Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном периоде исследования проводились по трем основным направлениям: создание и анализ in vivo моделей наследственных заболеваний, сопровождающихся нарушением интеллектуального развития; создание и анализ in vitro моделей; разработка новых технологий диагностики. Кроме того, на протяжении всего периода проводился рекрутинг пациентов с недифференцированными формами умственной отсталости с целью поиска новых генных и хромосомных вариантов для моделирования. Блок 1. Создание и анализ in vivo моделей. Для создания in vivo (на мышах) модели синдрома Насименто (OMIM 300860) были разработаны генетические конструкции для гиперэкспрессии, нокаута и нокдауна гена Ube2a. Эффективность гиперэкспрессии и нокаута гена Ube2a была подтверждена тестированием в клетках нейробластомы мыши N2A с последующей детекцией с помощью Вестерн-блот анализа. Анализ экспрессии мРНК гена Ube2a на разных эмбриональных стадиях был проведен с помощью in situ гибридизации, продемонстрировавшей, что мРНК Ube2a детектируется в нейрональных предшественниках на стадиях Е12.5, Е14.5 и Е15.5. На стадиях Е16.5 и Е18.5 экспрессия Ube2a также детектируется в кортикальной пластине. Далее ген Ube2a был инактивирован в коре головного мозга эмбрионов мыши с помощью in utero электропорации генетических конструкций в латеральные желудочки мозга эмбрионов. В результате была обнаружена задержка миграции кортикальных нейронов при снижении экспрессии гена Ube2a по сравнению с контролем. Для моделирования эффектов эпигенетического сайленсинга хромосомных аберраций у носителей малых сверхчисленных маркерных хромосом (sSMC) начато создание экспериментальных линий мышей с делециями в прицентромерном и прителомерном районах хромосом с помощью CRISPR/Cas9 редактирования генома. Внесение хромосомных перестроек производится путем микроинъекций компонентов системы CRISPR/Cas9 в цитоплазму зигот мышей. В настоящее время получено 384 зиготы от 35 самок мышей линии C57BL, в 167 зигот провели инъекции генетических конструкций с компонентами системы CRISPR/Cas9. Из них 119 зигот были трансплантированы, однако из 86 подсаженных зигот, срок внутриутробного развития которых завершился, получено только 8 мышат, еще для 33 зигот результаты пока ожидаются. Блок 2. Создание и анализ in vitro моделей. Мы изучили случай носительства малой сверхчисленной маркерной хромосомы (sSMC), обнаруженной в ходе пренатальной диагностики у плода. Происхождение и структура маркерной хромосомы были установлены с помощью: стандартного цитогенетического анализа, aCGH на SNP-микрочипах, количественной ПЦР в режиме реального времени, FISH-анализа с центромеро-специфичными, теломеро-специфичными и локус-специфичными ДНК-зондами; хромосомной микродиссекции с обратной in situ гибридизацией; полногеномной амплификации и секвенирования микродиссекционной ДНК-библиотеки. Было установлено, что sSMC является кольцевой производной хромосомы 10 и включает регион короткого плеча 10p11.21-p11.1 и длинного плеча 10q11.21-q11.23 размером 1,243 и 7,173 Mb, соответственно. Присутствие в кариотипе дополнительного хромосомного материала протяженностью около 9 Mb, содержащего 107 генов, в том числе 7 генов, индексированных в OMIM, не привело к каким-либо клиническим проявлениям на момент рождения ребенка, и позволило сформулировать гипотезу о наличии механизмов эпигенетического сайленсинга генов, локализованных в прицентромерном регионе маркерной хромосомы (Lebedev et al., 2021; PMID 34440234). Так как данная семья отказалась от дальнейшего сотрудничества, in vitro моделирование эффектов эпигенетического и транскрипционного сайленсинга генов в прицентромерных регионах хромосом стало проводится на основе клеточных линий от другого бессимптомного носителя sSMC – деривата хромосомы 4. Мы установили линию фибробластов пациента (TAF16), из которой получили 12 линий ИПСК. Стандартный