Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Глиомы - злокачественные опухоли мозга с высоким показателем общей смертности, для борьбы с которыми не разработаны эффективные методы лечения. Маркерные мутации в генах IDH1 и TP53 очень часто встречаются в глиомах низкой и средней степени злокачественности и влияют на прогноз по 5-летней выживаемости пациентов. Понимание измененных молекулярных путей в глиомах с точечными мутациями в генах IDH1 и TP53 может пролить свет на возможные подходы для персонифицированного лечения на основе мутационного профиля пациента. В ходе первого года выполнения данного проекта на базе Школы биомедицины Дальневосточного федерального университета (ДВФУ) был создан биобанк охарактеризованных первичных клеточных культур и замороженных образцов глиом в рамках сотрудничества с Медицинским центром ДВФУ, проводящим на постоянной основе высокотехнологичные нейрохирургические операции. Реализуемый проект предполагает выявление взаимосвязей между специфическим генотипом глиом и механизмами канцерогенеза, включающими функционирование популяций опухолевых стволовых клеток и их потомков, приобретение отдельными субпопуляциями характерных фенотипов и свойств, ответственных за пролиферацию, миграцию и инвазию клеток глиом, гетерогенность которых обеспечивает высокий уровень пластичности и резистентности опухолей. Для формирования экспериментального задела по изучению на следующих этапах проекта взаимосвязи специфических молекулярных профилей клеток глиом с наномеханическими свойствами клеток и внеклеточного матрикса впервые был разработан метод прижизненного картирования с помощью атомно-силовой микроскопии морфологии и вязкоупругих свойств тканей на переживающих срезах мозга. Разработанный метод, во-первых, включает оригинальный протокол получения переживающий высококачественных срезов нормальных и опухолевых тканей мозга, заключенных в поддерживающий биополимерный матрикс с подобранными модулями жесткости и упругости и специфический режим настройки вибратома. Во-вторых, для проведения исследований свойств клеток и матрикса, ненарушенных процедурами химической фиксации тканей, были разработаны два способа модификации зондов для атомно-силовой микроскопии, которые позволили предотвратить чрезмерное заглубление зонда в мягкую поверхность биоматериала и обеспечили проведение эффективного наномеханического картирования опухолевых образцов в сочетании с исследованием клеток с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Было проведено генотипирование, определяющее субтипы глиом: IDH1 R132H, IDH2 R172K, TP53 hot spot (R175H, R248Q/W, R273H), BRAF V600E, EGFR vIII, кариотипирование и фенотипическая характеристика полученных клеточных культур, что позволило выбрать наиболее подходящую клеточную линию для моделирования маркерных для астроцитом мутаций - IDH1 R132H и ТР53 R248Q. В ходе данного исследования проводили экспериментальное моделирование данных мутаций в первичной охарактеризованной клеточной линии мультиформной глиобластомы, которая, по сравнению со стандартными клеточными линиями, не подвергалась многолетнему культивированию. В прочих работах упоминается использование стандартных клеточных линий, таких как U87 и Т98G. Для моделирования влияния маркерных мутаций в генах IDH1 и ТР53 были созданы конструкции гайд-РНК для нового поколения кодон-оптимизированных цитидиновых дезаминаз способных распозновать неклассические РАМ-последовательности. Также были сконструированы и оптимизированы конструкции для внесения IDH1 R132H и ТР53 R248Q с помощью новейшей методики редактирования генома, использующей pegRNA с матрицей для редактирования и обратной транскриптазой для синтеза новой цепи на основе матрицы (prime editing). Оба описанных метода позволяют моделировать мутации без внесения двухцепочечных разрывов ДНК, что должно сильно увеличивать конечную эффективность подхода. Также для