Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В течение первого года работы в рамках проекта мы провели анализ ранее опубликованных данных о структуре хроматина в различных типах опухолей, а также данных полногеномного секвенирования циркулирующей ДНК плазмы крови пациентов с онкологическими заболеваниями. Целью анализа был поиск кандидатных регионов генома, в которых степень фрагментированности внеклеточной ДНК может отличаться у здоровых людей и больных с различными опухолями. Мы идентифицировали 103 таких региона для трёх типов рака: колоректального рака (25 регионов), рака почки (50 регионов) и рака лёгкого (28 регионов). За отчётный период мы разработали и оптимизировали новый метод направленного анализа степени фрагментированности внеклеточной ДНК, основанный на высокопроизводительном секвенировании. Наш протокол подготовки библиотек для секвенирования позволяет одновременно анализировать фрагментированность ДНК во множестве регионов генома с высоким покрытием. Метод показал работоспособность на малых количествах ДНК (порядка 10 нг), что соответствует обычным количествам внеклеточной ДНК плазмы крови, доступной для анализа на практике. В дополнение к протоколу анализа мы разработали и реализовали на языке R алгоритм подбора регион-специфичных праймеров, автоматизирующий процесс их дизайна, а также алгоритмы обработки данных высокопроизводительного секвенирования, получаемых при применении нашего метода. Разработанная в результате система включает все необходимые составляющие для эффективного направленного анализа степени фрагментированности внеклеточной ДНК в выбранном наборе геномных регионов и будет использоваться для анализа клинических образцов сцДНК в ходе дальнейшей реализации проекта. Предлагаемый нами метод универсален и может в дальнейшем быть использован для направленного анализа особенностей структуры циркулирующей внеклеточной ДНК при различных заболеваниях. За отчётный период мы собрали 60% из планируемых клинических образцов крови (126 из 210), и выделили внеклеточную ДНК. Выборка включает 43 образца от пациентов с аденокарциномой толстой кишки, 45 образцов пациентов с раком почки, 12 образцов пациентов с аденокарциномой лёгкого и 26 образцов здоровых добровольцев. Коллекция образцов сбалансирована по возрастно-половому составу, описана с точки зрения клинических особенностей течения заболеваний и охарактеризована высокоточными методами анализа ДНК.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В течение второго года выполнения проекта был завершён сбор коллекции образцов свободно циркулирующей ДНК плазмы крови от больных онкологическими заболеваниями и здоровых добровольцев. Всего было собрано и охарактеризовано 299 образцов сцДНК, из них 108 от пациентов с колоректальным раком, 72 от пациентов с раком почки, 15 от пациентов с раком лёгкого и 104 от здоровых добровольцев. Коллекция описана с точки зрения клинических и полово-возрастных параметров, а также физико-химических характеристик образцов ДНК, что делает её полноценным источником материала для формирования экспериментальных выборок. В соответствии с планом на собранном материале был проведён ряд экспериментов по поиску дифференциально фрагментированных регионов в сцДНК в норме и при онкопатологии. Мы идентифицировали 3 таких региона для рака лёгкого и 10 регионов для колоректального рака в областях открытого хроматина, характерного для этих типов опухолей. Для реализации диагностического потенциала эпигенетических особенностей сцДНК мы разработали метод профилирования концов фрагментов сцДНК (cfDNA fragment end profiling, cfDNA-FEP) и продемонстрировали его эффективность для определения онкологических заболеваний на выборке из 175 человек. Метод основывается на оригинальном протоколе пробоподготовки и анализа результатов высокопроизводительного секвенирования с применением машинного обучения, которые в совокупности позволяют с высокой точностью детектировать небольшие изменения в особенностях фрагментирования сцДНК плазмы крови у больных с онкологическими заболеваниями (колоректальным раком и раком почки). При проведении анализа методом cfDNA-FEP каждому образцу присваивается вычисляемый балл патогенности, который изменяется в пределах от 0 до 1 и отражает вероятность того, что образец был получен от пациента с онкологическим заболеванием. Метод показал свою эффективность для определения наличия опухолей даже на ранних стадиях заболевания, медианный балл патогенности для таких образцов составил 0,83, в то время как для образцов от здоровых доноров 0,28. Площадь под ROC-кривой составила 0,94. Результаты опубликованы в журнале Molecular Cancer (ИФ = 27,4, Scopus Q1), а также доложены на крупных международных конференциях: Конгрессе европейского общества медицинской онкологии (ESMO Congress 2021) и 54-м съезде европейского общества генетики человека (ESHG Conference 2021), с публикациями в журналах Annals of Oncology (ИФ = 32,9, Scopus Q1) и European Journal of Human Genetics (ИФ = 4,2, Scopus Q1). