Аннотация результатов, полученных в 2019 году
С целью изучения закономерностей изменений в архитектуре генома при дифференцировке клеток методом захвата конформации хроматина (Hi-C in situ) впервые получены полногеномные ДНК-библиотеки для эритроидных клеток-предшественниц домашней курицы. Секвенирование Hi-C библиотек клеток линии HD3 домашней курицы на базе «Центра коллективного пользования в области геномики» (ОИ) позволило сгенерировать 208 и 211 миллионов парных прочтений (ридов) для двух биологических реплик. В обеих репликах число цис-контактов превышало число транс-контактов, что сопоставимо с полученными нами ранее результатами (Fishman et al., 2019) и соответствует высокому качеству Hi-C библиотек. Показано, что также как и в эмбриональных фибробластах, в эритроидных клетках-предшественницах домашней курицы на уровне всего генома образуются топологически ассоциированные домены хроматина (ТАД) и А/В компартменты. С помощью биоинформатического анализа предварительно построенных карт Hi-C-контактов эритроидных клеток-предшественниц и эмбриональных фибробластов курицы проведен выбор районов для получения двух типов ДНК-зондов (на основе ВАС-клонов и олигонуклеотидных пэйнтов) к топологически-ассоциированным доменам хроматина. Оптимизирован протокол получения флуоресцентно меченых ДНК-зондов к ТАД на основе ВАС-клонов, содержащих фрагменты геномной ДНК курицы, для последующей 3D-FISH. При проведении 3D-FISH на соматических клетках курицы специфичные сигналы от ДНК-зондов к ТАД в интерфазных ядрах были получены только в случае гибридизации зондов, меченных методом ник-трансляции, но не методом ПЦР с вырожденными праймерами. Методом ник-трансляции получены ДНК-зонды к нескольким парам/тройкам соседних ТАД курицы, которые будут использованы для изучения закономерностей конденсации хроматина при эритроидной дифференцировке клеток. Полученные результаты представлены в виде устных докладов на трех международных конференциях (26th Wilhelm Bernhard´s Workshop, 12th European cytogenomics conference, VII съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров). По итогам работы подготовлена статья, которая с минимальными исправлениями принята к печати в журнале Frontiers in Genetics.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
С помощью трехцветной 3D-FISH с последующей конфокальной лазерной сканирующей микроскопией охарактеризованы закономерности изменения архитектуры нанодоменов хроматина на фоне исчезновения классических топологически ассоциированных доменов (ТАД) при дифференцировке эритробластов курицы в сторону зрелых эритроцитов. Проведено измерение 3D расстояний и степени колокализации между геномными локусами, линейно равноудаленными в геноме и расположенными в одном или соседних ТАД. Мы показали, что хроматин в ядрах эритроцитов обладает нетипичными закономерностями локальной компактизации, которые, по-видимому, не связаны с формированием характерных для ядер других соматических клеток петлевых доменов и ТАД. Полученные результаты также свидетельствуют о наличии в зрелых эритроцитах дистантных взаимодействий геномных локусов через границы консервативных ТАД, выявленных в других типах клеток. В то же время, в недифференцированных клетках-предшественниках эритроцитов, участки генома, относящиеся к одному ТАД, обнаруживаются ближе друг к другу и колокализуются чаще, чем участки генома, относящиеся к соседним ТАД. Эти данные подтверждают наличие в ядрах эртиробластов топологически ассоциированных доменов хроматина, идентифицированных с помощью метода HiC в первый год выполнения проекта. В отчетный период мы также провели картирование районов консервативных ТАД, выявленных в интерфазных ядрах соматических клеток, на хромосомах из ядер растущих ооцитов. Картирование равноудаленных участков генома, находящихся в соседних ТАД, выявило разнообразие паттернов их локализации в хромомерно-петлевых комплексах. Участки соседних ТАД могут выявляться в составе одного хромомера, в то же время участки, принадлежащие одному ТАД, могут выявляться в составе двух соседних хромомеров. Для изучения роли гистона H5 в установлении специализированной трехмерной архитектуры генома в клетках эритроидного ряда была поставлена задача получения клеток домашней курицы линии HD3 с ауксин-зависимой деградацией гистона H5. В отчетный период созданы конструкции для модификации гена гистона Н5 при помощи системы CRISPR/Cas9. Подготовленные конструкции включают в себя векторы для эндогенной встройки дегроновых тагов mAID или miniIAA7 на 3’-конец гена H5, плазмиды с gРНК на 3’-конец гена, а также плазмиды, экспресcирующие