сравнения было принято решение провести внесение описанных мутаций с помощью классического CRISPR/Cas9 и лентивирусной гиперэкспрессии. На настоящий момент еще не установлены стабильные клеточные линии с мутациями, но эти результаты ожидаются в ближайшее время, поскольку вместе с попытками использования классической системы CRISPR/Cas9 разработаны конструкции для решения задач проекта на основе новейших технологий геномного редактирования. С помощью классического CRISPR/Cas9 была получена клеточная линия, несущая TP53 R248Q, однако она характеризуется сниженным делением и потерей изогенной морфологии. Остается неясным являются ли удлинение клеточного цикла и полиморфноклеточность следствием внесения точечной замены в ген ТР53 или это последствия нецелевой активности (off-target events) классического CRISPR/Cas9. Для диверсификации подходов по экспериментальному моделированию влияния мутантных IDH1 и TP53 были также получены лентивирусные конструкции, которые содержат варианты генов IDH1 R132H, TP53 R248Q, IDH1wt, TP53wt. В результате трансдукции полученной нами ранее первичной клеточной культуры G1 (IDH1wt, TP53wt) и последующих процедур клональной селекции, многие клетки приобрели распластанный фенотип и скорость их пролиферации чрезвычайно уменьшилась. Анализ кариотипа данных клеток показал высокий уровень хромосомной нестабильности культуры (количество хромосом в клетке варьировало от 40 до 140), что привело к необходимости повторного выбора культуры клеток глиом дикого типа, их характеризации и подбора протокола для эффективного культивирования. Из имеющегося набора полученных культур для продолжения работ на следующем этапе и проведения повторных экспериментов была выбрана Bt40 (IDH1wt, TP53wt) вместо изначально выбранной G1, для которой установлена наименьшая вариация числа хромосом (45-60) и определены оптимальные условия роста. Для того чтобы связать изменения, наблюдаемые в клетках глиом после редактирования генов IDH1 и ТР53 с конкретным влиянием мутаций, было принято решение вначале сравнить мутантные и немутантные опухоли пациентов. Для идентификации конкретного влияния выбранных мутаций на молекулярный профиль клеток глиом провели работы по изучению транскриптомики одиночных опухолевых стволовых клеток (single-cell RNA sequencing - scRNAseq). Примененный подход позволяет рассматривать молекулярные изменения не в общем пуле клеток, которые у глиом бывают очень гетерогенны, к тому же часто содержат иммунные клетки, а в субпопуляциях, идентифицированных на основе различий в экспрессии генов. Такой принцип позволяет провести параллель между конкретными субпопуляциями в мутантных и немутантных образцах, например, между опухолевыми стволовыми клетками, которые считаются ответственными за неминуемый рецидив глиобластомы. На данном этапе проекта с помощью указанного подхода были выявлены несколько субпопуляций опухолевых стволовых клеток глиом в составе IDH1- и ТР53-мутантных и немутантных образцов. Данное исследование было проведено в сотрудничестве с Лабораторией К. Ходосевича из Университета Копенгагена (BRIC, University of Copenhagen, Denmark). Таким образом, был проведен транскриптомный анализ отдельных клеток 6 образцов, включающих мутантные и немутантные глиомы, отсортированных по маркеру стволовых клеток Sox2. Мы сравнили Sox2+ клетки глиом мутантного и дикого типа по характерным особенностям выявленных клеточных субпопуляций, а также активированным молекулярным и биохимическим путям. IDH1 и ТР53 мутантные клетки глиом характеризовались низко пролиферирующим мезенхимальным фенотипом, синтезирующим компоненты внеклеточного матрикса и различные типы коллагенов, в то время как клетки глиом дикого типа имеют точки уязвимости в повышенном синтезе АТФ. Кроме того, анализ онтологии генов показал, что мутантные клетки глиом демонстрируют низкий уровень биосинтеза липидов, вероятно, связанный с высоким