Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведен первый этап работ, связанный с созданием новой генетической тест-системы для выявления мутаций (однонуклеотидных замен, делеций, инсерций, инверсий), которые могут быть причинами или маркерами заболеваний, резистентности к заболеванию или к терапии, а также влиять на выраженность хозяйственно-значимых признаков у сельскохозяйственных животных. Отобраны гены-кандидаты для крупного рогатого скота, связанные со скороспелостью, удойностью, жирномолочностью, устойчивостью к заболеваниям и т. д. Разрабатываемый инновационный продукт относится к области геномной селекции, ветеринарии, клинической диагностики доместицированных видов животных. На данном этапе проведен анализ литературных и геномных баз данных для составления списка маркеров, представляющих интерес с точки зрения хозяйственной значимости признаков крупного рогатого скота. Выбраны 210 двухаллельных SNP, рассредоточенных в 72 генах. Для них разработаны аллельспецифичные праймеры, а также 420 олигонуклеотидных последовательностей, выровненных по характеристикам, для иммобилизации их на разрабатываемой генетической тест-системе. С помощью новой генетической тест системы генотипирована выборка в 50 образцов ДНК коров костромской породы. Кроме того, был проведен сравнительный анализ 14 пород крупного рогатого скота (Bos taurus) европейского и азиатского происхождения путем исследования микросателлитной ДНК. Основным преимуществом данной работы служило изучение очень редких пород: алтайского, бурятского и серого украинского скота. С целью определения эволюционного происхождения пород и специфики их генофонда была проведена оценка внутри- и межпопуляционного генетического разнообразия и взаимосвязи популяций. Анализ проводился с использованием панели, включающей 14 микросателлитов с высокой вариабельностью. У 1168 генотипированных животных были обнаружены 17 (из 209) уникальных аллелей (специфических аллелей, обнаруженных в породах определенного происхождения), которые могут служить эффективным инструментом для генетической идентификации экотипов / пород крупного рогатого скота европейского и азиатского происхождения. В работе показан высокий уровень межпопуляционной дифференциации между европейским и азиатским скотом. В 2019 году проведены исследования 1256 голов двадцати трех популяций тувинской короткожирнохвостой породы овец по 11 STR-маркерам; выполнено формирование базы данных STR-вариабельности овец. Создан банк ДНК монгольской и тувинской популяций коз, а также овец тувинской породы Впервые дана характеристика генофонда коз тувинской и монгольской пород по локусам микросателлитов, а также получены данные о генофонде овец тувинской короткожирнохвостой породы овец на всем ареале ее распространения. Новизна проведенных исследований заключается в том, что впервые проведено масштабное генотипирование популяций тувинских овец, с помощью STR-маркеров, что позволит в дальнейшем провести ряд исследований ее генетической структуры, филогении, разнообразия, обосновать программу сохранения и разведения.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Разработаны новый метод генотипирования и технология производства и процессинга микрочипов. Сделан дизайн праймеров для модифицированной технологии. Отработаны параметры иммобилизации праймеров на подложках из пластика и проведения твердофазного ПЦР с модифицированными праймерами. Проведен заключительный этап отбора генов-кандидатов молочной продуктивности крупного рогатого скота посредством комплексного анализа с использованием баз данных KEGG, STRING, NCBI, UniProt и Ensembl, а также геномного браузера UCSC Genome Browser. Таким образом, список пополнился новыми генами, которые кодируют регуляторные элементы генома, ответственные за регуляцию процессов лактогенеза, галактопоэза и инволюции. Для лучшей визуализации отобранных генов была построена схема, представленная на рисунке 1. Гены-кандидаты молочной продуктивности. Выбраны эффективные алгоритмы и методы для обработки данных. Для алгоритмов оценки племенной ценности был проведен сравнительный анализ на тестовых данных, в ходе которого метод Bayes A, реализованный с помощью