OsTIR1 или AtAFB2. В работе был успешно реализован метод биаллельной модификации эндогенных локусов гена гистона H5 с добавлением AID-домена, основанный на двойной селекции Neo/Hygro. Были получены клоны клеток линии HD3, которые по результатам генотипирования (1) показали наличие вставки модифицированного гена Н5 на 5’- и 3′-конце, (2) не содержали гена гистона Н5 дикого типа ни в одном из аллелей и (3) показали наличие полноразмерной встройки всей конструкции. Такие клоны будут в дальнейшем трансфецированы вектором, кодирующим OsTIR1, и использованы для изучения влияния деградации гистона Н5 на трехмерную архитектуру генома в клетках эритроидного ряда методами HiC и визуализации нанодоменов хроматина. Полученные результаты представлены на двух научных мероприятиях (V Международная конференция «Epigenetics & Chromatin», VII Молодежная Школа-конференция по молекулярной и клеточной биологии). По итогам работы опубликовано две экспериментальных статьи в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science Core Collection и Scopus, в том числе одна статья в журнале, входящем в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Впервые с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии проведен анализ пространственной реорганизации А/В-компартментов хроматина на фоне исчезновения классических топологически ассоциированных доменов при дифференцировке эритробластов курицы в зрелые эритроциты. С помощью 3D-FISH с зондами к А/В компартментам впервые охарактеризована пространственная организация (радиальное положение, форма, занимаемый объем, дискретность субдоменов, степень компактизации) районов с несколькими последовательными А и В компартментами, в том числе компартментами, которые изменяют свой статус (А->В или В->А) при дифференцировке клеток. Обнаружены статистически значимые различия суммарной площади и объема, занимаемых отдельными компартментами, связанные как со статусом компартмента (A, B или А/B), так и с типом клеток. Так, например, район, содержащий ген эритроцит-специфичного гистона H5 и имеющий статус А-компартмента в эритробластах и зрелых эритроцитах, характеризовался более «рыхлой» и открытой структурой хроматина в эритробластах по сравнению с эмбриональными фибробластами. В зрелых эритроцитах районы конститутивных А и В компартментов занимали значимо меньшую область ядра по сравнению с эритробластами, что, по всей видимости, связано с в целом высокой степенью компактизации хроматина. Несмотря на высокий уровень экспрессии определенных генов в зрелых эритроцитах (например, генов α-глобинового кластера) не было выявлено различий формы сигнала между отдельными районами А и В компартментов. Подобраны условия визуализации доменов хроматина с помощью сверхразрешающей оптической микроскопии STED с использованием специализированных флуорохромов. С помощью 2D-FISH впервые проведено картирование районов соматических А/В компартментов на мейотических хромосомах типа ламповых щеток курицы. Сопоставление районов интерфазных А/В компартментов и хромомерно-петлевых комплексов показало, что кластеры плотных DAPI-позитивных хромомеров с короткими латеральными петлями соответствуют районам B-компартментов соматических клеток. Впервые показана транскрипция 13 белок-кодирующих генов и 2 генов некодирующей РНК на латеральных петлях хромосом типа ламповых щеток курицы. Представленные результаты свидетельствуют о возможности применения гигантских хромосом типа ламповых щеток птиц для детального анализа доменов хроматина у позвоночных в контексте их транскрипционной активности. На основе Hi-C карт контактов хроматина детально охарактеризованы внутри- и межхромосомные перестройки в клетках линии HD3 эритробластов курицы. Выявленные межхромосомные перестройки верифицированы с помощью FISH на метафазных хромосомах с зондами к длинному и короткому плечам GGA4, к центромерным районам, к тандемным повторам CNM, PO41 и TTAGGG. Наиболее перестроенной оказалась хромосома GGA4, перестройки также затрагивали некоторые микрохромосомы. На базе «Центра коллективного пользования в области геномики» (ОИ) проведено секвенирование ChIP-библиотек с последующим биоинформатическим полногеномным анализом распределения сайтов взаимодействия гистона Н5 с хроматином в клетках эритроидного ряда. В зрелых эритроцитах обнаружено обеднение сайтами взаимодействия с гистоном Н5 в районах активно транскрибируемых генов. Полученные результаты представлены на трех международных научных конференциях (EMBL Conference: Chromatin and Epigenetics, 23rd International Chromosome Conference and the 24th International Colloquium in Animal Cytogenetics and Genomics, 13th European Cytogenomics Conference), в том числе в виде двух устных докладов. По итогам работы опубликована статья в журнале ‘Frontiers in Cell and Developmental Biology’, индексируемом в базах данных Web of Science Core Collection и Scopus и входящем в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору. Кроме того, в BioRxiv опубликован препринт экспериментальной статьи, посвященной верификации соматических топологически ассоциированных доменов хроматина (ТАД) в эмбриональных фибрабластах курицы с помощью 3D-FISH и сопоставлению интерфазных ТАД и хромомерно-петлевых комплексов мейотических хромосом типа ламповых щеток курицы.