потреблением NADPH продуктом мутантного IDH1. Мы предложили биосинтез коллагена и липидов в качестве возможных путей-мишеней для противоопухолевого лечения глиом с точечными мутациями IDH1 R132H и TP53, в то время как клетки глиом дикого типа можно нейтрализовать разобщителями окислительного фосфорилирования, ингибирующими высокоэффективный синтез АТФ и позволяющий клеткам поддерживать высокую пролиферацию. Для формирования экспериментального задела по изучению профиля метаболитов в рамках работ на данном этапе были отработаны протоколы определения метаболомного и протеомного профиля глиом при помощи ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии. Данные, полученные методами транскриптомного анализа единичных клеток, были подтверждены исследованиями клеточных культур трех типов, как не несущих мутаций в IDH1 и TP53, так и cодержащих мутацию IDH1 R132H, а также комбинацию IDH1 R132H с мутацией в TP53. Для двухмутантных культур был продемонстрирован наиболее выраженный мезенхимальный фенотип с высокой долей CD44+ клеток, а также показана высокая миграционная способность. Полученные результаты позволяют сделать предварительный вывод о том, какие именно механизмы обеспечивают фенотипические различия, полиморфизм и резистентность различных субпопуляций клеток глиом. Выполненные на данном этапе исследования проектируют условия реализации следующих этапов проекта, а выявленные закономерности будут проверены с помощью мультипараметрического анализа клеток с экспериментально моделируемым генетическим статусом.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Глиома - наиболее распространенная первичная опухоль головного мозга, характеризующаяся диффузным инфильтративным ростом в окружающую ткань головного мозга. На долю глиом приходится около 75% всех злокачественных новообразований головного мозга. Глиома по-прежнему представляет собой наименее излечимое злокачественное новообразование, неэффективность лечения которого коренится, с одной стороны, в клеточной гетерогенности, а с другой - в клеточной пластичности, характерной для CD44 экспрессирующих клеток. Важность геномной гетерогенности также подчеркивается новой классификацией глиом, ориентированной на мутации в генах изоцитратдегидрогеназы типа 1 (IDH1) и опухолевого белка ТР53, применяемой Руководством Всемирной организации здравоохранения от 2016 г. Точечная мутация IDH1 R132H часто сочетается с миссенс мутацией ТР53, что является основанием для постановки диагноза астроцитома, при этом наличие ТР53 мутации приводит к существенному снижению общей выживаемости пациентов с глиомами. Мутация IDH1 изучена досконально, однако ее сочетание с ТР53 мутацией не изучено. Влияние одновременного наличия двух маркерных для астроцитом мутаций позволит нам предположить специфическую терапию для пациентов с глиомами, несущими мутации IDH1 R132H и одну из наиболее частых мутаций ТР53 R248Q. В нашей работе было произведено редактирование человеческих клеточных линий глиом с целью введения IDH1 R132H и ТР53 R248Q с использованием наиболее современных подходов к редактированию оснований - цитидиновых редактторов оснований (дезаминаз) и редактирования с помощью обратной транскриптазы (prime editing). Подход с редакторами оснований позволяет проводить однонуклеотидные замены без двуцепочечных разрывов, что существенно увеличивает эффективность проведения замены и снижает вероятность возникновения инсерций/делеций. Для введения однонуклеотидной замены 395G>A в гене IDH1, приводящей к вставке гистидина вместо аргинина R132H в активном центре фермента, была использована конструкция, экспрессирующая кодон-оптимизированную, филогенетически реконструированную цитидиновую дезаминазу APOBEC1, Cas9-никазу и два последовательных ингибитора урацил N-гликозилазы в составе ancВЕ4max. Для введения однонуклеотидной замены TP53 R248Q – замена аргинина на глютамин в положении 248 аминокислотной