КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-74-10102

НазваниеСвязь структуры и функции нативно-развернутых белков

РуководительБалакирева Анастасия Васильевна, Кандидат биологических наук

Прежний руководитель Саркисян Карен Сергеевич, дата замены: 06.05.2022

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2019 - 06.2022 

Конкурс№41 - Конкурс 2019 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словабелковый дизайн, эволюционная биология, ландшафт приспособленности, связь генотип-фенотип, физика белка, нативно-развернутые белки

Код ГРНТИ62.00.00, 31.23.27, 34.23.19

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Связь фенотипа и генотипа – одна из ключевых проблем для многих областей биологии, от физики белка и эволюционной биологии до биотехнологии и медицинской генетики. В последние годы стало возможным проводить высокопроизводительные скрининги, позволяющие получать данные о функциональности сотен тысяч мутантных вариантов белков в одном эксперименте. Такие скрининги производят массивы данных, важные для понимания связи структуры и функции в разных группах белков. В фундаментальных исследованиях полученные данные используются для уточнения существующих теоретических моделей связи структуры и функции в белках, а также для моделирования молекулярной эволюции белков. В белковой инженерии определение функциональности мутантных вариантов позволяет применять структурные подходы и методы машинного обучения для улучшения существующих белков (Saito et al. 2018; Pethe, Rubenstein, and Khare 2019). В настоящем проекте мы планируем сфокусироваться на важной и наименее исследованной с точки зрения связи структуры и функции группе белков – так называемых нативно-развернутых белках. Нативно-развернутые белки, как правило, не формируют единой нативной структуры, а существуют во множестве альтернативных конформаций, заселенность которых определяется внешними условиями, такими как кислотность и солевой состав среды, наличие белка-партнера и посттрансляционных модификаций. Нативно-развернутые белки осуществляют множество функций, являясь, среди прочего, узлами белок-белковых взаимодействий, структурными молекулами, ферментами. Современные анализы свидетельствуют о том, что к группе нативно-развернутых белков может относиться до 15% всех белков — значительная часть протеома, — при этом данных о связи структуры и функции таких белков крайне мало. В рамках работ по настоящему проекту мы разработаем высокопроизводительный подход для определения функциональности нативно-развернутых белков, недавно обнаруженных в тихоходках и определяющих способность этих животных переживать полное высыхание. Мы создадим библиотеку мутантов генов таких нативно-развернутых белков и определим функциональность каждого варианта при экспрессии в клетках дрожжей. На основе полученных данных мы впервые систематически проанализируем связь последовательности и функции в нативно-развернутых белках и используем полученные данные для анализа применимости существующих моделей к эволюции этой группы белков, а также исследуем возможность применения машинного обучения для предсказания функциональных нативно-развернутых белков.