библиотеки ‘bWGR’, показал наилучшие результаты. Разработан прототип отечественного программного обеспечения для селекции молочного скота. В программное обеспечение были добавлены новые возможности: подбор оптимальной модели кривой лактации и прогнозирования по этим кривым лактациям характеристик молочной производительности; оценка племенной ценности особей на основании данных о генотипах, с учетом родословной и ковариат. Впервые на основе полиморфизмов гипервариабельной области D-петли и гена SRY проведено сравнительное исследование гаплотипического и нуклеотидного разнообразия, генетической дифференциации и филогении тувинских шерстных и монгольских пуховых коз. Проведен внутрипородный, межпопуляционный анализ в том числе, в сравнении с референсными последовательностями коз иных пород. На основании анализа AMOVA (популяции были разделены на две группы по породам – монгольскую и тувинскую) было выявлено, что основной вклад в генетическое разнообразие исследуемых пород вносит внутрипопуляционное разнообразие (98.84%) и около 1% относится к межгруппным отличиям. Построение TCS-сети в программе PopART позволило визуализировать филогенетические отношения среди исследуемых выборок. Высокий уровень разнообразия и большое число гаплотипов отражается в отсутствии сформированных породо-специфичных кластеров сети – у монгольской и тувинской пород встречаются различные гаплотипы, а популяции отличаются лишь частотами их встречаемости (рис. 2). Рис. 2. TCS-cеть, отображающая генетические взаимоотношения между гаплогруппами мтДНК коз (Capra hircus). Размер круга соответствует числу входящих в него образцов, обозначения цветов указаны в таблице рядом с рисунком, расшифровка сокращений в таблице 1. В качестве внешней группы использована последовательность мтДНК коровы (Bos taurus). Число прерывистых полос на линиях отражают число мутаций между двумя гаплотипами. С использованием 14 микросателлитных маркеров исследовано генетическое разнообразие, родственные связи и дрейф генов 3 пород и 7 популяций шерстных (пуховых) коз Центральной и Средней Азии. Полученные данные свидетельствуют о существовании корреляции генетических отношений между рассматриваемыми популяциями и породами пуховых коз и их географическим распределением. Фактически монгольские популяции коз до сих не дифференцированы до уровня пород и имеют генетическую структуру, свойственную для не полностью одомашненных животных. Данный факт является как следствием ведения традиционного животноводства, так и очень короткой во времени истории селекции. Выполнено полногеномное генотипирование 200 голов коз России и Монголии с использованием Caprine SNP50 BeadChip, по результатам которого с эффективностью более 90% определены генотипы 185 животных. По результатам контроля качества для анализа было отобрано 45 665 SNP маркеров. На их основе дана оценка генетического разнообразия и структуры пород коз, установлены филогенетические связи между изучаемыми породами, в том числе в аспекте мирового генофонда пород коз. На основании полученных полногеномных SNP-генотипов проведены популяционно-генетические и филогенетические исследования, по результатам которых определены генетические дистанции между популяциями и дана характеристика генетической структуры изучаемых популяций.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
КРС. Создан прототип тест-системы для генотипирования по маркерам продуктивности, определения чистопородности, происхождения, моногенных заболеваний крупного рогатого скота в формате ДНК-микрочипа. Разработан метод иммобилизации олигонуклеотидов на полимерную основу, фиксации их при помощи ультрафиолетового облучения и гибридизации на него ДНК с последующим мечением и проявлением генотипов. Типирование генов, кодирующих казеины молока: CSN3 – ген каппа-казеина и CSN2 – ген бета-казеина крупного рогатого скота с помощью реал-тайм ПЦР и созданного ДНК-микрочипа показали идентичные результаты. Показаны потенциальные возможности использования технологии ДНК микрочипов, ее принцип и возможности применения в животноводстве для генетико-селекционной работы: мониторинга, определения генетического потенциала и разнообразия, происхождения, чистопородности