цепи, была использована дезаминаза, распознающая расширенное количество РАМ последовательностей – evoAPOBEC1-NG. Для редактирования нами была применена технология селекции по активной функции цитидиновой дезаминазы, которая позволила нам получить клоны клеток, содержащих IDH1 R132H, c эффективностью около 90% (только один клон из 11 исследованных содержал IDH1 дикого типа). При сравнении данной методики со стандартной селекцией по флуоресценции (дезаминаза-Р2А-GFP) можно заключить, что селекция по активности дезаминазы (TREE) позволяет с большей эффективностью получать клоны, содержащие мутацию в гомозиготном варианте (гомозиготные клоны встречаются примерно в 5 раз чаще при применении TREE, чем при селекции по стандартной флюоресценции). Проведения генного редактирования с использованием одной клеточной линии может быть недостаточно показательным, однако сочетание данных транскриптомики, протеомики, метаболомики, наномеханики и фенотипирования, полученных на данном этапе проекта для всех возможных вариаций IDH1 R132H и ТР53 R248Q мутаций, позволяет нам предположить пути применения таргетной терапии для персонификации лечения глиом на основе мутационного профиля пациента. Также, нами была проведена лентивирусная гиперэкпрессия мутантных IDH1 R132H и ТР53 R248Q белков для первичных клеточных линий глиом, что позволяет делать выводы о системных, не зависящих от метода и клеточной линии, эффектах изучаемых мутаций. Суммируя данные, мы можем заключить, что IDH1 R132H/wt приводит к снижению пролиферации и способности адгезировать к внеклеточному матриксу, но увеличивает экспрессию CD44. По данным транскриптомики и протеомики к слабым точкам IDH1 R132H/wt клеток относятся активация генов апоптоза и неспецифического воспаления. Клетки, несущие TP53 R248Q/wt, увеличивали экспрессию E-кадгерина и Sox2, активировали общий уровень трансляции и экспрессию генов клеточного цикла, одновременно снижая активность NAD(P)H-зависимых оксидоредуктаз цепи переноса электронов, тем самым имитируя эффект, наблюдаемый в IDH1 R132H клетках. Интересно, что обе мутации - IDH1 R132H и ТР53 R248Q - приводили к снижению функции NAD(P)H-зависимых оксидоредуктаз, пользуясь однако разными путями. То есть, IDH1 R132H ингибирует данные ферменты за счет окисления NADPH, а TP53 R248Q, скорее всего, вызывает эффект Варбурга, когда опухолевые клетки используют гликолиз для преимущественного получения АТФ. Из одновременных эффектов обеих изучаемых мутаций можно также привести увеличение экспрессии CD44, которое наблюдалось, как у клеток с двумутантным генотипом: IDH1 R132H/wt-TP53 R248Q/wt и IDH1 R132H/wt-TP53 R248Q/R248Q, так и у одномутантных клонов. Анализируя данные молекулярного профилирования для двумутантных клеток, мы можем выделить такие слабые точки, как катаболизм аминокислот, дефицит нутриентов и транспорт жирных кислот. Очевидно, что в клетках с генотипом IDH1 R132H/wt-TP53 R248Q/wt и IDH1 R132H/wt-TP53 R248Q/R248Q идет активация жирового и белкового обмена, что приводит к нехватке питательных веществ. Также пролиферация и выживаемость данных клеток зависит от уровня глюкозы и глутамина в культуральной среде, что опосредовано нарушенным обменом глутамата при введении IDH1 R132H мутации и переключением на неэффективный синтез АТФ с помощью гликолиза из-за суммарного ингибирующего эффекта обеих мутаций на NAD(P)H-зависимые оксидоредуктазы. Таким образом, индукционный эффект мутаций IDH1 R132H и ТР53 R248Q приводит к увеличению экспрессии CD44, снижению синтеза АТФ, нарушению метаболизма глутамата. Предполагаемыми подходами для терапии глиом, несущих мутации IDH1 R132H и ТР53 R248Q, могут стать антитела против CD44, а также метаболические подходы к регулированию уровня глутамата и глюкозы. Дополнительным шагом в послеоперационном ведении пациентов с глиомами может послужить назначение специальной диеты со сниженным уровнем веществ, необходимых