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках выполнения проекта мы продолжили изучение трехмерной организации хроматина в районах генома, идентифицированных нами ранее как А- и B-компартменты в клетках эритроидного ряда и эмбриональных фибробластах курицы. С этой целью был использован метод 3D-FISH с зондами на основе BAC-клонов и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с высокой разрешающей способностью. Для всех проанализированных районов в клетках эмбриональных фибробластов и эритробластов курицы расстояние между зондами на основе BAC-клонов в конститутивных А-компартментах было больше, чем в конститутивных B-компартментах. В ядрах эритроцитов курицы не было выявлено различий в степени компактизации конститутивных А- и В-компартментов, что связано с особой упаковкой хроматина в зрелых эритроцитах. В отчетный период мы также картировали ряд районов, принадлежащих к А-, В- или переходным компартментам хроматина в ядрах клеток эмбриональных фибробластов курицы, на мейотических хромосомах типа ламповых щеток с помощью 2D-FISH. Рисунок гибридизации зондов на основе BAC-клонов подтвердил наше наблюдение о преимущественном соответствии соматических А-компартментов небольшим рыхлым хромомерам с более длинными латеральными петлями в хроматине хромосом типа ламповых щеток, а В-компартментов – крупным плотным хромомерам с более короткими латеральными петлями. Наиболее яркой характеристикой хромосом типа ламповых щеток является гипертранскрипция тысяч геномных локусов, расположенных в латеральных петлях хромосом. Однако для хромосом типа ламповых щеток курицы до настоящего времени не был установлен полногеномный профиль транскрибируемых на латеральных петлях последовательностей. Поэтому в заключительный год выполнения проекта мы сосредоточились на расшифровке транскриптома ядер и цитоплазмы ооцитов домашней курицы. Всего в цитоплазме ооцита обнаружены зрелые мРНК и длинные некодирующие РНК, состоящие из сплайсированных экзонов более 14800 генов. В ядре ооцита обнаружены как полноразмерные транскрипты, так и интронные последовательности тех же генов. С помощью РНК-FISH мы подтвердили транскрипцию 42 белок-кодирующих генов и 8 генов длинных некодирующих РНК на латеральных петлях хромосом типа ламповых щеток. Мы пришли к выводу, что цитоплазматические и ядерные РНК в ооците происходят из вновь синтезируемых транскриптов на латеральных петлях хромосом типа ламповых щеток. С помощью секвенирования библиотек малых РНК мы также охарактеризовали ядерные и цитоплазматические малые некодирующие РНК домашнего хозяйства и короткие регуляторные РНК, включающие более 150 miРНК. Таким образом, в ооците домашней курицы гипертранскрипция на латеральных петлях гигантских хромосом типа ламповых щеток является основным механизмом синтеза огромного количества материнской РНК для нескольких тысяч генов, что определяет биологическое значение преобразования хромосом в оогенезе в форму хромосом типа ламповых щеток и широкое распространение этого явления среди позвоночных (амфибии, рыбы, рептилии, птицы, некоторые насекомые и однопроходные). Мы предполагаем, что формирование латеральных петель хромосом типа ламповых щеток с РНП-матриксом, состоящим из вновь синтезируемых транскриптов и взаимодействующих с ними РНК-связывающих комплексов, приводит увеличению расстояния между плотными транскрипционно неактивными хроматиновыми доменами, что способствует их изоляции и формированию хромомеров. По итогам работы опубликованы статья в журнале “Chromosoma” (Q1, IF = 4.316), методическая глава в книге (издательство CRC Press, Taylor & Francis Group), подготовлена рукопись статьи, которая находится на этапе рецензирования и опубликована в виде препринта. Результаты исследования представлены в виде трех устных и трех стендовых докладов, в том числе на международных конференциях "13th International Multiconference BGRS/SB-2022" и "Genome Organization & Nuclear Function".