНП CRISPR/Cas9 состоящего из нескольких вариантов модифицированных crRNA и tracrRNA, представленных в таблице 2, на клеточной линии, а также с участием флуоресцентных ДНК-зондов. Классический на сегодняшний день скрининг эффективности CRISPR/Cas9 на клеточных линиях не учитывает разницы в стабильности комплекса с химически-модифицированными и природными гидовыми РНК. Сравнение с ДНК зондами позволит выявить вклад различной устойчивости РНК и комплекса в целом.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Для синтезированных ранее одноцепочечных меченных олигонуклеотидов получены аналитические данные – профили ВЭЖХ и масс-спектры. Аналитические данные собраны и проанализированы для всех флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов, модифицированных crispr и tracr РНК. Для двухцепочечных зондов, полученных гибридизацией комплементарных цепей, проведен гель-электрофорез в полиакрилаамидном геле в неденатурирующих условиях для их дополнительной очистки с целью снижения фонового сигнала флуоресценции, обусловленного примесями меченных одноцепочечных олигонуклеотидов. Детальному анализу был подвергнут вариант проведения тестирования РНК-белкового комплекса CRISPR/Cas9 совместно с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами. Были отработаны следующие параметры: концентрация компонент комплекса (гидовых РНК и нуклеаз Cas9), состав буфера для оптимальной работы фермента, время инкубации комплекса с зондами, структура дцДНК-зондов и их мольное соотношение по отношению к РНК-белковому комплексу. После предварительных экспериментов по совместной инкубации дцДНК-зондов, гидовых РНК и никазы Cas9 в 96-луночном планшете с регистрацией флуоресцентного сигнала в планшетном сканере – Tecan (Spark), были выявлены флуктуации фонового сигнала флуоресценции в начальной точке экспериментов для нескольких зондов. В результате дополнительной очистки зондов в полиакриламидном геле удалось значительно снизить фоновый сигнал флуоресценции. В предварительных измерениях флуоресценции по конкурентной гибридизации зондов с гидовыми РНК, проведенных на флуориметре (PerkinElmer LS 55), наибольший флуоресцентный отклик был достигнут в случае зондов, содержащих донорно-акцепторные пары Су3/Су5 - H/R probe 2, а также пиреновую пару Р1Р1 и Су3 - H/R probe 3. Не смотря на это, при повторном проведении таких же экспериментов с регистрацией флуоресценции в планшетном сканере наибольший отклик флуоресценции был зарегистрирован при использовании зондов - H/R probe 1 и ssH/R probe, содержащих комбинацию флуорофора Су5 и темного гасителя BHQ2. Очевидно, полученные результаты связаны непосредственно с чувствительностью оптики планшетного сканера в сравнением с флуориметром, учитывающим спектр лампы и нормировку сигнала. Т.о. была проведена фотофизическая характеризация непосредственно самих зондов (Таблица 1) и зондов совместно с гидовой РНК, образованной eGFP crRNA-0 и eGFP tracrRNA-0 (Таблица 2), в мольном соотношении 1:1 и концентрации 0.5 µМ. Кроме того, были протестированы три буфера: PBS, TRIS-HCl и NEBuffer™ 3.1 с рН 7.4. Был выявлен их минимальный вклад во флуоресцентный сигнал в отсутствие белка Cas9, поэтому далее все эксперименты в отсутствие Cas9 проводили в стандартном 1ХPBS буфере, а при наличии Cas9 - в NEBuffer™ 3.1. Таким образом, первично была проведена количественная спектрометрическая характеризация дцДНК-зондов с применением спетрофлуориметра и спектрофотометра (Cary Varian 4000), а также в комплексе с гидовыми РНК. Далее полученные результаты были валидированы на планшетном сканере. Для анализа эффективности никазной активности были выбраны три мутантных варианта белка Cas9, содержащих последовательности NLS пептидов (Nuclear Localization Sequence) Cas9 дикого типа из Streptococcus pyogenes (SpCas9), Sniper-Cas9 и HiFi-Cas9. Белки Cas9, как было описано в предыдущем отчетном периоде, были также наработаны и предоставлены сотрудниками Сколковского Института Науки и Технологии. Как описывалось ранее, на работу ферментов значительное влияние оказывает длительность хранения, а также буфер, наилучшим из которых был выявлен - NEBuffer™ 3.1. Таким образом, последующие эксперименты проводились по инкубации ДНК зондов - H/R probe 1-3, а также шпилечного - ssH/R probe в присутствии немодифицированной гидовой РНК (eGFP crRNA-0 и eGFP tracrRNA-0) и белка spCas9. При этом концентрация зондов была неизменной: 0.2 µM, а варьировались соотношения компонент CRISPR/Cas9 по отношению к зонду, составляющие 1:1:1, 1:2:1, 1:2:2, 1:5:5, 1:10:10 – зонда, гидовой РНК и Cas9 соответственно. Уровень фоновой флуоресценции учитывался для смеси такого же состава в отсутствие Cas9. Также варьировалось время реакции в клеточном инкубаторе при 37°С. Было выявлено для всех комбинаций, что время более 2 часов незначительно влияет на изменение флуоресцентного сигнала, после чего смесь с никазой spCas9 обрабатывали протеиназой К для расщепления фермента и регистрировали флуоресцентный сигнал в планшетном сканере. Так, оптимальными условиями оказалось мольное соотношение дцДНК-зонда - мишени к РНП комплексу 0.2 µM:1 µM. Отношение сигнал-фон при таком составе варьировалось от 1.2±0.2 до 7.8±0.4 для 7 зондов представленных в таблице 1. К сожалению, зонды, содержащие полиэтиленгликолевые