Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В работе, выполненной за прошедший год в рамках проекта РНФ «Исследование компенсаторного фагоцитарного ответа на условнопатогенный гриб Aspergillus fumigatus в слизистой главного бронха мышей с индуцированной нейтропенией» была проведена идентификация CD11b+ фагоцитов в слизистой оболочке главного бронха иммунокомпетентных мышей и мышей с индуцированной нейтропенией. Количественный анализ CD11b+ фагоцитов был проведен при помощи иммуногистохимического окрашивания тотального препарата главного бронха и флуоресцентной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Подобный подход позволил провести оценку пространственного расположения фагоцитов и проследить взаимодействия между клетками иммунной системы и патогеном – спорами гриба Aspergillus fumigatus, в различные интервалы времени после орофарингеального введения патогена. В работе использовали микроскоп Zeiss LSM 780 с единым детектором и возможностью проводить разделение спектров большого набора флуорохромов, что позволило провести единовременную визуализацию CD11b+ фагоцитов, спор гриба A. fumigatus, эпителия дыхательных путей и гладкой мускулатуры, а также MHCII+ антигенпредставляющих клеток, включая CD11c+ дендритные клетки. Показали, что в процессе формирования иммунного ответа на споры гриба, CD11b+ фагоциты мигрируют из подслизистого слоя, где они накапливаются на начальных стадиях воспаления, в стенку главного бронха, а затем некоторые из них осуществляют трансэпителиальную миграцию в просвет дыхательного пути, где интернализуют споры гриба. В данной работе было показано, что в процессе миграции через стенку главного бронха фагоциты образуют кластеры, что, как известно из литературы, может приводить к разрушению коллагеновых волокон структурных тканей и неконтролируемому воспалению. Однако, используемая в данном исследовании модель воспаления характеризуется разрешением воспалительного процесса. Было показано, что контакты интраэпителиальных дендритных клеток с отдельными CD11b+ фагоцитами и их кластерами необходимы для гомеостатической регуляции воспалительного процесса в слизистой оболочке дыхательных путей. Проведенный в рамках данной работы анализ фагоцитарной активности показал, что несмотря на то, что СD11c+ и MHCII+ клетки участвовали в захвате спор гриба, интернализация конидий происходила осуществлялась преимущественно CD11b+ фагоцитами. В ряде случаев наблюдали CD11c+CD11b+ клетки, однако, их фагоцитарная активность была ниже, чем у CD11b+CD11c- фагоцитов. Нами также была проведена оценка экспрессии CD11b различными популяциями иммунных клеток слизистой оболочки главного бронха. Показали, что преимущественно CD11b+ фагоциты представлены Ly6G+ нейтрофилами. В редких случаях встречаются CD11c+CD11b+ клетки, для которых характерен низкий уровень экспрессии CD11b. Кроме того, нами был обнаружен небольшой процент CD11b+CD11c−Ly6G− клеток с высоким уровнем экспрессии CD11b. Эти клетки по морфологическим признакам относились к моноцитам. Было сделано предположение о возможной принадлежности этих клеток к NK клеткам, что планируется исследовать в будущем. Вышеописанные результаты вошли в публикацию в журнале Frontiers in Immunology (https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00298/full). Так как целью данного исследования был анализ фагоцитарного ответа в условиях индуцированной нейтропении, мы использовали модель инвазивного аспергиллеза, включающую инъекцию антител деплеции против антигена Gr-1, экспрессия которого характерна преимущественно для нейтрофилов, и последующее введение спор гриба A. fumigatus. Как и ожидалось, у мышей с индуцированной нейтропенией количество CD11b+ фагоцитов в слизистой оболочке главного бронха было достоверно ниже, чем у иммунокомпетентных мышей, как в острой фазе, так и через 48 часов после введения спор гриба. Исследование популяционного состава CD11b+ фагоцитов при индуцированной нейтропении выявило, что преимущественно они были представлены остаточными Ly6G+ нейтрофилами. В отличие от иммунокомпетентных мышей, CD11b+ фагоциты мышей с нейтропенией не выходили в просвет дыхательных путей на поздних стадиях воспаления, а были локализованы в стенке дыхательных путей. Также в стенке главного бронха были обнаружены CD11c+ дендритные клетки с низкой экспрессией CD11b. Фагоцитарная активность CD11b+ фагоцитов в условиях индуцированной нейтропении достоверно снижалась, по сравнению этим показателем у иммунокомпетентных мышей, что частично компенсировали CD11c+ дендритные клетки. Однако достоверных различий в фагоцитарной активности дендритных клеток слизистой оболочки главного бронха в случае нейтропении и у иммунокомпетентных мышей обнаружено не было. В данном исследовании также были проведены эксперименты, направленные на выявление влияния нейтропении на хемотактическую и фагоцитарную активность нейтрофилов на системном уровне. Эта серия экспериментов была проведена in vitro с использованием нейтрофилов, выделенных из костного мозга мышей. Однако, каких-либо морфологических или функциональных особенностей, отличающих нейтрофилы костного мозга мышей с индуцированной нейтропенией от нейтрофилов иммунокомпетентных мышей обнаружено не было. Полученные данные заставляют задуматься о механизмах индукции нейтропении, вызванной антителами деплеции, и запланировать на следующий год работы в рамках проекта серию экспериментов, направленных на детальные исследования влияния антител деплеции на миграцию нейтрофилов в сосудах и тканях легких.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В этом отчетном периоде нам удалось ответить на вопрос о различиях в анатомической локализации спор гриба Aspergillus fumigatus в респираторном тракте в присутствии нейтрофилов и в условиях нейтропении, а также понять какие иммунные клетки способны интернализовать споры в отсутствии нейтрофилов. Для того, чтобы ответить на первый вопрос пришлось освоить технику оптического просветления тотального препарата легкого, подобрать условия для окрашивания и дальнейшего получения трехмерных изображений образца с разрешением достаточным для визуализации спор размером 3 мкм. Разработанный подход позволили нам провести оценку доли конидий в бронхиальном дереве и в альвеолярном пространстве. Сравнив образцы оптически просветленных легких мышей с индуцированной нейтропенией с образцами иммунокомпетентных мышей, мы обнаружили, что у мышей с нейтропенией доля конидий в бронхах была достоверно выше, чем у иммунокомпетентных мышей. Полученные данные были опубликованы в Biophysical Journal (https://doi.org/10.1016/j.bpj.2020.11.1707). Так как именно в бронхах доля конидий у мышей с нейтропенией была выше, поиск потенциальных фагоцитов, способных интернализовать конидии в отсутствии нейтрофилов, провели с использованием тотального препарата главного бронха. В слизистой главного бронха и подслизистом слое мышей с нейтропенией были идентифицированы антигенпрепзентирующий клетки, среди которых B лимфоциты, резидентные тканевые макрофаги и дендритные клетки и минорные популяции иных потенциальных фагоцитов, среди которых NK клетки, остаточные нейтрофилы и эозинофилы. Существенную роль в поглощении спор гриба в отсутствии нейтрофилов играли дендритные клетки. Если у иммунокомпетентных мышей интернализующие споры гриба клетки были преимущественно нейтрофилы, то у мышей с нейтропенией снижался не только процент нейтрофилов в слизистой главного бронха, но и процент спор, интернализованных нейтрофилами. При этом доля спор, поглощенных CD11c+ дендритными клетками был достоверно выше у мышей с нейтропенией. Среди CD11c+ дендритных клеток, была обнаружена субпопуляция, для которой была характерна экспрессия CD169. Эти клетки выходили в просвет дыхательных путей и интернализовывали споры гриба.