цитогенетический анализ показал, что sSMC сохраняется в 72% ИПС клеток. Происхождение sSMC было подтверждено при помощи FISH с прицентромерными зондами, продемонстрировавшими, что sSMC является дериватом хромосомы 4, и FISH с теломероспецифичным зондом, свидетельствующим о ее кольцевой форме в ИПСК. Мы получили линии кортикальных нейронов из ИПСК пациента с микродупликацией гена CNTN6, со скорректированным генотипом и контрольных линий путем направленной дифференцировки за счет сверхэкспрессии гена NGN2. Для установления причин вариабельности проявления микродупликаций в локусе 3p26.3 мы оценили распределение эпигенетических маркеров, локализованных вблизи гена CNTN6. ChIP-seq анализ показал, что для пациент-специфических ИПСК с дупликацией характерна гетерохроматинизация данного региона, распространяющаяся и за его пределы на область до 7 Mb. Гетерохроматинизация дуплицированного региона в ИПСК свидетельствует о снижении экспрессии гена CNTN6 и/или генов длинных некодирующих РНК, лежащих в данном локусе, что согласуется с данными о дисбалансе в аллельной экспрессии CNTN6 у пациента с дупликацией, и свидетельствуют в пользу гипотезы о влиянии эпигенетического статуса дуплицированного района на фенотипические проявления изменений копийности. Для изучения роли гена UBE2A в нейрогенезе человека мы создаем клеточную модель на основе ИПСК, в которую будут входить ИПСК от пациентов с аномалиями нейрогенеза, задержкой интеллектуального развития и перестройками в сегменте Xq24 (микроделецией и микродупликацией), ИПСК от их здоровых матерей – носительниц аналогичных перестроек, ИПСК с нокаутом и с гиперэкспрессией гена UBE2A и контрольные ИПСК. К настоящему времени получено по 10 линий ИПСК от двух бессимптомных носителей перестроек и пациента с микроделецией Xq24 (всего 30 линий с перестройками, затрагивающими локус гена UBE2A). Начата работа по созданию линий клеток с нокаутом и с повышенной экспрессией гена UBE2A путем редактирования генома ИПСК. Для нокаута гена UBE2A было использовано CRISPR-Cas9 геномное редактирование ИПСК здорового донора FD5S с кариотипом 46,XX, результаты которого оценивали секвенированием по Сэнгеру. 18 клонов (44%) несли в гене UBE2A нокаутирующий индел в гомозиготном состоянии, 7 клонов (18%) были компаунд-гетерозиготами по нокаутирующим инделам, один клон был гетерозиготой по нокаутирующей однонуклеотидной инсерции. Интересно, что пролиферативная активность нокаутных по гену UBE2A клонов оказалась выше, чем исходной линии. Поиск дифференциально-экспрессирующихся генов (ДЭГ) проводили для нейронов, полученных из ИПСК пациентов с микроделецией и микродупликацией гена CNTN6, и здоровых индивидов. Для нейронов с разным числом копий CNTN6 было показано преимущественно снижение экспрессии ДЭГ по сравнению с контролем. Мы выделили 4 категории транскрипционных эффектов реципрокных CNV, затрагивающих данный ген: 1) однонаправленное увеличение экспрессии (25 ДЭГ); 2) однонаправленное снижение экспрессии (402 ДЭГ); 3) снижение экспрессии генов при дупликации и повышение экспрессии данных генов при делеции CNTN6 (51 ДЭГ); 4) повышение экспрессии генов при дупликации и снижение экспрессии данных генов при делеции CNTN6 (51 ДЭГ). Продукты общих ДЭГ в нейронах с микроделецией и микродупликацией CNTN6 участвуют в синаптической передаче сигнала и нейрогенезе. Блок 3. Разработка технологий диагностики. Сформирована выборка семей для идентификации новых, неописанных мутаций, приводящих к порокам развития головного мозга и нарушениям интеллектуального развития. Предварительно у пациентов были исключены числовые и крупные структурные хромосомные аномалии, наследственные нарушения обмена и известные моногенные наследственные синдромы. Проведено полноэкзомное секвенирование в 4 семьях с семейными формами умственной отсталости. У пациента М. (7 лет, синдром Денди-Уокера, агенезия мозолистого тела, гипогенезия