линкеры в своем составе, показали слабый отклик флуоресценции не более 2х-кратного. По-видимому, это связано с наличием неприродной модификации, вносящей значительные вклад в распознавание никазой spCas9 последовательности комплементарной гидовой РНК. Как ранее упоминалось, лучший результат был достигнут для структур H/R probe 1 и ssH/R probe: SBR = 7.8±0.4 и 6.4±0.6. Дальнейшие эксперименты проводились с участием двухцепочечного зонда H/R probe 1 в описанных выше условиях. Для двух предложенных зондов был определен предел детекции (LOD) при анализе активности классического spCas9 и немодифицированной гидовой РНК в соотношении 1:5 (как указано ранее). Производилось измерение флуоресценции серии растворов, содержащих РНП комплекс и зонды с последовательными разбавлениями в планшетном варианте. Т.о., пороговые значения концентраций обоих зондов в предложенных условиях составили: LOD = 0.82±0.12 нМ для H/R probe 1 и LOD = 1.22±0.08 нМ для ssH/R probe. При этом структуры гидовых РНК, содержащих большее число тиофосфатных вставок, по-видимому, обладали значительно меньшей активностью. Так, crispr РНК - eGFP crRNA-0 – 3 оказывали минимальный эффект на «прирост» флуоресцентного сигнала относительно друг друга, в то время как eGFP tracrRNA-2,3,5,6, в отличие от eGFP tracrRNA-0,1, резко снижали увеличение флуоресценции. Вероятно, такое поведение может быть связано с тем, что именно участок tracr РНК в большей степени ответственен за связывание с ферментом Cas9 и его конформационные перестройки. Схожий побочный эффект наблюдался и был многократно описан в литературе и для ASO обогащенных тиофосфатными модификациями, резко увеличивающих токсичность препарата, которую часто ассоциировали с нежелательными и необратимыми взаимодействиями PS-модифицированных олигонуклеотидов с белками. После подбора условий для флуоресцентного анализа на примере немодифицированной гидовой РНК и Cas9 из Streptococcus pyogenes, мы перешли к анализу библиотеки комбинаций трех мутантных версий белка Cas9: Sniper-Cas9 и HiFi-Cas9, совместно с гидовыми РНК состоящими из четырех crispr РНК (eGFP crRNA-0 – 3) и семи tracr РНК (eGFP tracrRNA-0 – 6). Таким же образом была составлена библиотека комбинаций tracr РНК и crispr РНК с двумя улучшенными версиями белка Cas9. Не ожидая каких-либо значительных изменений в эффективности, мы сохранили аналогичные условия проведения реакции и соотношения компонент. Для двух новых мутантных версий Cas9 мы обнаружили больший флуоресцентный отклик после инкубации с зондом и обработки протеиназой К, чем в случае с SpCas9. Более того оба мутанта продемонстрировали большую толерантность к набору сильно-модифицированных как crispr РНК, так и tracr РНК, что выражалось в выравнивании диапазона значений флуоресценции. Для такого массового скринирования комбинаций, по нашему мнению, планшетный формат наиболее предпочтителен в отношении расхода реагентов, времени на приготовление образцов и сам анализ. Кроме того, последующие эксперименты на клеточных культурах также проводили в 24-луночном планшете в аналогичных условиях. В этой связи, по объективным причинам мы отказались от проведения анализов на кПЦР-амплификаторе. К сожалению, увеличение флуоресцентного сигнала в ходе анализа лишь косвенно подтверждает количество дцДНК-зонда (т.е. мишени), в который были внесены двухцепочечные разрывы. Стоит упомянуть, что предлагаемая методика не может служить количественной мерой эффективности для in vitro терапии и модификации генома, она скорее позволяет проводить предварительный отбор гидовых РНК, стабилизированных химическими модификациями, на предмет стабильности и активности РНК-белкового комплекса. Для сравнительного анализа были предложены эксперименты на клеточной линии с участием тех же комбинаций гидовых РНК с тремя мутантными версиями белка Cas9. Для проведения анализа выведенная клеточная линия культивировалась в среде (Gibco - Dulbecco's Modified Eagle Medium + 10% БСА) в инкубаторе при нормальных условиях (CO2, 37ᵒC), до достижения клетками монослоя, затем клетки снимали с подложки трипсином и переносили в сосуды Эппендорфа по 100 000 клеток, которые затем инкубировали с заранее предорганизованными РНП гидовых РНК и белков Cas9 (100 пмоль +100 пмоль) в 100 мкл буфера R. Далее клетки подвергали электропорации (Neon transfection system, ThermoFisher) в специальных наконечниках (Neon tips) в стандартных для этой клеточной линии условиях, затем помещали в теплую среду (37ᵒC) без антибиотиков в 24-луночном планшете и инкубировали в течение 2х дней в CO2-инкубаторе. Затем уровень флуоресцентного сигнала соответствующих белков eGFP и mCherry определяли в планшетном сканере (Tecan). Полученные данные интенсивности флуоресценции анализировали друг относительно друга. Выживаемость клеток после электропорации определяли по стандартному МТТ-тесту и сравнивали с клетками после электропорации в отсутствие РНП комплекса – CRISPR/Cas9 и при добавлении РНП комплекса без электропорации. Для экспериментов с живыми клетками были выбраны три нуклеазы 3*NLS-SpCas9, HiFi-Cas9 и Sniper-Cas9 в комбинации с гидовыми РНК, показавшими самый сильный отклик флуоресцентного сигнала и сравнивались с немодифицированными crisprRNA/tracrRNA: eGFP crRNA-0, 1, 3 в комбинации с eGFP tracrRNA-0, 1, 2, 6.