глиомным клеткам для поддержания своего трансформированного метаболизма. С целью формирования экспериментального задела для работ 3 этапа проекта произведена идентификации, установлена первичная последовательность и предварительно продемонстрирован противоопухолевый потенциал нового белка MkC1qDC, выделенного из морского двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis, способного распознавать специфические паттерны гликозилирования на поверхности опухолевых клеток глиом и некоторых карцином. Предполагается дальнейшее изучение взаимодействия нового белка с клетками глиом различных фенотипов, созданных в рамках работ на первых этапах проекта. Полученные результаты, предварительно демонстрирующие специфическое распознавание клеток глиом молекулами нового белка, проектируют перспективы его биомедицинского применения для создания систем диагностики и таргетной противоопухолевой терапии.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения данной работы мы проанализировали данные протеомики, транскриптомики, метаболомики, фенотипирования, атомно-силовой микроскопии, а также исследовали функциональные характеристики разработанных клеточных моделей астроцитом, несущих маркерные миссенс мутации в генах IDH1 и ТР53. Многопараметрический анализ всех исследованных критерий вывел следующие точки нестабильности для наиболее значимых мутаций. Так, генотип IDH1 R132H/WT был ассоциирован с зависимостью от метаболизма глутамина (синтез глутаминсинтазы и мембранных транспортеров для глутамина), экспрессии KRT75, мягкостью и гладкостью мембраны, веретеновидной морфологией. Генотип TP53 R248Q/WT характеризовался высокой пролиферативной активностью, зависимостью от гликолиза, запасанием энергии в виде фосфокреатина, экспрессией CD44 и N-кадгерина, круглой морфологией. Генотип TP53 R248Q/R248Q был ассоциирован с секрецией, стрессом эндоплазматического ретикулума, экспрессией ТР53, зависимостью от гликолиза, напряжением системы глутатиона и активным синтезом фосфолипидов. Данные клетки имели округлую морфологию и характеризовались повышенной твердостью мембраны. Двумутантный генотип IDH1 R132H/WT и TP53 R248Q/R248Q ассоциировался с окислительным стрессом, нехваткой нутриентов, экспрессией ТР53, и общим увеличением метаболизма (аминокислот, ЦТК, накопление глутамина), экспрессией CD44. Данные клетки имели треугольную форму, а также повышенную твердость мембраны. Таким образом, для таргетинга клеток глиом, несущих мутацию IDH1 R132H/WT, мы предлагаем ингибировать метаболизм глутамина, в частности фермент глутаминсинтазу, переводящую глутамат в глутамин при опосредованной продукции NADPH. Это лишит глиомную клетку возможности накапливать глутамин для использования в качестве источника энергии (окислительной декарбоксилирование), а также снизит ее способность производить NADPH, необходимого для защиты от окислительного стресса. Данный подход уже разрабатывается для терапии других видов онкологических заболеваний [Wang et al., 2020. Frontiers in oncology, 10, 589508.]. Также глиомные клетки с генотипом IDH1 R132H/WT страдали от низкой продукции белков цитоскелета, однако это придавало им повышенную мягкость сопряженную со способностью мигрировать в мягкой ткани мозга. Мы предлагаем дисрегулировать процесс синтеза цитоскелета в объеме, который бы не затрагивал здоровые клетки, но позволял бы критично нарушать работу цитоскелета в клетках с низким синтезом белков цитоскелета. Подобные подходы уже существуют, хоть и в недостаточной разработке [Peterson et al., 2002. Chemistry & biology, 9(12), 1275-1285.]. Дополнительно, клетки, несущие IDH1 R132H/WT, синтезировали в высоком количестве кератин 75 (KRT75), который является ранним маркером IDH1-мутантных глиом [Mottaghitalab et al., 2021. Genomics, 113(4), 2623-2633., Grespi et al., 2022. Biomolecules, 12(4), 567.]