моста, пахигирия лобных долей, эпилептическая энцефалопатия) выявлена de novo миссенс-мутация в гетерозиготном состоянии на хромосоме 1 в гене MACF1, затрагивающая консервативную аминокислоту. Клиническая значимость варианта на настоящий момент неизвестна, в литературе по данным на декабрь 2021 г. он описан не был. Результаты in silico алгоритмов предсказывают патогенное влияние данной замены на структуру белка. Хромосомный микроматричный анализ 25 парных образцов плацентарных тканей (хорион и экстраэмбриональная мезодерма, являющихся производными разных зародышевых листков) от спонтанных абортусов с нормальным кариотипом проведен для выявления CNV, обладающих плейотропным эффектом во внутриутробном и постнатальном периоде развития. CNV проанализированы по типу, генному составу, клинической значимости и происхождению, выявлены микроперестройки, общие для погибших эмбрионов и пациентов с задержкой интеллектуального развития. Интересно, что помимо CNV, выявленных в двух типах плацентарных тканей и, следовательно, имеющих мейотическое происхождение, мы обнаружили большое число мозаичных CNV митотического происхождения. Начато исследование физико-химических характеристик фракций внеклеточной ДНК плода, связанной с клеточной поверхностью и циркулирующей в крови матери, в том числе женщин, вынашивающих плод с хромосомной анеуплоидией. Получена и фракционирована кровь от 21 беременной женщины, определена концентрация и распределение длин фрагментов вкДНК. Для семей, в которых один из супругов является носителем патогенной CNV, ведется разработка нового подхода к выявлению хромосомных микроделеций/микродупликаций в ходе преимплантационного генетического тестирования (ПГТ). Сущность подхода заключается в комбинации принципов ПГТ на моногенные наследственные заболевания (ПГТ-М) с анализом гаплотипов, маркирующих хромосому с CNV, и ПГТ на анеуплоидии (ПГТ-А) с целью исключения переноса эмбриона с нарушением числа хромосом. Необходимость комбинационного подхода обусловлена недостаточными разрешающими возможностями современных методов aCGH и NGS в детекции хромосомных микроперестроек после полногеномной амплификации единичных клеток в биоптате трофэктодермы. Разработанная тест-система для преимплантационной генетической диагностики микроделеционных синдромов позволила в семье с delXq24 выбрать для переноса эмбрион со сбалансированным кариотипом, однако беременность у женщины не наступила. В семье с del1q41 оба полученных эмбриона имели дополнительные анеуплоидии и не были рекомендованы к переносу. Сформирована референсная выборка из 22 пациентов с известными микроделеционными/ микродупликационными синдромами, сочетающимися с нарушениями психомоторного развития. Проведена клиническая характеристика пациентов и молекулярно-цитогенетический анализ с помощью aCGH, верифицированный методом ПЦР в реальном времени. Для каждого пациента охарактеризованы размер и границы микроперестройки, ее генный состав с выделением генов, вероятно связанных с развитием симптомов заболевания. Проводится отработка технологии одновременного анализа 3D-организации хроматина и секвенирования его последовательности (Exo-C), позволяющая с высокой точностью выявлять сбалансированные хромосомные перестройки. С этой целью была сформирована выборка пациентов, включающая 11 индивидов с инверсиями и сбалансированными транслокациями и 2 индивидов с несбалансированными перестройками. Впервые методом Exo-C были проанализированы геномы пациентов с инверсиями. Было показано характерное изменение паттерна трехмерных контактов, свидетельствующее о наличии крупных инверсий. Визуальный анализ полученных Exo-C-карт позволил подтвердить наличие инверсий и установить координаты их границ с точностью до 50 тысяч п.