Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проведено сравнение эффективности работы нескольких различных редакторов геномов, а также подходов внесения направленных мутаций путем гомологичной рекомбинации. Сделан вывод, что традиционный подход с использованием мРНК Cas9 и одноцепочечной олигонуклеотидной ДНК матрицы для гомологичной рекомбинации остается самым простым и достаточно эффективным способом внесения желаемых мутаций в геномную ДНК. На основе системы CRISPR/Cas9 успешно созданы генетические конструкции для инактивации генов FIX, NSUN7 и C12ORF65, с тем, чтобы с помощью инактивации выбранных генов создать модели гемофилии, мужского бесплодия и митохондриопатии. Подготовлен список генов, перспективных кандидатов в U6 мяРНК модифицирующие ферменты. Созданы линии клеток с инактивацией набора генов потенциальных РНК-метилтрансфераз. Создана и протестирована in vitro система из очищенных компонентов для изучения терминации митохондриальной трансляции. Существенно расширен инструментарий методов анализа событий альтернативного сплайсинга, включая также неаннотированные события. Разработанный метод был применен к анализу транскриптомов здоровых тканей человека из консорциума GTEx и части данных консорциума TCGA для количественной характеризации ткане- и опухолеспецифического сплайсинга. Данный результат был использован для получения списка генов с предсказанными дальними взаимодействиями во вторичной структуре пре-мРНК, предположительно влияющими на опухоле- и тканеспецифический сплайсинг. Несколько предсказанных событий альтернативного сплайсинга подтверждены экспериментально. В ходе поиска новых ингибиторов синтеза белка обнаружен антибиотик алтиомицин, для которого не известны молекулярные основы механизма действия. При помощи репортерной системы pDualrep2 показано, что малоизученное соединение макроцидин А нарушает синтез белка. Проведено исследование механизма действия и механизма возникновения устойчивости к новому антибиотику аурапланину. Оказалось, что данный антибиотик вызывает небольшие нарушения в точности трансляции, при этом механизм устойчивости связан с возникновением мутаций, некоторые из которых нарушают точность трансляции. При помощи метода криоэлектронной микроскопии обнаружен участок связывания аурапланина в 30S рибосомной субчастице. Оказалось, что участок связывания аурапланина отличается от мест связывания известных антибиотиков, а значит не будет обладать перекрестной устойчивостью с ними.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе работ прошедшего этапа с помощью направленного редактирования генома мышей были получены фаундеры мышиных моделей гемофилии, мужского бесплодия и митохондриопатий, содержащие нокауты генов FIX, C19ORF81 и C12ORF65 соответственно. Также, для исследования функциональной роли модификации РНК компонентов сплайсеосомы мы получили фаундеров линий мышей с инактивацией генов METTL4 и U6 мяРНК метилтрансферазы. Для поиска РНК субстрата РНК метилтрансферазы NSUN7, в соответствующий ген мышей внесли две модификации, а именно HA довесок на N-конец и Cys/Ala мутация в активный центр. Продуцируемых в полученной линии мышей мутантный вариант метилтрансферазы NSUN7 должен образовывать стабильные ковалентные соединения с РНК субстратом, которые можно выделить с помощью аффинной хроматографии и использовать для определения субстрата Определена метилтрансфераза, модифицирующая U6 мяРНК, и выявлен ее белок-партнер. Стабильных партнеров метилтрансферазы METTL4, модифицирующей U2 мяРНК, не обнаружено. Также обнаружено, что отсутствие метилирования U2 и U6 мяРНК влияет на экспрессию генов в клетке и альтернативный сплайсинг, например, происходит активация экспрессии генов интерферонового ответа и изменение соотношения изоформ альтернативного сплайсинга RPL22L1. Биоинформатический анализ данных консорциума GTEx выявил 590 тканеспецифических событий удержания интронов, для многих из которых предсказаны потенциальные регуляторы – РНК-связывающие белки. В