Ожидаемые результаты
В результате работ по настоящему проекту будет впервые получен и проанализирован массив данных о связи структуры и функции нативно-развернутых белков. В силу исторических причин и сложности определения структуры, нативно-развернутые белки исследованы сравнительно мало, несмотря на то, что составляют значительную часть протеома и играют важную роль в самых различных биологических процессах: от прохождения сигнальных каскадов и формирования субкомпартментов в клетке за счет разделения фаз до участия в патологических процессах, таких как болезнь Паркинсона. Понимание связи того, как мутации в нативно-развернутых белках отражаются на их функции и того, до какого предела возможно накопление слабовредных мутаций в белках этой группы, важно для дальнейшего прогресса в соответствующих областях эволюционной биологии и медицинской генетики. Среди медицински значимых нативно-развернутых белков можно отметить альфа-синуклеин, белок, участвующий в формировании амилоидных бляшек, связанных с развитием болезни Паркинсона, и также обнаруженный в амилоидах, формирующихся при болезни Альцгеймера. Мутации в альфа-синуклеине связаны с ранним становлением болезни Паркинсона. Важные для развития онкологических заболеваний белки p53 и c-Myc также содержат протяженные нативно-развернутые участки. Другие нативно-развернутые белки представляют интерес для биотехнологии и сельского хозяйства, как, например, объекты настоящего исследования – белки тихоходок, позволяющие этим животным переживать полное высыхание. Обнаруженные лишь два года назад, эти белки обладают значительным биотехнологическим потенциалом, поскольку способны обеспечивать устойчивость других организмов к высыханию при гетерологической экспрессии, а также защищать ферменты от потери функциональности при высыхании и замораживании. Мы предполагаем, что нативно-развернутые белки могут функционировать и эволюционировать по законам, значительно отличающимся от существующих моделей, разработанных для “обычных” белков. Понимание этих законов позволит применять методы рационального дизайна к созданию биотехнологически важных нативно-развернутых белков и позволит прояснить механизмы развития патологических процессов, связанных с функционированием белкой этой группы.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Связь фенотипа и генотипа – одна из ключевых проблем для многих областей биологии, от физики белка и эволюционной биологии до биотехнологии и медицинской генетики. В последние годы стало возможным проводить высокопроизводительные скрининги, позволяющие получать данные о функциональности сотен тысяч мутантных вариантов белков в одном эксперименте. Такие скрининги производят массивы данных, важные для понимания связи структуры и функции в разных группах белков. В фундаментальных исследованиях полученные данные используются для уточнения существующих теоретических моделей связи структуры и функции в белках, а также для моделирования молекулярной эволюции белков. В белковой инженерии определение функциональности мутантных вариантов позволяет применять структурные подходы и методы машинного обучения для улучшения существующих белков (Saito et al. 2018; Pethe, Rubenstein, and Khare 2019). В рамках работ по настоящему проекту мы разработаем высокопроизводительный подход для определения функциональности нативно-развернутых белков, недавно обнаруженных в тихоходках и определяющих способность этих животных переживать полное высыхание. За первый год выполнения проекта мы выполнили следующие результаты: (а) получены последовательности гена 106094 и других нефункциональных нативно-развернутых белков, (б) собраны генетические конструкции, необходимые для интеграции в локус HO генома дрожжей с помощью технологии CRISPR-Cas9, (в) оптимизированы для экспрессии в дрожжах и заклонированы последовательности гена 106094 дикого типа, нефункциональных контрольных вариантов гена 106094, а также нефункциональных других нативно-развернутых белков, (г) созданы дрожжевые линии, экспрессирующие ген 106094 или контрольные нефункциональные гены с геномных копий, (д) Отработаны условия для сравнения устойчивости дрожжей к высыханию и проведены эксперименты с созданными дрожжевыми линиями для подтверждения данных литературы о функциональности гена 106094, и (е) создана библиотека мутантов гена 106094 тихоходки Hypsibius dujardini методом “ПЦР с ошибками”.

 

Публикации

1. Митюшкина Т.Ю., Мишин А.С., Гонзалез Сомермейер Л., Маркина Н.М., (полный списов авторов не регистрируется системой), Ямпольский И.В., Саркисян К.С. Plants with self-sustained luminescence Nature Biotechnology, - (год публикации - 2020) https://doi.org/https://www.biorxiv.org/content/10.1101/809376v1

2. Митюшкина Т.Ю., Мишин А.С., Гонзалез Сомермейер Л., Маркина Н.М., (полный списов авторов не регистрируется системой), Ямпольский И.В., Саркисян К.С. Plants with genetically encoded autoluminescence Nature Biotechnology, - (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41587-020-0500-9