о. для образцов гетерозиготных инверсий, что говорит о чувствительности метода, достаточной для выявления хромосомной перестройки даже на фоне контактов нормального локуса. Выявленные паттерны будут использованы для разработки автоматического алгоритма поиска сбалансированных хромосомных перестроек на основе Exo-C-данных.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В настоящем проекте проводится изучение эффектов мутаций нескольких генов, важных для формирования мозга, на мышиных моделях. Получены трансгенные мыши с инактивацией гена Ube2a, а также мыши с гиперэкспрессией Ube2a. Показано, что гиперэкспрессия приводит к задержке нейрональной дифференцировки, в то время как инактивация вызывает ранний выход из митотического цикла. В экспериментах по моделированию дефицита гена Ube3C получена инактивирующая генетическая конструкция, трансфецированная в ESC мыши линии C57Bl6. ESC были инъецированы в мышиные бластоцисты линии CD1 и получены химерные животные. Полученное от них потомство черного цвета является показателем успешного переноса инактивирующей мутации в половые клетки. Для изучения роли гена Ire1a в дифференцировке нейронов коры головного мозга создана линия мышей с нокаутом данного гена. Обнаружено, что инактивация Ire1a приводит к увеличению количества нейронов нижних слоев и уменьшению в верхних слоях, а при гиперэкспрессии Ire1a выявлен противоположный фенотип. Показано, что потеря Ire1α вызывает снижение скорости синтеза белка и приводит к остановке рибосом на РНК. Исследована роль мультиадапторного белка Noma-GAP в аксональном транспорте везикул. Показано, что Rab11 необходим для направленного дендритами везикулярного транспорта постсинаптических белков и для созревания дендритов. Везикулы, содержащие Rab11, накапливаются в соме NOMA-GAP-дефицитных нейронов. Потеря NOMA-GAP связана с более быстрым ретроградным движением везикул. Для изучения роли NeuroD1/2/6 в регулировании клеточной смерти в нейронах коры головного мозга использовался тройной нокаут NeuroD1/2/6 генов. Мы изучили активность каспазы 3 в процессе развития коры. Количество апоптотических клеток было увеличено в разной степени на всех исследованных стадиях. Продолжено создание экспериментальных линий мышей с перестройками на хромосомах 1 и 12 для изучения и моделирования эффектов эпигенетического сайленсинга хромосомных аберраций. Получение адресных хромосомных перестроек проводилось путем микроинъекций компонентов CRISPR/Сas9 в зиготы мышей. В экспериментах с использованием мРНК Cas9 и sgRNA к хромосоме 12 зафиксирована низкая рождаемость мышей - 10 мышей из 317 перенесенных зигот, что свидетельствует о токсичности компонентов CRISPR/Сas9 для зигот и эмбрионов ранних стадий развития. Анализ пробных экспериментов по созданию хромосомных перестроек на бластоцистах и ранних эмбрионах мыши показывает наличие целевых перестроек в хромосоме 12. После рождения аналогичным образом будут проанализированы мыши. Анализ мышей, родившихся в эксперименте по хромосоме 1, не обнаружил у них делеций и дупликаций, однако выявил одно животное с инверсией. Hi-C анализ линии фибробластов бессимптомного носителя sSMC(4) подтвердил кольцевую форму маркерной хромосомы, точно установил ее размеры и содержание 166 генов, что делает удивительным отсутствие клинических проявлений у ее носителя. Бисульфитное секвенирование ДНК выделило участок хромосомы 4 с резким повышением покрытия, координаты которого соответствуют sSMC. CpG островки были деметелированы как в клетках с sSMC, так и в контрольных линиях. Это позволило заключить, что в ИПСК, содержащих sSMC, уровень метилирования данного района незначительно отличается от изогенных линий ИПСК без sSMC, что отставляет открытым вопрос о механизмах дозовой компенсации при наличии в кариотипе дополнительного хромосомного материала. Завершены эксперименты по направленной дифференцировке ИПСК линий c дупликацией гена CNTN6 в кортикальные нейроны для оценки уровней экспрессии и эпигенетического статуса генов, локализованных вблизи хромосомных перестроек в локусе 