породах и популяциях крупного рогатого скота, агробиоразнообразия в целом. Создан лабораторный протокол для производства и обработки прототипа ДНК-чипа для исследования пород крупного рогатого скота с последующей математической обработкой результатов. Разработан дизайн более 400 аллель-специфичных праймеров для анализа молекулярных маркеров, ассоциированных с хозяйственно-значимыми признаками крупного рогатого скота. Параллельно разработан дизайн олигонуклеотидных последовательностей, выровненных по длине и температуре плавления, не встречающихся со 100% гомологией в геномах млекопитающих для иммобилизации их на микрочипе. Этого достаточно для создания микрочипа на 200 диаллельных молекулярных маркеров. Эти последовательности были разработаны при отработке технологии ДНК-микрочипа первого типа. Кроме того, в список признаков были включены молекулярные маркеры, позволяющие идентифицировать животных (так называемый генетический паспорт). Весь список отобранных признаков составляет на настоящее время 330 маркеров, представленных 81 геном (34 гена ассоциированы с молочной продуктивностью [211 маркеров] и 47 генов с моногенными заболеваниями [119 маркеров]). Создана научная база для производства полноразмерных микрочипов, предназначенных для генотипирования сельскохозяйственных животных. Создана система хранения данных генотипирования и фенотипов особей на основе Google Spreadsheet. Написан API для CRUD операций с данными, а также описан формат хранения для последующего использования данных в алгоритмах анализа. Проведено исследование алгоритмов машинного обучения, в особенности алгоритмов для работы с малыми выборками животных, для поиска корреляций между генотипами и данными фенотипов. Предложен графический интерфейс для удобного представления данных генотипирования, полученных при помощи разрабатываемой ДНК-тест системы, генеалогии и фенотипов. Разработан алгоритм, рассчитывающий вероятности аутосомно-рецессивного наследования моногенных заболеваний (имеющих менделевское расщепление) потомками конкретных родительских пар. Предложенная модель позволяет составлять ранжированные списки пар «бык-корова» по совокупной вероятности наследования телятами моногенных заболеваний и летальных гаплотипов. Это дает возможность минимизировать риски рождения больного потомства и выдавать конкретные рекомендации при отборе животных в племенной ядро. Учет наследования моногенных заболеваний наряду с продуктивностью, происхождением, фертильностью и общим состоянием здоровья позволит значительно повысить эффективность работы хозяйства и свести к минимуму финансовые затраты. Произведена реконструкция филогенетического древа популяций (пород) КРС в мире методом neighbor-joining с помощью пакета poppr среды. Матрицы генетических расстояний (Dch, Da, Ds, Fst, Dm, Dr, Cp, X2) рассчитывались с помощью пакетов Hierfstat и PopGenReport среды R. С помощью пакета poppr среды R (bootstrap 1000), а также программ Trex-online и DendroUPGMA были реализованы подходы NJ и UPGMA. Визуализация дерева была выполнена с помощью инструментов приложения ITOL. Показаны филогенетические связи между породами крупного рогатого в мире. Впервые на основе STR- и полногеномного SNP-генотипирования (анализ 108432 до, и 62809 SNP после LD-фильтрации) проведены популяционно-генетические и филогенетические исследования тагильской породы крупного рогатого скота. Дана оценка популяционной структуры и генетических особенностей современной тагильской породы крупного рогатого скота (КРС) в сравнении с голштинским черно-пестрым скотом. Впервые, с использованием полногеномного набора SNP-маркеров (ДНК-чип высокой плотности Bovine GGP HD 150K BeadChip) получена геномная характеристика коров тагильской породы и создана база SNP-генотипов, отвечающая установленным критериям качества. Идентифицированы участки генома, подвергшиеся действию искусственного отбора в процессе формирования тагильской породы КРС. После фильтрации SNP обнаружены геномные области уникальные для тагильского скота. Впервые с использованием микросателлитных маркеров получены данные о генетической структуре, уровнях изменчивости и степени дифференциации одной из старейших аборигенных пород овец на территории нашей страны – тувинской грубошерстной короткожирнохвостой. Всего было проанализировано 23 популяции (1110 голов) тувинской грубошерстной короткожирнохвостой овцы 9 административных районов (кожуунов) Республики Тыва. Проведенный по STR-маркерам молекулярно-генетический анализ выявил наличие двух групп тувинских овец, которые объединяют животных горного и степного типов, а также множество промежуточных популяций, в большей или меньшей степени тяготеющих к тому или иному типу. В результате проведенных исследований на базе ФИЦ ВИЖ им. Л.