частности, предсказана регуляция удержания интрона в гене BICD2, связанного со спинальной мышечной атрофией, фактором MBNL1. Изучены сигнатуры стволовости и пролиферации опухолей из консорциума TCGA и показано, что эти сигнатуры обладают значительной гетерогенностью, как на уровне тканей и опухолей, так и на уровне индивидуальных клеток. При помощи LNA-миксмеров скринированы десять генов человека с предполагаемыми РНК-структурами, влияющими на сплайсинг. Показано, что в гене BRD2, кодирующем транскрипционный фактор из семейства белков BET, разрушение РНК-структуры качественно влияет на включение экзона 2а. В гене TCF3, в котором ранее наблюдалось изменение сплайсинга в ответ на разрушение РНК-структуры LNA-миксмерами, при помощи мутагенеза в репортерном минигене подтверждено влияние РНК-структуры на альтернативный сплайсинг экзона 18а. Установлено, что кОРС DDX23 эффективно транслируется и подавляет трансляцию основной ОРС. Получены клеточные линии с мутацией в кОРС, которые можно использовать для выяснения ее функциональной роли. В ходе работы с ингибитором биосинтеза белка алтиомицином было показано, что он ингибирует трансляцию на этапе элонгации. Были отобраны устойчивые к алтиомицину клоны. Была получена структура комплекса алтиомицина с рибосомой. Для антибиотиков макроцидинов А и Z было показано, что рибосома не является их основной мишенью в клетке бактерий. При помощи репортерной системы pDualrep2 был обнаружен антибиотик боттромицин А2, для него ранее было показано, что он ингибирует синтез белка, однако детально этот процесс изучен не был. Для антибиотика аурапланина было показано, что он обладает антагонистическим действием по отношению к стрептомицину.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Получены мыши-гомозиготы с полной инактивацией генов METTL4 и THUMPD2, кодирующих метилтрансферазы, отвечающие за модификацию U2 и U6 мяРНК. Исследование фенотипа полученных мышей запланировано на следующий год. На модели нокаутных по METTL4 и THUMPD2 клеточных линий выявлено, что модификации в U2 и U6 мяРНК влияют на скорость сплайсинга в целом, но не влияют на выбор мест сплайсинга в зависимости от характеристик интронов и экзонов. Получены мыши-гомозиготы с полной инактивацией гена C19ORF81, кодирующего партнера метилтрансферазы NSUN7. Выявлены РНК семенников мышей, селективно пришивающиеся в NSUN7-HA при облучении УФ-светом. В то же время, выявлено, что предположительно каталитический остаток цистеина NSUN7 не является таковым. Выявлено, что инактивация гена C12ORF65, кодирующего один из неканонических факторов терминации митохондрий, приводиn к эмбриональной гибели на 17 день внутриутробного развития. С помощью блокирующих антисмысловых олигонуклеотидов и мутагенеза минигенов подтверждено влияние вторичной структуры РНК на альтернативный сплайсинг мРНК BRD2, а также подтверждена роль вторичной структуры РНК в регуляции альтернативного сплайсинга мРНК BRD3. Получен список 61 потенциальныого регулятора сплайсинга гена BRD2 в результате биоинформатического анализа базы данных мотивов POSTAR3 и анализа данных экспериментов по подавлению экспрессии РНК-связывающих белков. При помощи репортерной конструкции подтверждено, что кОРС DDX23 подавляет трансляцию нижележащей основной ОРС DDX23. Произведен отбор клеток, устойчивых к действию антибиотика алтиомицина. Обнаруженные мутации не позволяют сделать однозначный вывод о том, на какой этап трансляции влияет алтиомицин. Определены мотивы в последовательности мРНК, на которых происходит наиболее выраженная остановка трансляции в присутствии алтиомицина. Боттромицин А2 и его гидролизованный аналог оказывают ингибирующее действие на процесс биосинтеза белка в клетках E. coli. Подтверждено, что боттромицин А2 ингибирует биосинтез белка в клетках бактерий, останавливая трансляцию на стадии элонгации. В ходе скрининга антимикробного действия 122 штаммов грибов, выделенных из почв заповедника Бузямап (Вьетнам), было обнаружено 36 ингибирующих рост бактерий.