3p26.3. Проведен Chip-seq анализ c использованием антител к гистону H3K9me3. Получены результаты секвенирования большей части библиотек, идет анализ данных. По две линии ИПСК от пациента и здорового носителя дупликации гена CNTN6 были дифференцированы в эмбриоидные тельца с дальнейшим анализом RNA-seq. Между всеми образцами пациента и здорового носителя дупликации было найдено 4645 дифференциально экспрессированных гена (ДЭГ). Проведен анализ обогащения. Создана клеточная модель для изучения роли гена UBE2A в развитии синдрома Насименто, куда входят изогенные ИПСК с нормальной экспрессией, с отсутствием экспрессии и с гиперэкспрессией гена UBE2A, а также ИПСК пациента. Во всех нокаутных клонах наблюдается достоверное снижение экспрессии гена UBE2A и отсутствие белка UBE2A. При помощи лентивирусной трансфекции получены клоны с индуцибельной гиперкспрессией гена UBE2A, подтвержденной при помощи количественной ОТ-ПЦР. Начата функциональная характеристика гена UBE2A. Мы показали, что ИПСК с нокаутом гена UBE2A и полученные из них фибробласт-подобные клетки быстрее прикрепляются к поверхности после пересева клеток. Более быстрая адгезия сопровождается повышенным числом фокальных контактов на единицу площади. При этом нокаут гена UBE2A не сказывается на скорости пролиферации ИПСК и нейрональных предшественников, и на скорости роста мозговых органоидов. Отмечено, что нокаутные ИПСК и ИПСК с гиперэкспрессией гена UBE2A отличаются по морфологии ядра и демонстрируют достоверное повышение размера ядра по сравнению с исходными клетками. Увеличение размера ядра не связано с изменениями в ядерной ламине, в распределении конститутивного гетерохроматина внутри ядра или различиями в распределении клеток по клеточному циклу. Эксперимент по оценке роли гена UBE2A в репарации радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК не обнаружил статистически значимой разницы между ИПСК с нокаутом гена UBE2A и ИПСК дикого типа. Клинически и генетически обследованы 110 пациентов с нарушениями развития нервной системы. Микроматричный анализ проведен для 83 пациентов. Патогенные/потенциально патогенные CNV были обнаружены у 37% пробандов, все перестройки полностью охарактеризованы. Полноэкзомное секвенирование проведено для 52 индивидов из 17 семей, у 15 пробандов обнаружены клинически значимые варианты. Выявленные значимые для формирования мозга варианты являются кандидатами на изучение на клеточных и животных моделях. Суммарно 13 пар ДНК плацентарных тканей абортусов (хорион и экстраэмбриональная мезодерма) и их родителей проанализировано на SNP-микрочипах. Обнаружено 130 CNV, все они полностью охарактеризованы. Выявлено 163 общих CNV для эмбриональной гибели и нарушений интеллектуального развития. Получено 15 первичных клеточных линий экстраэмбриональных фибробластов человека от погибших эмбрионов с нормальным кариотипом, линии криоконсервированы. Проведена отработка модификаций НИПТ для скрининга микроструктурных хромосомных нарушений на модельной системе - ДНК пациентов с микроструктурными перестройками и их матерей. Использовали две относительные концентрации образцов – 10% и 30%, для которых выявлено 22% и 50% перестроек соответственно. Концентрация плодной ДНК оказывает значительное влияние на возможность детекции CNV с помощью NGS. Для 9 пациентов с нарушениями интеллектуального развития и хромосомными перестройками был проведен Exo-C анализ. Сравнена эффективность различных биоинформационных инструментов для моделирования 3D-контактов хроматина. Разработана платформа 3DGenBench для предсказания изменений 3D архитектуры генома, вызванных хромосомными перестройками.