К. Эрнста было установлено, что число аллелей в расчете на локус микросателлитов в проанализированных популяциях овец варьировало от 8.364±0.607 до 11.727±0.875, аллельное разнообразие – от 7.502±0.541 до 10.114±0.702. При этом во всех исследованных популяциях был выявлен достоверный дефицит гетерозигот (родственное спаривание) – от 15.3% в группе животных Sukpak, до 35.6% в популяции Beldir. Межпопуляционные различия в группе тувинских овец «степного типа» (FST=0.013–0.153, Jost’s D=0.029–0,461) оказались бóльшими, чем в группе «горного типа» (FST=0.01–0.071, Jost’s D=0.029–0.247). Установлено несоответствие между распределением отдельных исследованных популяций тувинских овец разных типов и зональной принадлежностью административных районов Тувы. В частности, животные одного и того же района: популяции Mongush и Irtysh (Кызылский кожуун) (FST=0.051, Jost’s D=0.148), Dag-Uzu и Bai-Tal (Дзун-Хемчикский кожуун) (FST=0.059, Jost’sD=0.177), Malchyn и Mogen-Buren (Могун-Тайгинский кожуун) (FST=0.079, Jost’s D=0.297) попадают в разные кластеры. Обнаруженное расхождение объясняется особенностями формирования современных типов тувинской грубошерстной овцы, среди которых определяющими факторами являются природно-климатические условия, уровень обеспечения питательными веществами, круглогодовое пастбищное содержание, топография местности и направление селекции. Впервые проведён полногеномный анализ SNP аборигенных популяций российско-монгольских пород коз. История козоводства в регионе их обитания насчитывает более пяти тысяч лет, на всем протяжении которых козы имели высокое культурное и экономическое значение в жизни населения. По всей видимости, это определило успешную эволюционную адаптацию данных локальных пород к суровым условиям обитания. В ХХ веке благодаря относительной гео-политической автономности местные породы коз не подвергались поглотительному скрещиванию, получившему распространение во второй половине ХХ века, что помогало избежать размытия консолидированных породных характеристик. Генетические ресурсы адаптивности и хозяйственно-полезных признаков исследованных локальных пород представляют высокую ценность для развития сельского хозяйства России и мирового козоводства, а также для фундаментальной биологии и этнографии. Исследование выявило существенные риски размытия аллельных сочетаний, которые определяют характеристики пород, а также инбридинга, что может привести к дестабилизации адаптивных характеристик. Эти риски, однако, выражены в разной степени для различных пород, а также в субпопуляциях в пределах отдельных пород. Для некоторых популяций результаты исследования, при их рассмотрении в историко-экономическом контексте, позволили выявить вероятную природу генетических рисков, что может в обозримом будущем предотвратить утрату ценных породных качеств, становление которых осуществлялось на протяжении нескольких тысяч лет в процессе естественного и искусственного отбора. Полученные данные о происхождении пород имеют важное фундаментальное значение для этнографии, а также для фундаментальной генетики, поскольку свидетельствуют о существовании механизмов, стабилизирующих специфичные для пород сочетания аллелей при передаче дочерним породам и синтетическим популяциям. Дальнейшее изучение этих механизмов поможет найти способы сохранения адаптивных качеств локальных пород при их «улучшении» с помощью продуктивных животных, которое может быть неизбежно и необходимо для генетико-селекционных систем сохранения и управления этими породами, связанных с ними экономик, культурных традиций и малых этнических групп.