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Связь фенотипа и генотипа – одна из ключевых проблем для многих областей биологии, от физики белка и эволюционной биологии до биотехнологии и медицинской генетики. В последние годы стало возможным проводить высокопроизводительные скрининги, позволяющие получать данные о функциональности сотен тысяч мутантных вариантов белков в одном эксперименте. Такие скрининги производят массивы данных, важные для понимания связи структуры и функции в разных группах белков. В фундаментальных исследованиях полученные данные используются для уточнения существующих теоретических моделей связи структуры и функции в белках, а также для моделирования молекулярной эволюции белков. В белковой инженерии определение функциональности мутантных вариантов позволяет применять структурные подходы и методы машинного обучения для улучшения существующих белков. В рамках работ по настоящему проекту мы разработаем высокопроизводительный подход для определения функциональности нативно-развернутых белков, недавно обнаруженных в тихоходках и определяющих способность этих животных переживать полное высыхание. За второй год выполнения проекта мы получили следующие результаты: провели секвенирование библиотек вариантов генов, создали модифицированные ДНК-вектора для доставки библиотеки генов в геном дрожжей, провели клонирование библиотеки вариантов гена гена 106094 в модифицированные вектора для доставки в геном дрожжей, создали библиотеку штаммов дрожжей, экспрессирующих разные варианты гена 106094, провели работы по воспроизведению эксперимента по сравнению устойчивости штаммов дрожжей к высыханию, получили противоречащие данным литературы результаты.

 

Публикации

1. Митюшкина Т.Ю., Мишин А.С., Гонзалез Сомермейер Л., Маркина Н.М., (полный списов авторов не регистрируется системой), Ямпольский И.В., Саркисян К.С. Plants with genetically encoded autoluminescence Nature Biotechnology, 38, 944-946 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1038/s41587-020-0500-9

2. Суреда-Вивес М., Саркисян К.С. Bioluminescence-Driven Optogenetics Life, 10(12), 318 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/life10120318

3. Саркисян К.С. Expression of intrinsically disordered proteins in heterologous hosts Biotechnology & Biotechnological Equipment, - (год публикации - 2020)

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Связь фенотипа и генотипа – одна из ключевых проблем для многих областей биологии, от физики белка и эволюционной биологии до биотехнологии и медицинской генетики. В последние годы стало возможным проводить высокопроизводительные скрининги, позволяющие получать данные о функциональности сотен тысяч мутантных вариантов белков в одном эксперименте. Такие скрининги производят массивы данных, важные для понимания связи структуры и функции в разных группах белков. В фундаментальных исследованиях полученные данные используются для уточнения существующих теоретических моделей связи структуры и функции в белках, а также для моделирования молекулярной эволюции белков. В белковой инженерии определение функциональности мутантных вариантов позволяет применять структурные подходы и методы машинного обучения для улучшения существующих белков (Saito et al. 2018; Pethe, Rubenstein, and Khare 2019). В рамках третьего года работ по проекту мы проверили эффект сверхэкспрессии белка нативно-развернутого белка 106094 тихоходок Hypsibius dujardini, а также белка семейства LEA, на толерантность клеток бактерий к засухе. Для этого был получен набор необходимых для экспрессии в бактериях векторов. Помимо этого, были протестированы гены других нативно-развернутых белков тихоходок Hypsibius dujardini, защищающих от высыхания, в клетках дрожжей. Экспрессию генов проводили как в низко-, так и в высококопийных плазмидах. Дополнительно, параллельно с экспериментами по тестированию генов в бактериях, мы создали баркодированные библиотеки случайных мутантов для ряда генов семейства LEA. Была проведена и завершена сборка специализированных бактериальных экспрессионных векторов, подходящих для удобного анализа представленности мутантных вариантов генов с помощью массированного секвенирования на приборах Illumina.

 

Публикации

1. Гонсалез Сомермейер Л., Флейс О., Мишин А.С., Божанова Н.Г., Иголкина А.А., Мейлер Д., Алабаль Пужоль М.-Э., Путинцева Е.В., Саркисян К.С., Кондрашов Ф.А. Heterogeneity of the GFP fitness landscape and data-driven protein design eLife, 11, e75842. DOI: 10.7554/eLife.75842 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.7554/eLife.75842

2. Саркисян К.С. On the role of intrinsically disordered proteins from Hypsibius dujardini in desiccation tolerance The Eurobiotech Journal, 5(3), 107 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.2478/ebtj-2021-0031

3. Саркисян К.С. Screening assay for proteins conferring desiccation tolerance FEBS Open Bio, 11(Suppl.1), 294-295 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/2211-5463.13205

Возможность практического использования результатов
не указано