. Хотя гиперэкпрессия кератинов обнаружена в карциномах, отсутствуют клинически одобренные терапевтические агенты против промежуточных филаментов [Zottel et al., 2021. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 160, 103283.]. Для таргетинга двумутантных клеток глиом с генотипом IDH1 R132H/WT и TP53 R248Q/R248Q могут быть применены ингибиторы ТР53, системы глутатиона, антитела против поверхностных молекул CD33 и CD44. Данные клетки активно регулируют иммунную систему через синтез ингибирующих или активирующих цитокинов, таким образом нарушая возможность иммунных клеток функционировать. Поэтому предполагается адекватным использование методов иммунотерапии, таких как CAR T-клетки против глиом. Данный вид терапии в настоящее время получило большую перспективу, так на данный момент в предклинических исследованиях тестируются CAR Т-клетки против EGFR/EGFRvIII, IL13Rα2, B7-H3, HER2 [Lin et al., 2022. Frontiers in Immunology, 13.]. Иммунотерапия имеет свои сложности при разработке против опухолей мозга, такие как гематоэнцефалический барьер и иммуносупрессивное микроокружение, однако данное направление является перспективным при преодолении иммунной дисрегуляции. Был проведен скрининг 113 экстрактов из биоты Дальнего Востока на цитостатическую и/или цитотоксическую активность. Из отобранных в ходе скрининга 20 перспективных экстрактов, показавших снижение метаболической активности клеток с различным генотипом, была получена панель экстрактов специфически влияющих на линии с мутациями IDH1 R132H/WT или TP53 R248Q/R248Q, а также на родительскую линию, несущую гены дикого типа. Выявлены перспективные экстракты, обладающие выраженной, в том числе избирательной активностью, против клеток глиом, несущих IDH1 R132H/WT и TP53 R248Q/R248Q. Для двух перспективных препаратов, проявляющих выраженный цитотоксический эффект в отношении клеток глиом с различными молекулярными профилями, успешно проведено фракционирование экстрактов методом хроматографии с установлением активных фракций, существенно подавляющих рост клеточных культур с генотипами IDH1 R132H/WT и TP53 R248Q/R248Q. Установлено, что новый углевод-связывающий белок, выделенный из морского двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis, способен специфически распознавать клетки глиом в культуре и очаги злокачественного роста на препаратах-среза опухолей. Показано, что он проявляет выраженный цитотоксический эффект, подавляя дозозависимым образом рост клеток глиом в культуре, вызывая клеточную смерть с преобладанием некротического механизма. Полученные результаты по изучению функциональной активности нового белка представляют интерес для создания диагностических панелей, идентифицирующих очаги злокачественного роста по аберантному гликозилированию клеточной поверхности и гиперпродукции углеводов внеклеточного матрикса с большой долей производных уроновых кислот. Из клеток глиомы U87MG выделен вероятный молекулярный партнер белка MkC1qDC. Таким образом, мы провели многопараметрический анализ данных траснкриптомики, протеомики, метаболомики, функционального исследования для изогенных клеточных моделей глиом человека, несущих маркерные для астроцитом мутации IDH1 R132H и ТР53 R248Q. Мы идентифицировали конкретные “точки хрупкости”, воздействие на которые должно привести к критическому нарушению равновесия в биологической системе клеток глиом, что может обеспечить создание эффективных подходов для персонифицированного лечения пациентов со злокачественными опухолями головного мозга. Разработанные клеточные модели глиом с различным молекулярным профилем также представляют интерес для поиска перспективных лекарственных кандидатов. Возможность проведения поиска на созданных экспериментальных моделях препаратов-кандидатов, подавляющих рост клеток глиом, продемонстрирована в ходе работ на данном этапе, а обнаруженные перспективные препараты представляют интерес для дальнейших разработок эффективных средств химиотерапии.