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Исследована роль гена Ire1α в регуляции трансляции Satb2 и Ctip2. Показано, что уровень экспрессии Ctip2 не зависит от присутствия Ire1α. В то же время установлена прямая зависимость эффективности трансляции Satb2 от присутствия Ire1α. Масс-спектрометрический анализ выявил около 30 белков, уровень экспрессии которых отличался в коре головного мозга у Ire1α-мутантных мышей, по сравнению с диким типом. В частности, были снижены уровни экспрессии eEF-2 и eIF4A1. Сверхэкспрессия eEF-2 с помощью in utero электропорации (IUE) в эмбрионах дикого типа не привела к изменению доли Satb2 в клетках - потомках нейронов, однако была связана с дефектом позиционирования нейронов верхнего слоя, аналогичным тому, который наблюдается при потере Ire1α. Инактивация eIF4A1 привела к формированию фенотипа, аналогичному у нокаутов по Ire1α в отношении типов генерируемых нейронов. Таким образом, именно eIF4A1 является мишенью Ire1α, которая отвечает за уменьшение уровня Satb2 в мозге мышей, мутантных по Ire1α. Изучена пролиферация и судьба нейрональных стволовых клеток после выхода из митотического цикла у мышей с мутациями в гене Ube3C с помощью мечения BrdU. Оказалось, что клетки, мутантные по Ube3C, быстрее дифференцируются в нейроны, чем клетки дикого типа, а инактивация Ube3C приводит к нарушению нейрогенеза и ускоренной дифференцировке нейронов. Мы проверили эту гипотезу в экспериментах по сверхэкспрессии Ube3C в коре головного мозга эмбрионов и установили, что повышенная экспрессия Ube3C в клетках-предшественниках приводит к повышенной продукции астроцитов, в то время как в контроле появлялись только нейроны. Анализ протеома нейронов с мутацией Ube3С и дикого типа обнаружил, что максимальную разницу в экспрессии продемонстрировал белок Hakai, что также было подтверждено с помощью Western блот. Таким образом, установлено, что Ube3С контролирует нейрогенез коры головного мозга. Для изучения роли точковой мутации de novo в гене SEMA4D были синтезированы кДНК конструкты, содержащие как человеческий Sema4D дикого типа, так и мутантный Sema4D. В экспериментах in vivo было показано, что сверхэкспрессия мутантного Sema4D в коре эмбрионального головного мозга приводит к нарушениям миграции нейронов, а также к нарушению роста аксонов мозолистого тела. Изучены эффекты мутации в двух изоформах гена HP1 (HP1beta и HP1gamma) на развитие цитоархитектуры коры головного мозга и гиппокампа у мышей. Оказалось, что пролиферация нейрональных стволовых клеток в гиппокампе двойного мутанта HP1beta/HP1 gamma снижена по сравнению с диким типом. Также у мутантов нейроны в CA3 области гиппокампа имеют менее сложные базальные дендриты, чем у животных дикого типа. Измерение общего объема мозга показало, что молодые животные-мутанты имеют умеренно уменьшенный объем как коры, так и всего мозга. У животных HP1β/γ DKO наблюдались нарушения пространственного обучения и памяти. В экспериментах по микроинъекциям компонентов системы CRISPR/Cas9 в зиготы мыши с последующей трансплантацией 406 эмбрионов суррогатным матерям, были получены животные с делецией 950 т.п.о. в прицентромерном районе хромосомы 1. Из 46 потомков F0 генотипирование выявило 9 животных с перестройками хромосомы 1: 2 с делециями, 4 с инверсиями, 1 с дупликацией и 2 с сочетанием делеция+инверсия, подтвержденных секвенированием по Сэнгеру. Все основатели F0 были фертильны. Далее были получены потомки первого поколения (F1) от скрещивания F0 с мышами C57/Bl, и проведено скрещивание гетерозиготных особей в F2 и F3. Генотипирование идентифицировало гомозиготных носителей перестроек в потомстве от семи основателей F0. Избыток гетерозигот и заметный дефицит гомозигот по делециям позволяет предположить повышенную смертность гомозиготных мышей в эмбриональном периоде. Аналогичные эксперименты по микроинъекции компонентов CRISPR/Cas9 в зиготы были проведены для получения мышей с другой целевой перестройкой - делецией 750 т.п.