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что направленный анализ особенностей фрагментирования сцДНК в определённых регионах генома может быть использован для малоинвазивной онкодиагностики.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Третий год работы был посвящён исследованию фрагментирования сцДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР и его модификации отличаются относительно низкой стоимостью и высокой скоростью проведения анализа. Кроме того, приборная база для проведения ПЦР широко распространена в молекулярно-биологических лабораториях. Опираясь на полученные нами ранее данные о распределении длин фрагментов сцДНК в опухоль-специфичных регионах открытого хроматина мы разработали системы, основанные на цифровой капельной ПЦР (ddPCR) для оценки степени фрагментированности сцДНК путём сравнения количества копий фрагментов двух длин (коротких <80 п.о., и длинных >150 п.о.) в трёх исследуемых локусах: двух регионах открытого хроматина в клетках колоректальной аденокарциномы (OCR1 и OCR2) и одного контрольного, со стабильным нуклеосомным позиционированием (CCR). В результате исследования группы пациентов с колоректальным раком (n = 53) и группы здоровых добровольцев (n = 32), мы обнаружили, что соотношение числа коротких и длинных копий на единицу массы сцДНК было выше во всех трех локусах у больных колоректальным раком, что свидетельствует о большем числе коротких фрагментов сцДНК у больных раком (p < 0,05). Так как разница наблюдалась во всех трёх исследуемых регионах, наши данные свидетельствуют о том, что ранее известный феномен укорочения сцДНК при раке не связан исключительно с изменением доступности хроматина в опухолевых клетках. Кроме того, дисперсия разниц в количестве копий коротких и длинных фрагментов была значимо ниже в контрольном регионе CCR по сравнению с регионами OCR1 и OCR2 (p < 0,005). Это может объясняться тем, что длины сцДНК менее стабильны в опухоль-специфичных регионах открытого хроматина по сравнению с областью стабильного нуклеосомного позиционирования. Полученные нами данные уточняют и дополняют предыдущие результаты, свидетельствующие о повышенной вариабельности длин сцДНК опухолевого происхождения на уровне всего генома. Другое применение оценки длин фрагментов сцДНК при помощи ПЦР заключается в анализе загрязнённости образцов сцДНК высокомолекулярной геномной ДНК. Так как распределение длин фрагментов сцДНК имеет пик в области 160-170 п.о., а высокомолекулярная геномная ДНК, попадающая на преаналитическом этапе в образец из разрушающихся клеток крови, обладает большей длиной, становится возможной разработка системы на основе ПЦР в реальном времени для оценки степени артефактной загрязнённости образца сцДНК геномной ДНК. Такое загрязнение может маскировать опухоль-специфичные изменения (например, мутации) в сцДНК и затруднять последующие этапы анализа. Скрининг на наличие геномной ДНК в образце сцДНК должен быть быстрым, недорогим и требовать для анализа небольшого количества материала. Благодаря использованию в качестве мишеней повторяющихся последовательностей генома, мы разработали и протестировали систему на основе ПЦР в реальном времени, которая требует всего 1 нг ДНК для проведения анализа. Система была проверена на выборке клинических образцов из собранной нами коллекции, а также в эксперименте, в ходе которого образцы сцДНК выделяли из крови в разных временных точках в процессе хранения. В обоих случаях параллельно проводился анализ распределения длин фрагментов ДНК в образцах альтернативным методом — автоматическим капиллярным электрофорезом на приборе Agilent Tape Station. Результаты, полученные обоими методами показали высокую степень корреляции. Разработанная система основана на оценке соотношения коротких (106 п.о.) и длинных (612 п.о.) ампликонов методом ПЦР в реальном времени, включает панель стандартных образцов с известными массовыми долями высокомолекулярной геномной ДНК (50%, 25%, 5% и 1%) и может быть использована для контроля качества образцов сцДНК в молекулярно-биологических лабораториях. Полученные результаты опубликованы в журнале Frontiers in Molecular Biosciences (Scopus Q1, ИФ 6,1) и доложены на конференциях OpenBio (Кольцово, Россия) и «Опухолевые маркеры: молекулярно-генетические и клинические аспекты» (Горно-Алтайск, Россия), а также на Конгрессе Молодых Учёных (Сириус, Россия).