о. в прителомерном районе длинного плеча хромосомы 12. Было инъецировано более 600 зигот, из которых 90% выжили. Однако трансплантация более 500 эмбрионов суррогатным матерям не привела к рождению потомков F0. Дополнительное in vitro исследование подтвердило отсутствие токсичных факторов в инъекционной смеси. Полученные эмбрионы имели тенденцию к снижению числа клеток трофобласта и значительно сниженное число клеток внутренней клеточной массы. Мы предположили, что сниженная выживаемость может быть следствием хромотрипсиса и возможной элиминации хромосомы 12 после редактирования генома зиготы. Завершено создание модельной клеточной системы для изучения функций гена UBE2A. Показано, что в глиальных клетках, дифференцированных из ИПСК с аномалиями дозы гена UBE2A вследствие делеции, нокаута или индуцибельной гиперэкспрессии, наблюдается достоверное увеличение клеточного ядра, сопровождающееся увеличением количества основного белка ядерной ламины – ламина В1. Таким образом, в дифференцированных клетках сохраняется аномальное увеличение размеров ядра, выявленное ранее в ИПСК. Показано, что делеция и нокаут UBE2A приводят к достоверному повышению скорости миграции глиальных клеток. Проанализирован транскриптом и протеом нейрональных предшественников, полученных из ИПСК изогенной системы и ИПСК пациента. В предшественниках, дифференцированных из ИПСК пациента, выявлены нарушения экспрессии генов, связанных с развитием аксонов, дендритов и с регуляцией синапсов. Также оказалась сниженной экспрессия генов, отвечающих за связывание тяжелой цепи миозина, что подтверждает наши наблюдения о нарушении миграции клеток при отсутствии белка UBE2A. Анализ протеома продемонстрировал парадоксальную особенность регуляции UBE2A, которая делает нейрональные предшественники, радикально отличающиеся по дозе гена UBE2A, похожими друг на друга. Для 159 пациентов с нарушениями интеллектуального развития проведен микроматричный анализ, у 37% пациентов были идентифицированы патогенные и вероятно патогенные CNV. В 7 семьях с семейными формами умственной отсталости проведено полноэкзомное секвенирование, патогенных вариантов не выявлено. Ранее выявленные патогенные и вероятно патогенные варианты подтверждены секвенированием по Сэнгеру: в 6 семьях варианты оказались de novo, а в 2 семьях были унаследованы от матерей и локализованы на Х-хромосоме. Разработаны и опубликованы Рекомендации Российского общества медицинских генетиков по хромосомному микроматричному анализу. Уточнена структура хромосомного дисбаланса у спонтанных абортусов. У 21 эмбриона обнаружено 204 CNV. Интересно, что 28% CNV выявлены только в цитотрофобласте хориона (ЦХ), а 25% - в экстраэмбриональной мезодерме (ЭМ), включая унаследованные варианты. Кроме того, впервые зарегистрированы и тканеспецифичные мозаичные регионы гомозиготности (ROH), также ограниченные либо ЦХ, либо ЭМ (по 18%). Вероятным механизмом возникновения тканеспецифичных ROH и CNV может быть коррекция мейотической трисомии с восстановлением нормального хромосомного набора, но с потерей различных гомологов в линиях зародышевого и внезародышевого происхождения. Это означает, что от 36 до 53% спонтанных абортусов с нормальным кариотипом несут молекулярные маркеры процесса самокоррекции аномального кариотипа в ходе развития. Анализ структуры хромосомного дисбаланса у 94 абортусов с предварительно установленным нормальным кариотипом с применением технологий молекулярного кариотипирования и гаплотипирования обнаружил хромосомные аномалии у 35% абортусов. Впервые установлено, что ранняя остановка развития сопровождается аккумуляцией мозаичных хромосомных аномалий в производных внутренней клеточной массы, по сравнению с клетками плаценты. С помощью полногеномного секвенирования длинными ридами Oxford Nanopore (WGS) и таргетного секвенирования методами nCATS и адаптивного отбора (AS) проведено уточнение границ хромосомных перестроек, обнаруженных методом Exo-C. Разработан алгоритм поиска инверсий, который предоставляет возможность автоматизировать поиск хромосомных перестроек на Hi-C картах с экзомным обогащением.